定量检测HPV16/18型感染的荧光PCR试剂盒 【技术领域】
本发明属于体外核酸检测领域，尤其涉及一种在临床样本中同时定量检测高危16和(或者)18型HPV(人乳头瘤病毒)感染的荧光PCR(聚合酶链式反应)试剂盒。
背景技术
宫颈病变是女性最常见的疾患之一，其最严重的发展结局是宫颈癌。现认为官颈癌是全球性公共卫生问题。中国每年的新发病例超过13万，占世界发病的28％，且近年来在广大农村地区有增高趋势，并呈现发病年龄提前的现象。在全球致力于宫颈癌研究的学者们的共同努力下，WHO于1996年宣布，HPV持续感染是宫颈癌的直接病因。
人类乳头瘤状病毒(Human Papilomaviruses，HPV)是一类具有严格宿主范围和组织特异性的DNA病毒，感染人的皮肤和粘膜上皮细胞，寄生在磷状和柱状上皮层，可通过直接或者间接接触污染物品或性途径传播，引起感染部位的良性和恶性病变。HPV是一类在自然界广泛传播的病毒，人类感染HPV十分普遍，多数人往往同时感染多型病毒。HPV目前确定的型别有100多种，大约有35种与生殖道感染有关，其中约20种与肿瘤有关。依据不同型别HPV与癌发生的危险性高低分为低危型HPV如HPV6、11、42、43、44等，常引起良性病变，高危型HPV如HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68，与宫颈癌及宫颈上皮内高度瘤变(CIN2/3)的发生相关。
据统计，在全世界范围内，每年有27万女性死于宫颈癌。研究表明，HPV是引发宫颈癌的元凶，其中HPV16/18型是引发妇女子宫肿瘤的最主要的类别——至少引发全世界70％以上的宫颈癌病例。HPV是威胁女性健康乃至生命的“隐形杀手”。在我国，85％的宫颈癌由HPV16/18型引发，这一数据明显高于全球平均水平。自从1977年Lavedy观察到宫颈活检组织中存在HPV后，随着现代科研水平的不断提高我们不仅从宫颈组织中分离到了HPV，而且还对其进行了分型。2002年Clifford等对2000年2月前的85项涉及全球范围的10058例官颈癌患者的研究进行Meta分析，发现HPV16为宫颈癌患者中最常见亚型，感染率为51％；HPV18型位居其次，占16.2％。在国际癌症研究协会(IARC)最新报道的包括全球25个国家的3607例宫颈癌患者的多中心研究中显示，HPV16在所有HPV阳性的宫颈癌患者中的平均感染率为57.4％。
HPV感染高峰年龄在18～28岁。HPV检出期较短，约2～3年。HPV感染期也短，常在8～10个月可消失。持续、反复发生的HPV感染与子宫颈癌关系密切，但通常无明显临床症状，不易引起人们的重视，只有通过人群筛查才能对感染者进行监测。现有对HPV的检测方法有细胞学检测、斑点印迹法、荧光原位杂交法、原位杂交法、Southern杂交法、多聚合酶链反应(PCR)和杂交捕获法。各种方法的敏感性和特异性各不相同。目前临床应用较为普遍的是细胞学检测、多聚合酶链反应(PCR)和杂交捕获法。细胞学检查价格低廉，但是存在灵敏度低、特异性差、假阴性率和假阳性率高、不能对HPV进行分型；杂交捕获法灵敏度和特异性均较好，但是存在交叉污染、费用昂贵等问题；利用该法进行HPV分型需要将HPV常见基因型逐个筛选才能最后确定感染的HPV型别，成本高。
荧光PCR技术在1995年由美国PE公司率先研制成功，它兼有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直观，能直接监测PCR过程中的变化。与普通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了PCR产物污染的风险。
荧光PCR技术的荧光探针以发展形成多种类型，如Taqman探针，FRET探针等，本方法涉及的是Taqman探针技术。其工作原理是：它能被DNA合成酶(例如Taq酶)的5’→3’酶切活性所降解，探针的5’端有一荧光报告基团，3’端有一荧光淬灭基团，当两个基团相互先靠近的时候，由于发生能量传递作用，报告基团不能发出荧光，但随着扩增反应的进行，5’端的报告基团随着探针的水解而脱落下来，不再与淬灭发生能量传递作用，从而能发出荧光，被信号探测器所捕获。常同探针5’端相结合的基团有FAM(6-羧基荧光素)，TET(四氯-6-羧基荧光素)，JOE(2，7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素)，HEX(六氯-6-甲基荧光素)或VIC等，常与3’端相结合的荧光淬灭基团常为TAMRA(6-羧基四甲基若丹明)或DABCYL(4-(4’-恶烷氨基苯偶氮)苯甲酸)等。
目前市场上还没有利用荧光PCR技术进行HPV检测的产品。
【发明内容】
为克服传统方法对高危型HPV检测的缺点，本发明提供一种特异性高、成本低并且能够作定量分型检测的检测产品。
本发明提供了一种定量检测HPV(人乳头瘤病毒)16/18型感染的荧光PCR(聚合酶链式反应)试剂盒，包括定量参考品、阴性参考品、强阳性对照品、临界阳性对照品、UNG酶、Taq聚合酶、荧光PCR反应液，以及DNA提取液；所述的荧光PCR反应液包括PCR分型引物、特异性荧光探针。
所述的定量参考品、强阳性对照品和临界阳性对照品为含有插入HPV16和HPV18型特异序列的PMD18-T载体质粒，所述的插入序列分别如下：
HPV16型核酸插入序列为
atacacagcg gctggtttgg gcctgtgtag gtgttgaggt aggtcgtggt
cagccattag gtgtgggcat tagtggc 77bp；
hpv18型核酸插入序列为
tcaatatccc cttggacgta aatttttggt tcaggctgga ttgcgtcgca
agcccaccat aggccctcgc aaac 74bp。
所述的定量参考品为存放浓度为1.0×1010-5.0×1010拷贝/微升的重组质粒。使用时可按梯度稀释，用于做定量判断的参考。
所述的阳性对照品重组质粒浓度为1.0×106-5.0×106拷贝/微升；所述的临界阳性对照品重组质粒浓度为1.0×104-5.0×104拷贝/微升。
所述地阴性参考品为HPV阴性血清。
所述的PCR分型引物序列如下：
扩增检测HPV16型的正向引物 atacacagcggctggtttgg 20；
扩增检测HPV16型的反向引物 gccactaatgcccacacctaat 22；
扩增检测HPV18型的正向引物 tcaatatccccttggacgtaaa 22；
扩增检测HPV18型的反向引物 gtttgcgagggcctatggt 19。
所述的特异性荧光探针序列如下：
检测HPV16型的探针 ctgaccacgacctacctcaacacttacac 29；
检测HPV18型的探针 cgacgcaatccagcctgaacca 22。
所述的特异性荧光探针为Taqman探针，标记探针5’端的为一种荧光报告基团，可以是FAM、TET、JOE、VIC、HEX、ROX、TAMRA、CY3、CY5；3’端的为一种荧光淬灭基团，可以是TAMRA、DABCYL、NFQ。在本发明的反应体系中，可以使用一个或者多个荧光探针，所标记的荧光报告基团可以为一种或者两种。
本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：
①定量准确，兼有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直观，能直接监测PCR过程中的变化。与普通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了PCR产物污染的风险；
②灵敏度和特异性高。由于采取特异性和引物和探针的双保险设计，灵敏度和特异性均有很大提高，能在临床症状出现之前检测到病毒的感染；
③检测速度快，加上样本提取总共仅需2-3个小时；
④步骤简单；
⑤可同时进行高通量的样本检测。
总之荧光PCR技术灵敏度高，特异性好，可实时监测反应进程，反应时间可控制在两个半小时以内，而且是闭管操作，无需后续处理，可最大限度避免反应产物污染，可以取代传统细胞检测或者普通PCR检测进行HPV的早期诊断。
附图说明：
图1为HPV-16定量参考品的荧光PCR扩增曲线：曲线从左到右分别为(2.0×107，2.0×106，2.0×105，2.0×104，2.0×103拷贝/微升)；
图2为HPV-16定量参考品的标准曲线，相关系数＝0.9936，说明线性关系非常好，可用于HPV DNA拷贝数的定量分析；
图3为HPV-18定量参考品的荧光PCR扩增曲线，曲线从左到右分别为(2.0×107，2.0×106，2.0×105，2.0×104，2.0×103拷贝/微升)；
图4为HPV-18定量参考品的标准曲线，相关系数＝0.9902，说明线性关系非常好，可用于HPV DNA拷贝数的定量分析；
图5为临床样本的HPV荧光PCR扩增曲线。所测得阳性样本Ct值在20～30之间，在定量参考品线性范围之内。
具体实施方式：
应当理解，下面实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：如萨姆布鲁克和拉塞尔主编的《分子克隆实验指南》第三版，或按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1：试剂盒的制备
1.引物和探针设计与合成
使用Primer Express 2.0，针对HPV16和HPV18型的L1区(研究表明HPV各型基因组的L1区序列之间，具有一定的同源性序列和多态性序列，其序列差异是不同HPV型划分的依据)，筛选处于保守区的探针，在选择好的探针基础上设计16和18型的上下游引物。引物与探针均委托专业公司合成，其中引物为PAGE纯化，探针为HPLC纯化，探针5’端标记FAM荧光基团，3’端标记TAMRA荧光基团。
扩增序列如表1：
表1.特异性探针与引物序列
序列名称 寡核苷酸序列(5’-3’) 碱基长度(bp) HPV16探针 ctgaccacgacctacctcaacacttacac 29 HPV18探针 cgacgcaatccagcctgaacca 22 HPV16正向引物 atacacagcggctggtttgg 20 HPV16反向引物 gccactaatgcccacacctaat 22 HPV18正向引物 tcaatatccccttggacgtaaa 22 HPV18反向引物 gtttgcgagggcctatggt 19
2.HPV质粒阳性模板定量参考品的制备
本实施例中HPV质粒作为阳性模板用于制备定量参考品、强阳性对照品和临界阳性对照品。
使用步骤1中合成的扩增HPV16型和18型特异性引物扩增HPV L1区靶序列，将经过纯化的PCR产物连接到PGEM-Teasy载体上；然后转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中；通过蓝白斑筛选，分别构建HPV16和HPV18型重组质粒DNA作为灵敏度参考品。构建的HPV重组质粒经双向DNA测序鉴定。提取质粒，紫外分光光度计定量，稀释到2.0×1010拷贝/微升于-20℃保存。
3.对照品选择
使用无HPV血清为阴性对照；HPV16和HPV18重组质粒(2×106拷贝/微升)为强阳性对照；HPV16和HPV18重组质粒(2×104拷贝/微升)为临界阳性对照。
4.荧光PCR反应液组成
表2.PCR反应液组成
原料名称 终浓度 PCR Buffer (0.8-2)× MgCl2 2-5mM
原料名称 终浓度 dNTP 0.1-0.5mM HPV引物 0.1-0.50μM HPV探针 0.1-0.50μM UNG酶 0.05-1U Taq酶 0.5-3U H2O 适量 DNA模版 2μL 总体积 40μL
由于针对两种HPV分型进行扩增，所以每一组引物和探针组成一种荧光PCR反应液，本试剂盒提供两种荧光PCR反应液，分别用相应引物和探针检测HPV16型和HPV18型。
实施例2：试剂盒的使用
1.样本提取
使用DNA提取液提取待测样品中的HPV病毒核酸
1)样本前处理：拭净宫颈口过多的分泌物，用生理盐水浸润的棉拭子紧贴宫颈口粘膜稍用力转动2周以取得分泌物和脱落细胞，将取样后的棉拭子放入备有1ml无菌生理盐水的EP管中充分漂洗，贴壁挤干。碱裂解法提取HPV病毒。
裂解液配方：60mmol/L TrisHCl，pH 8.0；0.5％SDS；200mmol/L NaCl
2)操作步骤：取500μl分泌物混匀于13000rpm离心10min，弃上清；加50μl裂解液，100℃保温20min，13000rpm离心1min，取上清2μl做PCR反应。
2.定量参考品准备
将HPV质粒阳性模板定量参考品用去离子水进行梯度稀释，浓度分别为2.0×107，2.0×106，2.0×102，2.0×104，2.0×103拷贝/微升。
3.样本检测
分别取步骤1中提取的核酸，步骤2中获得的梯度稀释的定量参考品，临界阳性对照、强阳性对照和阴性对照，作为DNA模板，加入UNG酶、Taq聚合酶、及含有特异性PCR引物和特异性荧光探针的荧光定量反应液中，组成PCR反应体系。在16和18型PCR反应体系中分别加入各自对应并且已经稀释混匀好的HPV-16和HPV-18型质粒标准品(2.0×107，2.0×106，2.0×102，2.0×104，2.0×103拷贝/微升)，作为样本定量判定的标准。该体系各主要成分如下：
4.反应程序
设置收集FAM荧光信号的荧光检测通道，将反应管放入荧光PCR仪(ABI7500)开始扩增，反应程序如下：
表3.PCR反应程序
5.结果判断
基线范围的Ct值(循环数)为6-15或由软件自动选择，设定阈值使之超过无规则扩增曲线的最高值。荧光PCR仪不同，所得基线范围的Ct值会有所不同。
6.质控标准
(1)各类对照质控品判断结果如下表：
表4.质控品标准检测结果
质控品 标准检验结果 1 阴性对照 无扩增 2 临界阳性对照 25＜Ct值≤30 3 强阳性对照 22＜Ct值≤25
(2)定量参考品质控判断方法：梯度稀释的定量参考品HPV-16和HPV-18质粒，经扩增做出标准曲线，当相关系数＞0.99时可用于HPV DNA拷贝数的定量分析；否则要重新实验。图1为HPV16型质粒定量参考品扩增后得到的扩增曲线，根据该曲线得到的标准曲线为图2；图3为HPV16型质粒定量参考品扩增后得到的扩增曲线，根据该曲线得到的标准曲线为图4。
7.结果报告：
图5为临床样本的HPV荧光PCR扩增曲线。所测得阳性样本Ct值在20～30之间，在定量参考品线性范围之内。
样本结果的判断标准如下：
表4.报告样本检测结果
【序列表】
<110>上海裕隆基因科技中心有限公司
<120>定量检测HPV16/18型感染的荧光PCR试剂盒
<160>8
<210>1
<211>77
<212>DNA
<213>人属(Homo)
<400>1
atacacagcg gctggtttgg gcctgtgtag gtgttgaggt aggtcgtggt cagccattag 60
gtgtgggcat tagtggc 77
<210>2
<211>74
<212>DNA
<213>人属(Homo)
<400>2
tcaatatccc cttggacgta aatttttggt tcaggctgga ttgcgtcgca agcccaccat 60
aggccctcgc aaac 74
<210>3
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和扩增条件设计，以用作诊断人乳头瘤病毒16/18型感染的荧光PCR试剂盒的上游引物，命名为HPV16探针。
<400>3
ctgaccacga cctacctcaa cacttacac 29
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和扩增条件设计，以用作诊断人乳头瘤病毒16/18型感染的荧光PCR试剂盒的上游引物，命名为HPV18探针。
<400>4
cgacgcaatc cagcctgaac ca 22
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和扩增条件设计，以用作诊断人乳头瘤病毒16/18型感染的荧光PCR试剂盒的上游引物，命名为HPV16正向引物。
<400>5
atacacagcg gctggtttgg 20
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和扩增条件设计，以用作诊断人乳头瘤病毒16/18型感染的荧光PCR试剂盒的上游引物，命名为HPV16反向引物。
<400>6
gccactaatg cccacaccta at 22
<210>7
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和扩增条件设计，以用作诊断人乳头瘤病毒16/18型感染的荧光PCR试剂盒的上游引物，命名为HPV18正向引物。
<400>7
tcaatatccc cttggacgta aa 22
<210>8
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和扩增条件设计，以用作诊断人乳头瘤病毒16/18型感染的荧光PCR试剂盒的上游引物，命名为HPV18反向引物。
<400>8
gtttgcgagg gcctatggt 19