一种高纯度尿促卵泡刺激素及其制备方法.pdf

本发明公开了一种高纯度尿促卵泡刺激素，其纯度不低于95w/w％，其杂质含量不超过5w/w％。同时本发明公开了所述高纯度尿促卵泡刺激素的制备方法。

1.  一种高纯度尿促卵泡刺激素(pFSH)，其特征在于，其纯度不低于95w/w％，其杂质含量不超过5w/w％；优选纯度不低于98.0w/w％，其杂质含量不超过2.0w/w％。

2.  如权利要求1所述的高纯度尿促卵泡刺激素，其特征在于，卵泡刺激素是人来源的卵泡刺激素或其变体；更佳地，卵泡刺激素是人尿来源的卵泡刺激素或其变体。

3.  一种如权利要求1-2任一所述的高纯度尿促卵泡刺激素的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：
将低纯度尿促卵泡刺激素经过色谱纯化，得到高纯度尿促卵泡刺激素；
所述的色谱是染料亲和色谱。

4.  如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的色谱还包括阳离子交换色谱。

5.  如权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：
(a)将含有低纯度尿促卵泡刺激素的溶液1经过阳离子交换色谱纯化，得到馏出物1；和
(b)将含有馏出物1的溶液2经过染料亲和色谱纯化，得到高纯度尿促卵泡刺激素。

6.  如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(a)中的阳离子交换色谱包括步骤：
(i)用pH4-7含有低纯度尿促卵泡刺激素的第一上样液进行上样，所述第一上样液中低纯度尿促卵泡刺激素的浓度为0.1-10w/v％(g/ml)；
(ii)用pH4-6的第一洗涤液进行洗涤；和
(iii)用pH4-6的第一洗涤液和pH4-6的第一洗脱液进行洗脱，得到馏出物1。

7.  如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(b)中的染料亲和色谱包括步骤：
(i′)用pH5-7含有馏出物1的第二上样液进行上样；所述第二上样液中馏出物1的浓度为0.05-5w/v％(g/ml)
(ii′)用pH6-11的第二洗涤液进行洗涤；和
(iii′)用pH6-11的第二洗脱液进行洗脱，得到高纯度尿促卵泡刺激素。

8.  如权利要求3-7任一项所述的方法，其特征在于，所述阳离子交换色谱的树脂骨架介质包括琼脂糖，葡聚糖，纤维素，苯乙烯和二乙烯基苯的交联物，丙烯酸和/或其衍生物的交联物。

9.  如权利要求3-7任一项所述的方法，其特征在于，所述的阳离子交换色谱的树脂活性基团选自磺酸丙基(-SO₃H)、次甲基磺酸基(-CH₂SO₃H)、羧基(-COOH)、羧甲基(-OCH₂COOH)、或苯酚基(-C₆H₅OH)。

10.  如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述的阳离子交换色谱的色谱柱的活性基团选自磺酸丙基、或次甲基磺酸基。

11.  如权利要求3-7任一项所述的方法，其特征在于，所述的阳离子交换色谱的树脂是SP Sepharose或CM Sepharose。

12.  如权利要求3-7任一项所述的方法，其特征在于，所述染料亲和色谱的树脂的染料配基选自Cibacron Blue、Orange、Red、Green。

13.  如权利要求3-7任一项所述的方法，其特征在于，所述染料亲和色谱的树脂的固相载体选自皂土、玻璃微球、石英微球、羟磷酸钙、氧化铝、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素、或琼脂糖。

14.  如权利要求3-7任一项所述的方法，其特征在于，所述染料亲和色谱的树脂是Blue Sepharose 6B或Blue Sepharose FF。

15.  如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)或(b)进行1-3次。

16.  一种药物组合物，其特征在于，所述的组合物中含有治疗有效量的如权利要求1-2任一所述的高纯度尿促卵泡刺激素、和药学上可接受的载体。

17.  一种如权利要求1-2任一所述的高纯度尿促卵泡刺激素在制备治疗不育综合症的药物中的用途。

一种高纯度尿促卵泡刺激素及其制备方法
技术领域
本发明涉及蛋白质纯化和生物医药领域。具体而言，本发明涉及高纯度的卵泡刺激素(FSH)及其制备方法，以及含有它的药物组合物。
背景技术
卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone，简称FSH)是由垂体产生的激素，它由α链和β链两个亚基组成。FSH的α亚基与黄体生成激素(leuteinizing hormone，简称LH)和绒毛膜促性腺素(chorionicgonadotropin，简称CG)的α亚基完全相同，具有92个氨基酸，分子量约为14500D，第52和78位置上的天冬酰胺是发生N-糖基化的氨基酸。
FSH的β亚基由111个氨基酸组成，分子量约为18000D，其中第7和24位置上的天冬酰胺是发生N-糖基化的氨基酸。而LH的β亚基由121个氨基酸组成，分子量约为14800D；CG的β亚基则有145个氨基酸，分子量22000-39000D。
临床上FSH主要用于治疗不育症以及体外的辅助生殖。FSH可以从绝经期妇女的尿液中提取出来，也可通过DNA重组技术而制备。
含有FSH的第一代产品是尿促性素(HMG)，如Serono公司的Pergonal，它是FSH与LH比例约为1的混合物。但是，对于体内有较多量的LH而不需加用外源性LH的患者，LH水平过高会影响卵泡的正常发育，不合时机的抑制减数分裂抑制因子会导致卵子的老化，从而降低受精和着床的机会。因此对这部分患者而言，更适合于使用纯FSH制剂。另一方面，过多的LH容易导致多囊卵巢综合症(Polycystic Ovarian Syndrome，POOS)，研究表明，LH过多对生殖功能有不利的作用，如引起月经稀发、无排卵、不孕及流产。因此对POOS患者用纯FSH治疗比HMG更为安全，可减少卵巢过度刺激综合症(OvarianHyperstimulation Syndrome，OHSS)危险。Serono公司推出的Metrodin就是一种含有极少量LH的FSH制剂，适合POOS患者的治疗。
但是，Metrodin仅仅是去除了LH，但还是保留了很多尿源的杂蛋白(杂蛋白约占80-90％)，这些杂蛋白的存在可能会导致一定的副作用，如过敏反应。因此近年来市场上正倾向于开发和使用高纯度的FSH，它是将低纯度的FSH进行进一步的纯化，去除绝大部分杂蛋白，获得高比活的FSH，它可以克服普通产品中因大量杂蛋白而造成的对人体的过敏反应，并且由于这些优点使得它可以采用皮下注射，方便患者的使用，减轻痛苦。
目前的尿源FSH的制备方法主要是以低纯度尿促卵泡刺激素或绝经期促性腺素(HMG)为起始原料，通过疏水色谱，或单克隆抗体免疫层析法以及反相HPLC法来纯化，但获得的FSH的比活和纯度还不是十分理想，偶有产生副反应的报到。
因此，本领域迫切需要开发出一种高纯度的FSH，以及相应的制备方法，并由此获得含高纯度FSH的制剂，可以使用于皮下注射，减少副反应的发生几率，方便患者的使用、减轻痛苦。
发明内容
本发明旨在提供一种高纯度尿促卵泡刺激素。
本发明的另一个目的是提供所述高纯度尿促卵泡刺激素的制备方法。
本发明的再一个目的是提供所述高纯度尿促卵泡刺激素的用途。
在本发明的第一方面，提供了一种高纯度尿促卵泡刺激素(pFSH)，所述的高纯度尿促卵泡刺激素的纯度不低于95w/w％，其杂质含量不超过5w/w％；较佳地，其纯度不低于98.0w/w％，其杂质含量不超过2.0w/w％。
在另一优选例中，卵泡刺激素是人来源的卵泡刺激素或其变体；更佳地，卵泡刺激素是人尿来源的卵泡刺激素或其变体。
在本发明的第二方面，提供了一种如上所述的本发明提供的高纯度尿促卵泡刺激素的制备方法，所述的方法包括步骤：
将低纯度尿促卵泡刺激素经过色谱纯化，得到高纯度尿促卵泡刺激素；
所述的色谱是染料亲和色谱。
在另一优选例中，所述的色谱还包括阳离子交换色谱。
在另一优选例中，所述的方法包括步骤：
(a)将含有低纯度尿促卵泡刺激素的溶液1经过阳离子交换色谱纯化，得到馏出物1；和
(b)将含有馏出物1的溶液2经过染料亲和色谱纯化，得到高纯度尿促卵泡刺激素。
在另一优选例中，步骤(a)中的阳离子交换色谱包括步骤：
(i)用pH4-7含有低纯度尿促卵泡刺激素的第一上样液进行上样，所述第一上样液中低纯度尿促卵泡刺激素的浓度为0.1-10w/v％(g/ml)；
(ii)用pH4-6的第一洗涤液进行洗涤；和
(iii)用pH4-6的第一洗涤液和pH4-6的第一洗脱液进行洗脱，得到馏出物1。
在另一优选例中，步骤(b)中的染料亲和色谱包括步骤：
(i′)用pH5-7含有馏出物1的第二上样液进行上样；所述第二上样液中馏出物1的浓度为0.05-5w/v％(g/ml)
(ii′)用pH6-11的第二洗涤液进行洗涤；和
(iii′)用pH6-11的第二洗脱液进行洗脱，得到高纯度尿促卵泡刺激素。
在另一优选例中，所述阳离子交换色谱的树脂骨架介质包括琼脂糖，葡聚糖，纤维素，苯乙烯和二乙烯基苯的交联物，丙烯酸和/或其衍生物的交联物。
在另一优选例中，所述的阳离子交换色谱的树脂活性基团选自磺酸丙基(-SO₃H)、次甲基磺酸基(-CH₂SO₃H)、羧基(-COOH)、羧甲基(-OCH₂COOH)、或苯酚基(-C₆H₅OH)。
在另一优选例中，所述的阳离子交换色谱的色谱柱的活性基团选自磺酸丙基、或次甲基磺酸基。
在另一优选例中，所述的阳离子交换色谱的树脂是SP Sepharose或CMSepharose。
在另一优选例中，所述染料亲和色谱的树脂的染料配基选自Cibacron Blue、Orange、Red、Green。
在另一优选例中，所述染料亲和色谱的树脂的固相载体选自皂土、玻璃微球、石英微球、羟磷酸钙、氧化铝、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素、或琼脂糖。
在另一优选例中，所述染料亲和色谱的树脂是Blue Sepharose 6B或BlueSepharose FF。
在另一优选例中，步骤(a)或(b)进行1-3次。
在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，所述的组合物中含有治疗有效量的如上所述的本发明提供的高纯度尿促卵泡刺激素、和药学上可接受的载体。
在本发明的第四方面，提供了一种如上所述的本发明提供的高纯度尿促卵泡刺激素在制备治疗不育综合症的药物中的用途。
据此，本发明提供了一种高纯度的FSH，以及相应的制备方法，并由此获得含高纯度FSH的制剂，可以使用于皮下注射，减少副反应的发生几率，方便患者的使用、减轻痛苦。
附图说明
图1显示了FSH纯度图谱。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，惊奇地发现通过阳离子交换树脂色谱和染料亲和树脂色谱可以获得目前已知的最高纯度的FSH。
具体而言，本发明是以尿或HMG或低纯度尿促卵泡刺激素为起始原料，通过创新的阳离子交换树脂色谱和染料亲和树脂色谱，得到高纯度的FSH，纯化方法简单有效，获得的FSH纯度高、杂质少。
如本发明所用，术语“卵泡刺激素”和“FSH”可互换使用，指一类用于促进精子或卵泡产生、促进卵巢发育的激素或其变体，其可在天然情况下由垂体前叶分泌。
如本文所用，“尿促卵泡刺激素”和“尿源性FSH”可互换使用，是指从尿液中提取得到的卵泡刺激素，所述尿液来自于哺乳动物，优选来自于人，更佳地是绝经期妇女的尿液。
本发明中所用的原料低纯度尿源性FSH可采用本领域常用的任何方式获得，例如可以用传统方法从绝经期妇女尿液中通过高岭土吸附、洗脱，丙酮沉淀，乙醇溶液抽提，离子交换层析色谱(包括阳离子、阴离子色谱)，甚至疏水色谱得到HMG，再将HMG通过疏水层析、或者通过抗LH抗体和/或抗CG抗体的亲和层析等常规手段来获得低纯度尿源性FSH，如CN101307103A所描述的方法。。低纯度尿源性FSH的比活一般低于2000IU/mg蛋白，优选200-500IU/mg蛋白。
可用于本发明中的低纯度尿源性FSH原料可为：将HMG经过预纯化步骤去除LH的原料，或按传统提取方法从绝经期妇女尿液中通过高岭土吸附、洗脱，丙酮沉淀，乙醇溶液抽提，离子交换层析色谱(包括阳离子、阴离子色谱)，然后再通过疏水层析、或者通过抗LH抗体和/或抗CG抗体的亲和层析等常规方法来获得的基本上只含FSH和其它非LH的杂蛋白的原料。
优选在采用本发明的方法纯化低纯度尿源性FSH前，采用本领域常规方法对原料低纯度尿源性FSH进行初步纯化，以分离除LH以外的其它杂质。
HMG可以按传统的方法获得，如从绝经期妇女尿液中通过高岭土吸附、洗脱，丙酮沉淀，乙醇溶液抽提，离子交换层析色谱(包括阳离子、阴离子色谱)，甚至疏水色谱。然后将HMG进行后续的纯化，可以用疏水色谱或去除其中的LH，然后按本专利公开的方法进行制备从而获得高活性的FSH。
作为起始原料的低纯度尿源性FSH原料的比活在2000IU/mg蛋白以下，优选200-500IU/mg蛋白。
如本文所用，术语“黄体生成激素”和“LH”可互换使用，指在含有FSH的原料制备或获取过程中掺杂于其中的与天然LH具有相同或相似结构和功能的激素。
本发明提供的高纯度尿促卵泡刺激素的纯度≥95％，杂质≤5％。本发明提供的
高纯度尿源性FSH中LH的生物效价小于1 LH IU/100 FSH IU。
本发明提供的高纯度尿源性FSH的制备方法包括步骤：
将低纯度尿源性卵泡刺激素或绝经期促性腺素(HMG)经过色谱纯化，得到高纯度尿源性FSH；所述的色谱是阳离子交换色谱和染料亲和色谱。
优选地，所述的方法包括步骤：
(1)将含有低纯度FSH的溶液1经过阳离子交换色谱纯化，得到馏出物1；和
(2)将含有馏出物1的溶液2经过染料亲和色谱纯化，得到高纯度尿促卵泡刺激素(pFSH)。
本发明制备方法中使用的阳离子交换色谱的色谱柱的骨架介质包括琼脂糖、葡聚糖、纤维素、苯乙烯、丙烯酸和/或衍生物的交联物；所述的阳离子交换色谱的色谱柱的活性基团选自磺酸丙基(-SO₃H)、次甲基磺酸基(-CH₂SO₃H)、羧基(-COOH)、羧甲基(-OCH₂COOH)、或苯酚基(-C₆H₅OH)，较佳地选自磺酸丙基、或次甲基磺酸基；所述的阳离子交换色谱的色谱柱是SP Sepharose或CMSepharose。
本发明制备方法中使用的阳离子交换色谱的洗脱溶液pH2-8，离子浓度0-2M；所述离子选自钠离子、钾离子。
本发明制备方法中使用的染料亲和色谱的色谱柱的染料配基选自CibacronBlue、Orange、Red、Green；所述染料亲和色谱的色谱柱的固相载体选自皂土、玻璃微球、石英微球、羟磷酸钙、氧化铝、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素、或琼脂糖；所述染料亲和色谱的色谱柱是Blue Sepharose。
本发明制备方法中使用的染料亲和色谱的洗脱溶液pH6-12，离子浓度0-4M；所述离子选自钠离子、钾离子。
在本发明的一个优选例中，所述阳离子交换色谱纯化步骤包括：
(i)用pH4-7含有低纯度尿促卵泡刺激素的第一上样液进行上样，所述第一上样液中低纯度尿促卵泡刺激素的浓度为0.1-10w/v％(g/ml)，优选2.0-4.0w/v％(g/ml)；
(ii)用pH4-6的第一洗涤液进行洗涤；和
(iii)用pH4-6的第一洗涤液和pH4-6的第一洗脱液进行洗脱，得到馏出物1。
更佳地，步骤(iii)中进行梯度洗脱，在0.5至5小时内，第一洗脱液的浓度(v/v)从0至100％。
所述的第一上样液的盐浓度为0-0.5M，所述的盐选自盐酸盐、磷酸盐、和/或醋酸盐；所述的第一洗涤液或第一洗脱液的盐浓度为0.05-3M，所述的盐选自盐酸盐、磷酸盐、和/或醋酸盐。所述盐的金属离子选自钠离子或钾离子。
在本发明的一个优选例中，所述染料亲和色谱纯化步骤包括：
(i′)用pH5-7含有馏出物1的第二上样液进行上样；所述第二上样液中馏出物1的浓度为0.05-5w/v％(g/ml)
(ii′)用pH8-11的第二洗涤液进行洗涤；和
(iii′)用pH8-11的第二洗脱液进行洗脱，得到高比活尿促卵泡刺激素。
所述的第二上样液的盐浓度为0-0.05M，所述的盐选自盐酸盐、磷酸盐、和/或醋酸盐；所述的第二洗涤液或第二洗脱液的盐浓度为0.01-5M，所述的盐选自盐酸盐、磷酸盐、和/或醋酸盐、和/或甘氨酸盐。所述盐的金属离子选自钠离子或钾离子。
本发明还提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有治疗有效量的用本发明方法制备的高纯度尿源性FSH，以及药学上可接受的载体。
如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由……构成”、和“由……构成”。如本文所用，术语“治疗有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，术语“药学上可接受的”或“食品学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。
所述的“药学上可接受的载体”可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、润湿剂或乳化剂、矫味剂、pH缓冲物质等。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。
在本发明的优选实施方式中，所述药物组合物中的高纯度尿源性FSH占组合物总重量的0.001-99.9wt％；优选为组合物总重量的0.01-99wt％，较优选为0.02-95wt％，更优选0.05-90wt％。余量为药学上可接受的载体以及其它添加剂等物质。
如本文所用，术语“单位剂型”是指为了服用方便，将本发明的组合物制备成单次施用所需的剂型，包括但不限于各种固体剂(如片剂)、液体剂、胶囊剂、缓释剂、粉针剂。在本发明的另一优选实施方式中，所述组合物为单位剂型或多剂型，且其中FSH的含量为0.001-2000mg/剂，优选0.003-500mg/剂，更优选0.005-50mg/剂。在本发明的另一个优选例中，每天施用1-6剂本发明的组合物，优选施用1-3剂；最优选的，每天施用的剂量为1剂。
应理解，所用FSH的有效剂量可随待施用或治疗的对象的严重程度而变化。具体情况根据对象的个体情况(例如对象体重、年龄、身体状况、所需达到的效果)来决定，这在熟练医师或营养师可以判断的范围内。
本发明的药物组合物，可以为固态(如颗粒剂、片剂、冻干粉、栓剂、胶囊、舌下含片)或液态(如口服液、水针剂)或其它合适的形状。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的主要优点在于：
1、提供了一种高纯度的尿源性FSH，可应用于皮下注射；
2、提供了一种高纯度的尿源性FSH的纯化方法，方法简单有效，适合产业化。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。
本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明涉及的生物效价和纯度的测定方法：
生物效价
FSH、LH的生物效价测定方法按中国药典2005版附录XII M、XII N的方法检验。
纯度
色谱柱：Superdex75 10/300 GL
流动相：乙腈∶0.2M磷酸钠溶液pH7.0＝200∶1000
样品配制：取样品用流动相溶解至500IU/mL
进样量：100μL
检测波长：215nm
运行时间：60min
实施例1
制备高纯度尿促卵泡刺激素I
将低纯度尿促卵泡刺激素(购自上海天伟生物制药有限公司)用作起始原料，其中FSH的生物效价为315IU/mg，LH的生物效价为≤3IU/mg。
将10g上述低纯度尿促卵泡刺激素用300mL平衡液(0.03M磷酸二氢钠，pH5)溶解，然后上至250mL CM-Sepharose层析柱(Amersham提供)，此柱事先已用相同的平衡液平衡好。上样结束后用洗涤液(0.1M醋酸钠，pH5)洗涤10倍柱体积，然后用洗涤液和洗脱液(0.1M醋酸钠+1M NaCl，pH5)进行0-100％线性梯度洗脱，用紫外检测器监测280nm处，分布收集各馏出峰，检测其FSH免疫效价，合并有效成份约0.4L，加入预冷的无水乙醇沉淀过夜，次日离心收集沉淀，用无水乙醇脱水，真空干燥得到1.8克干品。
将1.8g上述干品用200mL平衡液(0.01M磷酸二氢钠，pH6.5)溶解，然后上至300mL Blue Sepharose FF层析柱(Amersham提供)上，上样结束后用平衡液洗涤5倍柱体积，然后用0.05M甘氨酸缓冲液(pH10)洗涤5倍柱体积，再用0.05M甘氨酸、0.4M NaCl缓冲液(pH9)洗涤8倍柱体积，最后用洗脱液(0.05M甘氨酸、2.5M NaCl，pH9)洗脱，分布收集各馏出峰，检测其FSH免疫效价，合并有效成份约2L，用1万分子量膜超滤浓缩后，加入预冷的无水乙醇，离心收集沉淀，用无水乙醇脱水，真空干燥得266mg干燥品I，即高纯度尿促卵泡刺激素I。FSH纯度图谱见附图1。
表1所得干燥品的生物效价及比活测定结果