基于分析NPC1L1蛋白亚细胞定位变化筛选降胆固醇新药的方法.pdf

本发明公开了筛选潜在的降胆固醇物质的方法，所述方法包括：在候选物质存在或不存在下，根据细胞内吞NPC1L1蛋白的差异来筛选，或根据与NPC1L1相互作用蛋白的活性的差异来筛选，或根据胆固醇与NPC1L1蛋白的NH2端结构域结合的差异来筛选。本发明还提供了利用所述方法获得的降胆固醇物质。

1.  一种筛选潜在的降胆固醇物质的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)用胆固醇处理表达NPC1L1蛋白的细胞，并确定细胞囊泡内吞NPC1L1蛋白的程度；
(2)在候选物质存在下，如(1)所述处理表达NPC1L1蛋白的细胞，再次确定囊泡内吞NPC1L1蛋白的程度；和
(3)比较(1)和(2)中囊泡内吞NPC1L1蛋白的差异；
其中，如果(2)中囊泡内吞NPC1L1蛋白的程度在统计学上低于(1)中囊泡内吞NPC1L1蛋白的程度，则所述候选物质是潜在的降胆固醇物质。

2.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)或(2)中，所述的表达NPC1L1蛋白的细胞在胆固醇处理前预先经过降胆固醇处理。

3.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)或(2)中，还包括：确定细胞中笼型蛋白与NPC1L1蛋白的结合程度；并且，
(3)中，还包括：比较(1)和(2)中笼形蛋白与NPC1L1蛋白的结合程度；
其中，如果(2)中笼型蛋白与NPC1L1蛋白的结合程度在统计学上低于(1)中笼型蛋白与NPC1L1蛋白的结合程度，则所述候选物质是潜在的降胆固醇物质。

4.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)或(2)中，还包括：确定细胞中AP2复合体相关蛋白与NPC1L1蛋白的结合程度；并且，
(3)中，还包括：比较(1)和(2)中AP2复合体相关蛋白与NPC1L1蛋白的结合程度；
其中，如果(2)中AP2复合体相关蛋白与NPC1L1蛋白的结合程度在统计学上低于(1)中AP2复合体相关蛋白与NPC1L1蛋白的结合程度，则所述候选物质是潜在的降胆固醇物质。

5.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞是重组细胞，其基因组中含有表达盒，所述表达盒含有：可操作性连接的NPC1L1蛋白的编码基因和报告基因。

6.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的NPC1L1蛋白是一种融合蛋白，其包含NPC1L1蛋白与标签蛋白，且所述的标签蛋白位于NPC1L1蛋白的胞外区域。

7.  如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的标签蛋白位于NPC1L1蛋白的第8跨膜区与第9跨膜区之间。

8.  如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的标签蛋白位于NPC1L1蛋白上第986位氨基酸与第987位氨基酸之间。

9.  如权利要求8所述的方法，其特征在于，通过鉴定细胞标签蛋白的定位来确定NPC1L1蛋白的定位，进而确定细胞囊泡内吞NPC1L1蛋白的程度。

10.  如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述通过鉴定细胞标签蛋白的定位来确定NPC1L1蛋白的定位，进而确定细胞囊泡内吞NPC1L1蛋白的程度的方法包括：
(1)在不通透细胞的情况下，标记位于细胞膜上的标签蛋白；
(2)在通透细胞的情况下，标记全细胞的标签蛋白；
(3)分析或计算(1)中细胞膜上标签蛋白占(2)中全细胞标签蛋白的百分比；如细胞膜上的标签蛋白所占百分比在统计学上明显增加，则NPC1L1蛋白定位在细胞膜上的比例明显增加，进而表明细胞囊泡内吞NPC1L1蛋白的程度明显降低。

11.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，选择和确定对于降胆固醇有用的物质。

12.  一种筛选潜在的降胆固醇物质的方法，其特征在于，所述方法包括：
(a)用候选物质处理表达介导NPC1L1内吞的蛋白的细胞；
(b)检测所述细胞中所述蛋白的表达或活性；
其中，若所述候选物质可降低所述蛋白的表达或活性，则表明该候选物质是潜在的降胆固醇物质。

13.  如权利要求12所述的方法，其特征在于，
步骤(a)包括：在测试组中，将候选物质加入到表达介导NPC1L1内吞的蛋白的细胞中；和/或
步骤(b)包括：检测测试组的细胞中所述蛋白的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达所述蛋白的细胞；
如果测试组中所述蛋白的表达或活性在统计学上低于对照组，就表明该候选物是潜在的降胆固醇物质。

14.  如权利要求12或13所述的方法，其特征在于，所述介导NPC1L1内吞的蛋白是笼形蛋白和/或AP2复合体。

15.  一种抑制NPC1L1蛋白内吞的物质在制备降胆固醇药物中的用途。

16.  如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述抑制NPC1L1蛋白内吞的物质是抑制笼形蛋白和/或AP2复合体与NPC1L1蛋白相互作用的物质。

17.  如权利要求15或16所述的用途，其特征在于，所述抑制NPC1L1蛋白内吞的物质是β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁或25-羟胆固醇。

18.  一种筛选潜在的降胆固醇物质的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)用胆固醇与NPC1L1蛋白的NH₂端结构域接触，检测胆固醇与NPC1L1蛋白的NH₂端结构域的结合情况；
(2)用胆固醇与NPC1L1蛋白的NH₂端结构域接触，并加入候选物质，检测胆固醇与NPC1L1蛋白的NH₂端结构域的结合情况；
其中，如(2)中胆固醇与NPC1L1蛋白的NH₂端结构域的结合强度显著弱于或结合量显著低于(1)中胆固醇与NPC1L1蛋白的NH₂端结构域的结合强度或结合量，则所述候选物质是潜在的降胆固醇物质。

19.  一种筛选潜在的降胆固醇物质的方法，其特征在于，所述方法包括：将候选物质与NPC1L1蛋白的NH₂端结构域接触，检测候选物质与NPC1L1蛋白的NH₂端结构域的结合情况；如候选物质与NPC1L1蛋白的NH₂端结构域发生特异结合，则所述候选物质是潜在的降胆固醇物质。

20.  如权利要求18或19所述的方法，其特征在于，所述的NPC1L1蛋白的NH₂端结构域含有GenBank登录号FJ481111所示序列中第18-260位氨基酸。

21.  采用如权利要求18或19所述的方法筛选获得的物质。

22.  一种融合蛋白，其特征在于，所述蛋白包含NPC1L1蛋白与标签蛋白，且所述的标签蛋白位于NPC1L1蛋白的胞外区域。

23.  一种核酸序列，其特征在于，所述的核酸序列编码权利要求22所述的融合蛋白。

24.  一种重组载体，其特征在于，所述的重组载体含有权利要求23所述的核酸序列。

25.  一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求24所述的重组载体，或其基因组中整合有权利要求23所述的核酸序列。

26.  权利要求25所述的宿主细胞的用途，其特征在于，用于分析NPC1L1蛋白的细胞亚定位。

基于分析NPC1L1蛋白亚细胞定位变化筛选降胆固醇新药的方法
技术领域
本发明属于细胞生物学以及药物学领域，更具体地，本发明涉及基于分析NPC1L1蛋白亚细胞定位变化筛选降胆固醇新药的方法；同时，本发明鉴定了NPC1L1蛋白中结合胆固醇的结构域，也可以筛选结合该结构域的化合物从而得到抑制胆固醇吸收的物质。
背景技术
胆固醇是生物膜的重要组成成分，也是合成甾醇类激素和胆汁酸的前体。胆固醇过多的摄入会导致很多疾病，其中最常见和最严重的是动脉粥样硬化和冠心病。哺乳动物获得胆固醇的途径主要有两条：从头合成和从食物中吸收。胆固醇生物合成的主要分子机制已经被阐明，但是对于胆固醇的吸收，细胞分子水平的研究并不多。
Nieman-Pick C1 Like 1(NPC1L1)最近被报道在胆固醇吸收过程中起着重要的作用(Altmann，S.W.等(2004)，Niemann-Pick C1 Like 1 protein is critical for intestinalcholesterol absorption.Science 303，1201-1204)。NPC1L1在人和小鼠的小肠中都有很高的表达，在人中，肝脏也有很高表达。NPC1L1敲除的小鼠从食物中吸收胆固醇的能力大大下降。除了介导小肠胆固醇吸收外，NPC1L1还介导肝脏胆固醇重吸收，肝脏过表达NPC1L1的转基因小鼠比正常小鼠的胆汁和粪便中的胆固醇下降。
人NPC1L1蛋白含有1332个氨基酸，构成13个跨膜区段(Wang，J.等(2009)，Membrane topology of human NPC1L1，a key protein in enterohepatic cholesterolabsorption.J Lipid Res，Epub ahead of print)。NPC1L1的第3-7区段含有甾醇感受结构域，在受甾醇调节的NPC1、HMGCR、和SCAP蛋白中也含有此结构域。关于NPC1L1蛋白的亚细胞定位一直存在争议。
Ezetimibe(市场名Zetia)可以减少胆固醇吸收，并被用来临床治疗高胆固醇血症。但是Ezetimibe抑制NPC1L1蛋白介导胆固醇的吸收的药物机理一直不清楚。
因此，尽管本领域已知NPC1L1蛋白与胆固醇的吸收相关，然而并不清楚NPC1L1蛋白介导的胆固醇吸收的机制，相关药物的研究和开发受到限制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种筛选降胆固醇物质的方法。
本发明的目的在于提供通过所述筛选方法获得的降胆固醇的物质。
在本发明的第一方面，提供一种筛选潜在的降胆固醇物质的方法，所述方法包括：
(1)用胆固醇处理表达NPC1L1蛋白的细胞，并确定细胞囊泡(一般又称为膜泡)内吞NPC1L1蛋白的程度；
(2)在候选物质存在下，如(1)所述处理表达NPC1Ll蛋白的细胞，再次确定囊泡内吞NPC1L1蛋白的程度；和
(3)比较(1)和(2)中囊泡内吞NPC1L1蛋白的差异；
其中，如果(2)中囊泡内吞NPC1L1蛋白的程度在统计学上低于(优选显著低于，如低20％，较佳地低40％；更佳地低60％或更低)(1)中囊泡内吞NPC1L1蛋白的程度，则所述候选物质是潜在的降胆固醇物质。
在一个优选例中，所述的囊泡内吞主要是笼型蛋白(clathrin)介导的内吞。
在另一优选例中，所述的NPC1L1蛋白含有GenBank登录号FJ481111中第18-260位的氨基酸序列，该区域是胆固醇的结合结构域。
在另一优选例中，(1)或(2)中，所述的表达NPC1L1蛋白的细胞在胆固醇处理前预先经过降胆固醇处理。
在另一优选例中，所述的降低胆固醇处理是指使细胞内胆固醇的量低于正常水平，从而NPC1L1蛋白被转运到细胞膜区域。
在另一优选例中，(1)或(2)中，还包括：确定细胞中笼型蛋白与NPC1L1蛋白的结合程度；并且，(3)中，还包括：比较(1)和(2)中笼形蛋白与NPC1L1蛋白的结合程度；
其中，如果(2)中笼型蛋白与NPC1L1蛋白的结合程度在统计学上低于(优选显著低于，如低20％，较佳地低40％；更佳地低60％或更低)(1)中笼型蛋白与NPC1L1蛋白的结合程度，则所述候选物质是潜在的降胆固醇物质。
在另一优选例中，(1)或(2)中，还包括：确定细胞中AP2复合体相关蛋白与NPC1L1蛋白的结合程度；并且，(3)中，还包括：比较(1)和(2)中AP2复合体相关蛋白与NPC1L1蛋白的结合程度；
其中，如果(2)中AP2复合体相关蛋白与NPC1L1蛋白的结合程度在统计学上低于(优选显著低于，如低20％，较佳地低40％；更佳地低60％或更低)(1)中AP2复合体相关蛋白与NPC1L1蛋白的结合程度，则所述候选物质是潜在的降胆固醇物质。
在另一优选例中，所述的AP2复合体相关蛋白选自：μ2、σ2、β2或α亚基。更佳的，所述的AP2复合体相关蛋白是μ2亚基。
在另一优选例中，所述的细胞是重组细胞，其基因组中含有表达盒，所述表达盒含有：可操作性连接的NPC1L1蛋白的编码基因和报告基因。
在另一优选例中，所述的报告基因是GFP或EGFP。
在另一优选例中，所述的细胞是真核细胞。
在另一优选例中，通过计量内吞小泡的数量、内吞的NPC1L1蛋白和/或胆固醇的量确定细胞囊泡内吞NPC1L1蛋白的程度；或者，通过计量细胞膜上NPC1L1蛋白和/或胆固醇的量(如发生了内吞，则细胞膜上NPC1L1蛋白和/或胆固醇的量减少)确定细胞囊泡内吞NPC1L1蛋白的程度。
在另一优选例中，通过荧光标记或染色的方法来进行定位或定量。
在另一优选例中，所述的NPC1L1蛋白是一种融合蛋白，其包含NPC1L1蛋白与标签蛋白，且所述的标签蛋白位于NPC1L1蛋白的胞外区域(或囊泡内侧)。
在另一优选例中，所述的标签蛋白位于NPC1L1蛋白的第8跨膜区与第9跨膜区之间。
在另一优选例中，NPC1L1蛋白与标签蛋白通过肽键相连接。
在另一优选例中，所述的NPC1L1蛋白是全长的人NPC1L1蛋白，且所述的标签蛋白位于NPC1L1蛋白上第986位氨基酸(Ser)与第987位氨基酸(Leu)之间。
在另一优选例中，所述的NPC1L1蛋白的氨基酸序列如GenBank登录号FJ481111所示。
在另一优选例中，所述的标签蛋白选自(但不限于)：一个或数个Myc标签蛋白(优选3×Myc)，一个或数个Flag标签蛋白，一个或数个His6标签蛋白，一个或数个T7标签蛋白，一个或数个V5标签蛋白，一个或数个HA标签蛋白，一个或数个GST标签蛋白，或几个标签蛋白的混合使用。
在另一优选例中，所述的标签蛋白选自(但不限于)：荧光素酶，β-gal酶。
在另一优选例中，通过鉴定细胞标签蛋白的定位来确定NPC1L1蛋白的定位，进而确定细胞囊泡内吞NPC1L1蛋白的程度。
在另一优选例中，当标签蛋白大部分定位在细胞膜上，则NPC1L1蛋白也大量定位细胞膜上，细胞囊泡内吞NPC1L1蛋白的程度低；当标签蛋白少部分定位在细胞膜上，则NPC1L1蛋白大量定位在细胞内，细胞囊泡内吞NPC1L1蛋白的程度高。
在另一优选例中，所述通过鉴定细胞标签蛋白的定位来确定NPC1L1蛋白的定位，进而确定细胞囊泡内吞NPC1L1蛋白的程度的方法包括：
(1)在不通透细胞的情况下，标记(优选利用免疫组化的方法)位于细胞膜上的标签蛋白；
(2)在通透细胞的情况下，标记(优选利用免疫组化的方法)全细胞的标签蛋白；
(3)分析或计算(1)中细胞膜上标签蛋白占(2)中全细胞标签蛋白的百分比；如细胞膜上的标签蛋白所占百分比在统计学上明显增加(优选明显增加20％以上，更优选明显增加40％以上，进一步优选明显增加60％以上)，则NPC1L1蛋白定位在细胞膜上的比例明显增加，进而表明细胞囊泡内吞NPC1L1蛋白的程度明显降低。
在另一优选例中，细胞膜上标签蛋白或全细胞标签蛋白的观察或分析定量可利用荧光显微镜或利用流式细胞仪。
在另一优选例中，采用去垢剂处理不通透的细胞，形成通透的细胞。
在另一优选例中，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，选择和确定对于降胆固醇有用的物质。
在本发明的第二方面，提供一种筛选潜在的降胆固醇物质的方法，所述方法包括：
(a)用候选物质处理表达介导NPC1L1内吞的蛋白的细胞；
(b)检测所述细胞中所述蛋白的表达或活性；
其中，若所述候选物质可降低所述蛋白的表达或活性，则表明该候选物质是潜在的降胆固醇物质。
在另一优选例中，步骤(a)包括：在测试组中，将候选物质加入到表达介导NPC1L1内吞的蛋白的细胞中；和/或
步骤(b)包括：检测测试组的细胞中所述蛋白的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达所述蛋白的细胞；
如果测试组中所述蛋白的表达或活性在统计学上低于(优选显著低于，如低20％，较佳地低40％；更佳地低60％或更低)对照组，就表明该候选物是潜在的降胆固醇物质。
在另一优选例中，所述的介导NPC1L1内吞的蛋白是笼形蛋白和/或AP2复合体。
在本发明的第三方面，提供一种抑制NPC1L1蛋白内吞的物质在制备降胆固醇药物中的用途。
在另一优选例中，所述抑制NPC1L1蛋白内吞的物质是抑制笼形蛋白和/或AP2复合体与NPC1L1蛋白相互作用的物质。
在另一优选例中，所述物质是β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁或25-羟胆固醇。
另一方面，还提供一种降低细胞内胆固醇的方法，所述方法包括：抑制(或干扰)笼形蛋白和/或AP2复合体与NPC1L1蛋白相互作用。
另一方面，还提供一种筛选潜在的降胆固醇物质的方法，所述方法包括：
(1)用胆固醇与NPC1L1蛋白的NH₂端结构域接触，检测胆固醇与NPC1L1蛋白的NH₂端结构域的结合情况；
(2)用胆固醇与NPC1L1蛋白的NH₂端结构域接触，并加入候选物质，检测胆固醇与NPC1L1蛋白的NH₂端结构域的结合情况；
其中，如(2)中胆固醇与NPC1L1蛋白的NH₂端结构域的结合强度显著弱于(优选结合强度明显弱20％以上，更优选明显弱40％以上，进一步优选明显弱60％以上)或结合量显著低于(优选结合量明显低20％以上，更优选明显低40％以上，进一步优选明显低60％以上)(1)中胆固醇与NPC1L1蛋白的NH₂端结构域的结合强度或结合量，则所述候选物质是潜在的降胆固醇物质。也即，如所述候选物质能够竞争胆固醇与NPC1L1蛋白的NH₂端结构域的结合，则所述候选物质是潜在的降胆固醇物质。
另一方面，还提供一种筛选潜在的降胆固醇物质的方法，所述方法包括：将候选物质与NPC1L1蛋白的NH₂端结构域接触，检测候选物质与NPC1L1蛋白的NH₂端结构域的结合情况；如候选物质与NPC1L1蛋白的NH₂端结构域发生特异结合，则所述候选物质是潜在的降胆固醇物质。
在另一优选例中，所述的NPC1L1蛋白的NH₂端结构域含有GenBank登录号FJ481111所示序列中第18-260位氨基酸。
另一方面，提供采用如所述的筛选方法筛选获得的物质。
在另一优选例中，所述的物质是25-羟胆固醇或27-羟胆固醇。
另一方面，还提供一种融合蛋白，所述蛋白包含NPC1L1蛋白与标签蛋白，且所述的标签蛋白位于NPC1L1蛋白的胞外区域(或囊泡内侧)。
在另一优选例中，标签蛋白位于NPC1L1蛋白的第8跨膜区与第9跨膜区之间。
另一方面，还提供一种核酸序列，所述的核酸序列编码所述的融合蛋白。
另一方面，还提供一种重组载体，所述的重组载体含有所述的核酸序列。
在另一优选例中，所述的载体以pEGFP-N1载体为基础，其中含有所述的核酸序列。
另一方面，还提供一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有所述的重组载体，或其基因组中整合有所述的核酸序列。
在另一优选例中，所述的宿主细胞是大鼠肝癌细胞。
另一方面，还提供所述的宿主细胞的用途，用于分析NPC1L1蛋白的细胞亚定位。
附图说明
图1.细胞内的胆固醇水平调节NPC1L1蛋白在细胞质膜和内吞循环体之间的循环转运。
A.处理细胞的流程示意图：在-60分钟，用环化糊精(CDX)减少细胞内的胆固醇；然后再在0分钟递给细胞CDX包被的胆固醇。
B.CRL-1601/NPC1L1-EGFP细胞做A中所示的处理，在不同的时间点固定，并用共聚焦显微镜观察荧光定位。Bar，10μm。
C.对B中的细胞荧光定量质膜定位的NPC1L1的量。误差线：标准差。
D和E.CRL-1601/NPC1L1-EGFP(D)和L02细胞(E)做A中所示处理，在不同的时间点标记细胞质膜蛋白，SDS-PAGE分析。TnR，转铁蛋白受体。
图2.NPC1L1蛋白是细胞吸收胆固醇所必需。
A.CRL-1601和CRL-1601/NPC1L1-EGFP细胞做图1A中所示的处理，在不同的时间点固定，Filipin染色，并用双光子共聚焦观察荧光定位。Bar，10μm。
B.对A中的细胞荧光定量质膜定位的NPC1L1的量。误差线：标准差。
C.在L02细胞中用反转录病毒介导的RNAi降低NPC1L1的表达。图示为westernblot结果。
D.CDX处理L02细胞60分钟，用15μg/ml CDX包被的胆固醇处理细胞。在不同的时间点固定，Filipin染色，并用双光子共聚焦显微镜比较NPC1L1降低的细胞和对照细胞的荧光强度。Bar，10μm。DIC表示明场视野。
E.对D中的细胞荧光定量质膜定位的NPC1L1的量。误差线：标准差。
图3.过量表达NPC1L1蛋白增加细胞对胆固醇吸收。
A.CDX处理细胞后，递给CRL1601细胞和CRL1601/NPC1L1-EGFP细胞不同浓度的胆固醇1小时后，封片，Filipin染色，双光子共聚焦显微镜观察；Bar，10μm。
B.A中细胞荧光定量；误差线：标准差。
C.HEK293T细胞转染NPC1L1-EGFP质粒。24小时后用A中方法处理细胞，固定，封片，染色。Bar，10μm。
图4.AP2复合体中μ2亚基作为NPC1L1的结合蛋白的鉴定。
A.用偶联抗EGFP抗体的琼脂糖做免疫共沉淀，得到的蛋白用SDS-PAGE分离，银染；
B.免疫共沉淀(CoIP)验证NPC1L1与μ2的结合。
图5.缺失笼形蛋白/AP2降低NPC1L1蛋白的内吞和胆固醇摄取。
A.Western Blot验证RNAi效率。
B.CRL-1601/NPC1L1-EGFP细胞做图6A中所示的处理，在不同的时间点固定、染色并用双光子共聚焦观察荧光定位。Bar，10μm。
C.对B中的细胞荧光定量胞内定位的NPC1L1和胆固醇的量。误差线：标准差。
图6.siRNA介导的笼型蛋白或者μ2亚基的基因干扰抑制NPC1L1蛋白的内吞和胆固醇的细胞吸收，且呈胆固醇浓度依赖性。
A.处理细胞的示意图。
B.检测RNAi CHC和μ2对转铁蛋白内吞影响，显示RNAi效率。
C.生物素标记细胞膜蛋白实验验证笼型蛋白对NPC1L1蛋白内吞的必要性。
D.笼型蛋白和μ2亚基对NPC1L1蛋白介导胆固醇吸收必须，且呈胆固醇浓度依赖性。
E.D中细胞的荧光定量结果；误差线：标准差。
图7.RNAi沉默caveolin-1不影响NPC1L1蛋白内吞和胆固醇吸收。
A.Western Blot显示RNAi效率。
B.对细胞做图6A中处理；Bar，10μm。
C.B中细胞的荧光定量结果；误差线：标准差。
图8.Ezetimibe通过影响NPC1L1蛋白进入笼形蛋白包被的小泡抑制NPC1L1蛋白和胆固醇内吞。
A.处理细胞的流程示意图：细胞在含有环化糊精的培养基中处理60min。然后在培养基A(含有5％LPDS，10μM compactin，50μM甲羟戊酸)加上Ezetimibe。60min后，CDX包被胆固醇的胆固醇直接加入。在不同的时间点固定，染色。
B.CRL-1601/NPC1L1-EGFP细胞做A中所示的处理，在加入胆固醇60min后固定、染色，并用双光子共聚焦显微镜观察荧光定位。Bar，10μm。
C.对B中的细胞荧光定量胞内定位的NPC1L1蛋白和胆固醇的量。误差线：标准差。
D和F.CRL-1601/NPC1L1-EGFP(D)或L02细胞(F)做A中所示的处理.在不同的时间点进行生物素标记细胞质膜试验。
E.CRL-1601/NPC1L1-EGFP细胞做A中所示的处理，在不同的时间点进行免疫共沉淀试验。
G.L02细胞在含有环化糊精和Ezetimibe的培养基中处理60min。CDX包被胆固醇的胆固醇直接加入60min。固定，染色。用双光子共聚焦观察荧光定位。Bar，10μm。
H.对G中的细胞荧光定量胞内定位的NPC1L1蛋白和胆固醇的量。误差线：标准差。
图9.NPC1L1-NH₂端18-260氨基酸是胆固醇结合NPC1L1蛋白所必需，对胆固醇吸收至关重要。
A.稳定表达人NPC1L1蛋白的细胞用偶联抗EGFP抗体的琼脂糖做免疫沉淀，并在得到的蛋白中加入10-160nM[³H]胆固醇体外结合，4℃，4小时后测液闪检测NPC1L1与胆固醇的结合。非特异性条带为不表达NPC1L1蛋白的细胞重复操作。误差线：标准差。
B.稳定表达人NPC1L1蛋白或NH₂-端第18-260氨基酸缺失的NPC1L1蛋白的细胞用偶联抗EGFP抗体的琼脂糖做免疫沉淀，并在得到的蛋白中加入80nM[³H]胆固醇体外结合，4℃，4小时后测液闪检测该蛋白与胆固醇的结合。非特异性条带为加入10μM未标记胆固醇竞争的重复操作。NPC1L1(Δ18-260aa)：NH₂-端第18-260氨基酸缺失的NPC1L1蛋白。
C.细胞瞬时表达人NPC1L1蛋白或NH₂-端缺失第18-260氨基酸的NPC1L1蛋白，24小时后用CDX处理细胞，并再次递给细胞胆固醇，30分钟，60分钟分别封片，Filipin染色，双光子共聚焦显微镜观察；对细胞内胆固醇的含量和细胞内定位的NPC1L1蛋白进行荧光定量。误差线：标准差。
图10.化合物25-羟胆固醇抑制NPC1L1蛋白和胆固醇结合，减少胆固醇的吸收。
A.胆固醇，25-羟胆固醇的结构示意图。
B.稳定表达人NPC1L1蛋白的细胞用偶联抗EGFP抗体的琼脂糖做免疫沉淀，并在得到的蛋白中加入80nM[³H]胆固醇，以及250nM未标记的25-羟胆固醇进行体外结合-竞争，4℃，4小时后测液闪检测NPC1L1与[³H]胆固醇的结合。非特异性条带为不表达NPC1L1蛋白的细胞重复操作。误差线：标准差。
C.稳定表达人NPC1L1蛋白的细胞系用25-羟胆固醇预处理1小时，之后CDX处理细胞，并再次递给细胞胆固醇，1小时后封片，Filipin染色，双光子共聚焦显微镜观察；对细胞内胆固醇的含量和细胞内定位的NPC1L1蛋白进行荧光定量。误差线：标准差。
图11.在NPC1L1氨基酸序列的986至987位插入3×Myc不影响NPC1L1的正常功能。
A.NPC1L1的拓扑结构模式图以及S986位氨基酸残基的位点。
B.对表达NPC1L1/S986-3×Myc-L987蛋白的细胞去除胆固醇后，再给细胞递送胆固醇并结合Ezetimibe处理，Filipin染色，观察细胞对胆固醇的吸收情况。
C.对B中细胞内的NPC1L1/S986-3×Myc-L987蛋白和胆固醇的定量。误差线：标准差。
图12.用免疫组化或流式细胞快速简便地分析NPC1L1蛋白的亚细胞定位。
A.处理细胞的流程示意图：在-60分钟，用环化糊精(CDX)减少细胞内的胆固醇；然后再在0分钟递给细胞CDX包被的胆固醇。
B.瞬时转染NPC1L1/S986-3×Myc-L987，在通透和不通透细胞两种条件下，用Myc抗体对细胞进行免疫染色后荧光显微镜观察。
C，D.用流式细胞仪检测NPC1L1细胞定位。1.5％环化糊精(CDX)处理1hr后，在4℃条件下，用抗Myc的抗体(9E10)温育30分钟，然后用偶联Alexa555的荧光二抗温育30分钟，流式细胞仪检测。
图13.筛选抑制NPC1L1蛋白内吞的化合物。
A.β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁(C6)的结构式。
B.用CDX和待筛选药物(C1-C187)处理CRL1601/NPC1L1-EGFP细胞，使NPC1L1蛋白定位于细胞膜。拍照，见图中的CDX组。去掉CDX，用含有待筛选药物和胆固醇的配基处理细胞一个小时。拍照，见图中chol组。有明显抑制NPC1L1蛋白内吞的化合物(C6)被选出来。Ez：Ezetimibe。
C.用CDX和待筛选药物(C6)处理CRL1601/NPC1L1-EGFP细胞，使NPC1L1蛋白定位于细胞膜，固定，见图中的CDX组。去掉CDX，用含有待筛选药物和胆固醇的配基处理细胞，固定，见图中chol组。将Filipin染色，用双光子显微镜拍照。
D.荧光定量chol组的细胞内的NPC1L1和胆固醇。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，发现NPC1L1蛋白介导胆固醇吸收需要通过囊泡内吞过程，其中笼形蛋白(Clathrin)和AP2复合体被鉴定出来在NPC1L1蛋白内吞过程中起到重要的作用，抑制笼形蛋白介导的囊泡内吞NPC1L1蛋白(即抑制NPC1L1蛋白进入笼形蛋白包被的囊泡、影响其内吞过程)可显著抑制细胞对胆固醇的吸收。因此，可基于该机制来筛选对于降低胆固醇有用的药物。
NPC1L1蛋白是一个多次跨膜蛋白，在胆固醇吸收中发挥重要的作用。本发明人研究发现胆固醇可以特异的促进NPC1L1蛋白的内吞，可以调节NPC1L1蛋白在质膜和内吞循环体(Endocytic Recycling Compartment，ERC)之间的循环转运，当胆固醇减少时，NPC1L1蛋白定位在细胞质膜，补给细胞胆固醇会使NPC1L1蛋白内吞并转运到内吞循环体。此过程需要笼形蛋白/AP2复合体。阻断笼形蛋白介导的NPC1L1蛋白的内吞会减少胆固醇的吸收，表明NPC1L1蛋白通过囊泡内吞运输来介导胆固醇的运输。Ezetimibe抑制NPC1L1蛋白进入笼形蛋白包被的囊泡、阻断其内吞过程、进而抑制胆固醇的吸收。总之，本发明人的研究表明NPC1L1蛋白携带胆固醇通过笼形蛋白介导的囊泡内吞进入细胞，从而为筛选新型的胆固醇吸收抑制剂提供了新靶点。
细胞吸收胞外物质是通过质膜的变形运动将细胞外物质转运入细胞内的过程(入胞作用)。其吸收的方式是多种多样的，根据入胞机制的不同可将内吞作用分为吞噬作用、胞饮作用、受体介导的内吞作用等。例如笼形蛋白，caveolin，flotillin等均可介导一些物质进入到细胞内。然而，对于不同的物质，入胞的机制可能是不同的，这与细胞本身的结构、细胞所含的蛋白、所述物质本身的特性、以及一些更为复杂的因素相关。为了鉴定参与NPC1L1蛋白内吞过程的蛋白因子，本发明人用免疫共沉淀分离得到了参与NPC1L1蛋白内吞的复合体，用串联质谱鉴定和NPC1L1蛋白特异结合的蛋白。其中一个蛋白是AP2复合体中的μ2亚基。μ2亚基在内吞过程中可以识别将要发生内吞的蛋白，与之结合并募集AP-2的其他亚基。AP-2复合体形成后可以招募笼形蛋白，随之发生内吞。为了验证以上结果，本发明人用siRNA介导的RNA干扰来降低内源的笼形蛋白或者AP-2复合体中的μ2亚基，发现两个基因降低后会影响NPC1L1蛋白的内吞和细胞对胆固醇的吸收。说明NPC1L1蛋白携带胆固醇通过笼形蛋白介导的囊泡内吞进入细胞。
筛选降胆固醇的物质的方法
在得知了NPC1L1蛋白介导胆固醇吸收需要通过笼形蛋白介导NPC1L1的囊泡内吞这一途径，抑制NPC1L1蛋白的囊泡内吞可显著抑制细胞对胆固醇的吸收这一机制后，可以基于该机制筛选降低细胞对胆固醇的吸收的潜在物质。从而，可从所述的潜在物质中找到对于预防或治疗高胆固醇相关疾病有用的物质。
因此，本发明提供一种筛选潜在的降胆固醇物质的方法，所述的方法包括：
(1)用胆固醇处理表达NPC1L1蛋白的细胞，并确定细胞中的囊泡内吞NPC1L1蛋白的程度；
(2)在候选物质存在下，如(1)所述处理表达NPC1L1蛋白的细胞，再次确定细胞中囊泡内吞的NPC1L1蛋白的程度；和
(3)比较(1)和(2)中囊泡内吞的NPC1L1蛋白的差异；
其中，如果(2)中囊泡内吞的NPC1L1蛋白的程度在统计学上低于(1)中，则所述候选物质是潜在的降胆固醇物质。
作为本发明的优选方式，步骤(1)或(2)中，所述的表达NPC1L1蛋白的细胞预先经过降胆固醇处理。本发明人在研究中发现，对细胞预先进行降胆固醇处理后，可使得NPC1L1蛋白从胞内的内吞循环体(ERC)区域被转运到细胞膜区域，为吸收胆固醇作准备；而胆固醇处理可特异地促进NPC1L1蛋白的内吞。因此，药物筛选时，预先对细胞进行降胆固醇处理，之后再给予细胞胆固醇，对于药物筛选时观察笼形蛋白介导的囊泡内吞NPC1L1蛋白是有利的。
作为本发明的优选方式，步骤(1)或(2)中，还包括：确定细胞中笼型蛋白和/或AP2复合体相关蛋白与NPC1L1蛋白的结合程度；并且，(3)中，如果(2)中笼型蛋白和/或AP2复合体相关蛋白与NPC1L1蛋白的结合程度在统计学上低于(1)中，则所述候选物质是潜在的降胆固醇物质。AP2复合体由α，β2，μ2和σ2等亚基组成，其功能是结合蛋白进入笼形蛋白(包括重链和轻链)包被的小泡中参与内吞，因此观察笼型蛋白和/或AP2复合体或其相关蛋白与NPC1L1蛋白的结合程度也可反映NPC1L1蛋白进入笼形蛋白包被的囊泡的程度(或量)。
确定存在或不存在候选物质的情况下内吞或结合程度的差异可以用计量内吞小泡的数量、内吞的NPC1L1蛋白和/或胆固醇的量的增减来实现；或者也可通过计量细胞膜上NPC1L1蛋白和/或胆固醇的量的增减来实现(如发生了内吞，则细胞膜上NPC1L1蛋白和/或胆固醇的量减少)。具体例如可通过荧光标记或染色的方法来进行定位或定量，此外免疫荧光标记细胞表面蛋白结合流式细胞仪是有效定量NPC1L1蛋白细胞膜定位的方法。也可以将细胞种在96孔板中，作相关药物处理后用荧光标记细胞质膜定位的NPC1L1蛋白，然后用酶标仪读数，如果读数高于预设阈值则此药物可以抑制NPC1L1蛋白内吞，可能作为潜在的降胆固醇药物。
如果内吞或结合的差异是显著的或者超过了某个阈值，则候选试剂可能对于降胆固醇是有效的。如果差异不显著，则可以用另一候选物质重复所述步骤进行筛选。通常，本领域技术人员可同时试验多种候选物质，例如通过使用多孔板或其它高通量方法。
本发明提供了一种优选的确定NPC1L1蛋白内吞情况的方式，将标签蛋白偶联或连接于NPC1L1蛋白序列上合适的位置(优选所述的标签蛋白位于NPC1L1蛋白的第8跨膜区与第9跨膜区之间)，通过鉴定细胞质膜上标签蛋白的定位来确定NPC1L1蛋白的定位，进而确定细胞囊泡内吞NPC1L1蛋白的程度。当标签蛋白大部分定位在细胞膜上，则表明NPC1L1蛋白大量定位细胞质膜上，细胞囊泡内吞NPC1L1蛋白的程度小；当标签蛋白少量的定位在细胞质膜上，则表明NPC1L1蛋白大部分定位在细胞内，细胞囊泡内吞NPC1L1蛋白的程度大。
将标签蛋白偶联或连接到NPC1L1蛋白序列上的方法是本领域人员已知的。优选地，NPC1L1蛋白与标签蛋白通过肽键相连接。更优选地，所述的标签蛋白位于NPC1L1蛋白上第986位氨基酸(Ser)与第987位氨基酸(Leu)之间。
标签蛋白的选择是本领域人员已知的，当用于本发明时，长度在4-300个氨基酸的标签蛋白是优选的。所述的标签蛋白选自(但不局限于)：一个或数个Myc标签蛋白，一个或数个Flag标签蛋白，一个或数个His6标签蛋白，一个或数个T7标签蛋白，一个或数个V5标签蛋白，一个或数个HA标签蛋白，一个或数个GST标签蛋白，以及几个标签的混合使用。或者，所述的标签蛋白选自某些酶(但不限于)：荧光素酶，β-gal酶。最优选的，所述的标签蛋白是Myc标签蛋白(特别是3×Myc)。
当NPC1L1蛋白与标签蛋白通过肽键相连接时，构成了一种融合蛋白。编码所述融合蛋白的核酸序列，含有所述核酸序列的重组载体和宿主细胞均包括在本发明中，它们可以作为分析NPC1L1蛋白在细胞中亚定位的材料。
本发明中，对于所用的细胞没有特别的限制，只要在生长或代谢过程中需要吸收胆固醇(例如其需要胆固醇作为生物膜的组成成分；或需要胆固醇来合成甾醇类激素或胆汁酸的前体)；并且，其含有NPC1L1蛋白以及笼形蛋白和/或AP2复合体。较佳的，所述的细胞是一种真核细胞。在本发明的实施方式中，所述的细胞选自：CRL-1601(McArdle RH7777大鼠肝癌细胞)，L02(人肝细胞系)，HuH7(人肝癌细胞系)，或HEK293细胞等。
作为本发明的优选方式，所述的细胞是重组细胞，其基因组中含有表达盒，所述表达盒含有：可操作性连接的NPC1L1蛋白的编码基因和报告基因。所述的报告基因例如是绿色荧光蛋白(GFP)或增效的绿色荧光蛋白(EGFP)，它们的内源荧光基团在受到紫外光或蓝光激发时可高效发射清晰可见的绿光，从而可直观且准确地用于NPC1L1蛋白的定位和定量。
基于本发明人的新发现，另一种筛选潜在的降胆固醇物质的方法包括：
(a)用候选物质处理表达笼形蛋白和/或AP2复合体的细胞；
(b)检测所述细胞中笼形蛋白和/或AP2复合体的表达或活性；
其中，若所述候选物质可降低笼形蛋白和/或AP2复合体的表达或活性，则表明该候选物质是潜在的降胆固醇物质。
作为一种优选的方式，在进行筛选时，为了更易于观察到笼形蛋白和/或AP2复合体表达或活性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达笼形蛋白和/或AP2复合体的细胞。
作为一种优选的方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，选择和确定对于降胆固醇有用的物质。
采用所述筛选方法获得的潜在的降胆固醇物质也包括在本发明内。
降胆固醇的物质
基于本发明人的新发现，本发明还提供了一种抑制或干扰细胞囊泡内吞NPC1L1蛋白的物质，所述的物质可用于制备对于降胆固醇有用的药物。任何可抑制或干扰细胞囊泡内吞NPC1L1蛋白的物质均可用于本发明，作为潜在的降胆固醇物质。
基于本发明人的新发现，本发明还提供了一种抑制(或干扰)笼形蛋白和/或AP2复合体与NPC1L1蛋白相互作用(如结合)的物质，所述的物质可用于制备对于降胆固醇有用的药物。任何可抑制或干扰笼形蛋白和/或AP2复合体与NPC1L1蛋白相互作用，降低笼形蛋白和/或AP2复合体与NPC1L1蛋白相互作用的稳定性，抑制笼形蛋白和/或AP2复合体的表达，或抑制笼形蛋白和/或AP2复合体相关基因的转录或翻译的物质均可用于本发明，作为潜在的降胆固醇物质。
这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于预防或治疗高胆固醇相关疾病确定有用的物质。
利用本发明的筛选方法，本发明人获得了一种可以抑制NPC1L1蛋白内吞的化合物--β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁。因此，本发明还提供了β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁在制备降胆固醇药物中的用途。
此外，本发明还提供一种降低细胞内胆固醇的方法，所述方法包括：抑制(或干扰)笼形蛋白和/或AP2复合体与NPC1L1蛋白相互作用(如内吞、结合或结合)，从而阻止胆固醇的吸收。
本发明的主要优点在于：
(1)首次发现，NPC1L1蛋白介导胆固醇吸收需要通过笼形蛋白介导的囊泡内吞NPC1L1蛋白这一途径，抑制笼形蛋白介导的囊泡内吞NPC1L1蛋白可显著抑制细胞对胆固醇的吸收。
(2)解决了现有技术中不知道细胞内NPC1L1蛋白通过怎样的途径来转运胆固醇、难以开发更多更有效药物的缺陷，从而为筛选降胆固醇药物提供了新的便捷的途径。
(3)发展了快速简便分析NPC1L1蛋白亚细胞定位的方法，可以用于高通量化合物筛选。
(4)鉴定出NPC1L1蛋白结合胆固醇的结构域并阐明其功能，可以筛选结合该结构域的化合物从而得到抑制胆固醇吸收活性的物质。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
试验材料和方法
材料和质粒
辣根过氧化物酶结合的驴抗鼠和抗兔1gG：获自Jackson免疫研究实验室。
菲律宾菌素(Filipin)获自Sigma。
sulfosuccinimidyl 6-(生物素氨基)hexanoate和NeutrAvidin-琼脂糖：获自Pierce。
甲基-β-环化糊精(CDX)：获自Cyclodextrin Technologies Development Inc.。
胆固醇纯化为高于99％的纯度。
去脂血清(LPDS，d＞1.215g/ml)：从新生小牛血清通过超离心获得。
人源NPC1L1蛋白的编码区来自以5’-actggatccatggcggaggccggcctgagg-3’(SEQ IDNO：1)和5’-actggatccgaactgccgcccattgttggg-3’(SEQ ID NO：2)作为引物，PCR扩增人肝cDNA获得，并通过bamHI单酶切位点克隆接入载体pEGFP-N1(购自Clontech)。以5’-actgaattctatgggcacccgcgacgacga-3’(SEQ ID NO：3)和5’-actgaattcttagatgttctgacagcact-3’(SEQ ID NO：4)作为引物，并通过EcoRI单酶切位点克隆接入载体pDsRed-monomer-C1(购自Clontech)。
细胞培养
CRL-1601(McArdle RH7777大鼠肝癌细胞)，L02(人肝细胞系)和HuH7(人肝癌细胞系)(均购自ATCC)单细胞层在37℃和5％CO₂中，细胞生长在培养基A(Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基，含有100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素)再加上10％FBS。胆固醇-缺陷(depleting)培养基是培养基A加上5％去脂血清(LPDS)，10μM美伐他汀(compactin)，50μM甲羟戊酸(mevalonate)和1.5％环化糊精(CDX)。胆固醇-补充(replenishing)培养基含有培养基A加上5％LPDS，10μM美伐他汀，50μM甲羟戊酸和不同浓度的CDX包被的胆固醇。CDX包被甾醇的方法见已有报道(Brown，A.J等(2002)，Cholesterol addition to ER membranes alters conformation of SCAP，the SREBPescort protein that regulates cholesterol metabolism.Mol.Cell 10，237-245)。
生物素标记细胞质膜蛋白
用PBS洗细胞两遍，加入1mg/ml的生物素(sulfosuccinimidyl 6-(生物素氨基)hexanoate)4℃标记40min。缓冲液A(20mM Tris-HCl(pH8.0)和150mM NaCl)洗2遍细胞然后将细胞置于缓冲液A 15min。将细胞裂解于缓冲液B(10mM Tris-HCl(pH8.0)，150mM NaCl和1％NP-40)。每个样品加100μl 50％(v/v)NeutrAvidin-琼脂糖，4℃结合过夜。琼脂糖珠用缓冲液B洗3遍。然后将琼脂糖珠于上样缓冲液37℃中温浴30min。离心取上清，走SDS-PAGE。
RNA干扰
双链siRNA由Genepharma合成。靶向大鼠笼形蛋白重链(CHC)的siRNA参见Radulescu，A.E.等(2007)，A role for clathrin in reassembly of the Golgi apparatus.Mol.Biol.Cell 18，94-105。靶向大鼠AP2-μ2亚基和Caveolin-1的siRNA序列分别是5’-aaggcatgaaggaatcacaga-3’(SEQ ID NO：5)和5’-aagcaagtgtacgacgcgcac-3’(SEQ IDNO：6)。靶向VSV-G的siRNA参见Song，B.L.(2007).Ufd1 is a cofactor of gp 78 and playsa key role in cholesterol metabolism by regulating the stability of HMG-CoA reductase.Cell Metab 6，115-128，用作对照(Control siRNA)。siRNA转染见Sever，N.等(2003)，Insig-dependent ubiquitination and degradation of mammalian 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase stimulated by sterols and geranylgeraniol.J.Biol.Chem.278，52479-52490。
Filipin染色
配制新鲜5mg/ml Filipin储液。细胞固定后用50μg/ml Filipin染色30min。Filipin信号用Zeiss LSM 510 confocal microscope双光子观察，激发光720nm。
免疫共沉淀
将细胞进行相关处理后，裂解于IP缓冲液中(PBS，5mM EGTA，5mMEDTA，0.5％Digitonin)。离心取上清和含有GFP抗体的琼脂糖珠混合，4℃结合2小时。去上清，用IP缓冲液洗琼脂糖珠5遍。用PH2.8的醋酸/甘氨酸洗脱液洗脱。-70℃丙酮沉淀过夜，离心弃上清。将沉淀溶于上样缓冲液，SDS-PAGE分析。
荧光定量
在每次实验里的每个实验组中，任意选择100个细胞作为定量对象。用Image ProPlus 5.01软件荧光定量。细胞总的荧光强度定量的方法是用AOI选择该细胞，计算荧光强度后剪去背景。细胞内的荧光强度定量的方法是用AOI紧贴着细胞膜下画一个圈，定量圈内的荧光强度。图中显示的是细胞内荧光强度比细胞总的荧光强度。
[³H]胆固醇结合实验
将细胞进行相关处理后，裂解于结合IP缓冲液中(PBS，1％NP-40，5mM EGTA，5mM EDTA)。离心取上清和含有EGFP抗体的琼脂糖珠混合，4℃结合2小时，进行免疫沉淀。用结合物IP缓冲液洗琼脂糖珠5遍，分别加入合适浓度的[³H]标记的胆固醇，最终[³H]标记的胆固醇浓度为10-400nM，最终体积为100μl，溶解在结合缓冲液(PBS，0.001％NP-40)中。4℃结合4小时，用结合缓冲液洗琼脂糖珠5遍，用PH2.8的醋酸/甘氨酸洗脱液洗脱。结合的[³H]标记的胆固醇用闪烁液测液闪计数。对于竞争实验，在溶解好[³H]标记的胆固醇的结合缓冲液中，分别加入终浓度为10μM非同位素标记的甾醇。其中，[³H]标记的胆固醇购自PerkinElmer公司。
流式细胞检测
将细胞进行相关处理，胰酶消化后，吹散成单细胞。然后与Anti-Myc单克隆抗体IgG-9E10在冰上孵育30分钟，PBS洗两遍。Anti-mouse IgG荧光二抗孵育30分钟后，PBS洗两遍。用BD LSR II SORP流式细胞仪分析。其中，Anti-Myc单克隆抗体IgG-9E10购自Roche公司，Anti-mouse IgG荧光二抗购自invitrogen公司。
实施例1胆固醇调节NPC1L1蛋白在内吞循环体(ERC)和细胞质膜之间的转运
将含有NPC1L1蛋白编码区的pEGFP-N1载体转染大鼠的肝细胞系CRL1601，获得稳定表达NPC1L1-EGFP的稳定表达株，命名为CRL1601/NPC1L1-EGFP。
常规的Western Blot实验结果表明，NPC1L1-EGFP在稳定表达株中的表达量和一些人肝细胞系(HepG2，huh7和L02)中内源NPC1L1蛋白的表达量类似。因此本发明人用这个细胞株来研究NPC1L1蛋白的定位。
处理CRL1601/NPC1L1-EGFP细胞的流程见图1A，在-60min用胆固醇(Chol)-缺陷培养基培养细胞，在0min除去前述培养基，换用胆固醇(Chol)-补充培养基培养细胞，直至第120min。也即先用CDX减少细胞内的胆固醇，然后再递给细胞CDX包被的胆固醇。
在前述处理细胞的过程中，在不同的时间点固定细胞，并用共聚焦观察荧光定位。结果发现，在正常条件下NPC1L1蛋白主要定位在核旁的区域。当胆固醇减少时NPC1L1蛋白被转运到细胞质膜(图1B，时间从-60至0min)。当再递给胆固醇的时候。NPC1L1蛋白又内吞到细胞内并最终定位到ERC(图1B，时间从30至120min)。NPC1L1蛋白在细胞质膜上的定位见图1C。
将CRL-1601/NPC1L1-EGFP细胞作图1A中所示处理，在不同的时间点标记细胞质膜蛋白。从而用生物素标记质膜蛋白的方法肯定了以上的现象，见图1D。
为了排除细胞克隆之间的影响，本发明人在L02细胞中用生物素标记质膜蛋白的方法检测了不同条件下内源NPC1L1蛋白的定位。结果表明内源的NPC1L1蛋白也同样受到胆固醇水平的调控，见图1E。这说明CRL1601/NPC1L1-EGFP稳定表达的NPC1L1蛋白可以模拟内源NPC1L1蛋白的特性。
实施例2NPC1L1蛋白对游离胆固醇的吸收是必须的
细胞吸收低密度脂蛋白(LDL)中的胆固醇是通过LDL受体的内吞来实现的。NPC1L1蛋白的内吞提示NPC1L1蛋白可能通过类似的过程介导胆固醇的吸收。为了验证这个想法，本发明人用Filipin来染细胞内的胆固醇。CRL-1601和CRL-1601/NPC1L1-EGFP细胞作图1A中所示的处理，在不同的时间点固定，Filipin染色，并用双光子共聚焦观察荧光定位。结果如图2A所示，用环化糊精(CDX)处理细胞来降低胆固醇后，几乎看不到Filipin的信号，说明细胞内胆固醇的量很低；与此同时NPC1L1蛋白也定位在细胞质膜(时间点为0min)。用递给胆固醇的培养基处理细胞可以看到细胞内Filipin信号逐渐增强，提示胆固醇增多。并且，CRL1601/NPC1L1-EGFP细胞对胆固醇的吸收多于对照的CRL-1601细胞(时间点从30-120min)。随着NPC1L1蛋白的内吞，胆固醇也发生内吞。含有NPC1L1蛋白的囊泡和胆固醇的囊泡有很好的共定位。荧光定量表明CRL1601/NPC1L1-EGFP细胞摄取的胆固醇是对照细胞的两倍(图2B，时间点从30-120min)。用不同浓度(7.5μg/ml，15μg/ml，30μg/ml)的胆固醇递给细胞也得到了类似的结果(图3A和B)。
为了进一步确认以上现象，本发明人将含有NPC1L1蛋白编码区的pEGFP-N1载体转染HEK293T细胞，在HEK293T细胞中瞬时表达NPC1L1-EGFP。发现NPC1L1-EGFP的定位也受到调控，而且过表达NPC1L1-EGFP的细胞比对照的细胞吸收更多的胆固醇(图3C)。
本发明人接下来用反转录病毒介导的RNAi来减少L02细胞内源的NPC1L1蛋白的表达，由图2C可知，RNAi可有效减低细胞内NPC1L1蛋白的表达。发现当NPC1L1蛋白表达降低后，胆固醇的摄取也降低了60％左右(图2D-E)。在Huh7细胞中也得到了类似的效果。
此外，本发明人也观察了胆固醇的外排，发现NPC1L1蛋白并不影响胆固醇外排。
实施例3缺失笼形蛋白/AP2降低NPC1L1蛋白的内吞和胆固醇摄取
为了寻找参与NPC1L1蛋白内吞的因子，本发明人进行了大量的免疫共沉淀。对于NPC1L1蛋白特异性的条带用串联质谱进行了鉴定。其中一个蛋白是AP2复合体的μ2亚基。AP2复合体由α，β2，μ2和σ2等组成，已知其功能是结合蛋白进入笼形蛋白包被的小泡中参与内吞。免疫共沉淀验证了质谱的结果，说明NPC1L1-EGFP，μ2和CHC在同一个复合体中，见图4。
对图4A中各NPC1L1蛋白结合蛋白(Band1-7)的质谱鉴定见表1，其中Band5是AP2复合体的μ2亚基。
表1

接下来本发明人用RNAi方法来降低内源μ2和CHC的表达，Western blot验证RNAi干扰效率(图5A)。RNAi μ2和CHC抑制了转铁蛋白(Tranferrin，TnR)的内吞，说明RNAi有效(图6B)。
将CRL-1601/NPC1L1-EGFP细胞作图6A中所示的处理，在不同的时间点固定、染色并用双光子共聚焦观察荧光定位。对NPC1L1蛋白内吞分析发现NPC1L1蛋白的内吞也依赖于此途径，RNAiμ2或者CHC会抑制50％NPC1L1蛋白的内吞和胆固醇的摄取(图5B)。用生物素标记细胞质膜的实验也证明了以上结论(图5C)。生物素标记细胞膜蛋白实验还证明，笼型蛋白对NPC1L1蛋白内吞是必要的(图6C)。
进一步试验还发现，当递给细胞不同浓度(7.5μg/ml，15μg/ml，30μg/ml)的胆固醇时，RNAi μ2或者CHC也会抑制NPC1L1蛋白的内吞和胆固醇摄取(图6D-E)。
此外，RNAi沉默降低内源的Caveolin-1的表达不影响NPC1L1蛋白和胆固醇的内吞(图7)。
实施例4Ezetimibe抑制NPC1L1蛋白和胆固醇内吞
Ezetimibe是胆固醇吸收的有效的抑制剂，而且已被认可到临床治疗高胆固醇血症。并且已知NPC1L1蛋白结合Ezetimibe。但是Ezetimibe怎样抑制NPC1L1蛋白介导胆固醇的吸收还不明确。
本发明人用CDX降低细胞内的胆固醇使NPC1L1蛋白定位在细胞质膜，用不同浓度的药物(Ezetimibe或U18666A)处理细胞后再给细胞递送胆固醇(图8A)。发现随着Ezetimibe浓度的提高，NPC1L1蛋白的内吞受到抑制，胆固醇的摄取也减少(图8B、C)。U18666A是影响LDL来源的胆固醇运输的药物，其靶点可能是NPC1，其不影响NPC1L1蛋白的内吞。
用生物素标记质膜蛋白的方法也证明了以上的现象(图8D)，Ezetimibe不影响转铁蛋白受体的内吞。说明Ezetimibe的作用是特异的。
接下来的免疫共沉淀试验表明，Ezetimibe胆固醇诱导的NPC1L1蛋白的内吞是通过抑制NPC1L1蛋白进入笼形蛋白包被的小泡来实现的(图8E)。在L02细胞中内源的NPC1L1蛋白的内吞和胆固醇的摄取也受到Ezetimibe的抑制(图8F、G、H)。
总之，Ezetimibe通过抑制NPC1L1蛋白进入笼形蛋白包被的小泡来抑制NPC1L1蛋白的内吞和胆固醇的摄取。
实施例5NPC1L1蛋白的NH₂-结构域(18-260氨基酸)结合胆固醇，对胆固醇吸收至关重要
为了检测NPC1L1蛋白是否结合胆固醇，发明人利用免疫沉淀的方法从CRL1601/NPC1L1-EGFP细胞中纯化出其羧基端带有EGFP的人全长的NPC1L1蛋白(GenBank登录号：FJ481111)，再加入[³H]标记的胆固醇后，检测NPC1L1蛋白能结合[³H]胆固醇，如图9A所示，随着[³H]胆固醇量的增加，NPC1L1蛋白与[³H]胆固醇的结合呈饱和曲线，该结果表明NPC1L1蛋白特异性结合胆固醇分子。
进而，本发明人采用常规方法将NPC1L1蛋白NH₂端区域(18-260氨基酸)进行缺失，发现缺失氨基酸18-260显著影响NPC1L1蛋白结合胆固醇的能力，这表明NPC1L1蛋白NH₂端区域的18-260氨基酸是胆固醇结合结构域(图9B)。
为了研究NPC1L1蛋白NH₂端18-260氨基酸结构域对胆固醇吸收的影响，在大鼠肝细胞CRL-1601中，分别瞬时转染表达人NPC1L1-EGFP蛋白，或NH₂-端18-260氨基酸缺失的人NPC1L1-EGFP蛋白，在不同的时间点进行固定，filipin染色，并用双光子共聚焦显微镜观察。通过对各个时间点细胞内胆固醇含量，以及胞内NPC1L1蛋白进行定量分析，发现全长NPC1L1蛋白逐渐回到细胞内，同时吸收大量胆固醇进入细胞；而表达NH₂-端18-260氨基酸缺失NPC1L1蛋白回到细胞内及介导的胆固醇吸收都显著减少(图9C)。表明人NPC1L1蛋白NH₂-端结构域(18-260氨基酸)能够结合胆固醇分子，并且对于胆固醇吸收至关重要。
实施例6化合物25-羟胆固醇抑制NPC1L1蛋白和胆固醇结合，进而减少胆固醇的吸收
由于NPC1L1蛋白能够与胆固醇特异性结合，本发明人设想，如果找到一种化合物竞争NPC1L1蛋白与胆固醇的结合，就能起到抑制胆固醇吸收的作用。根据这个假说，发明人发现25-羟胆固醇(结构见图10A)，能够竞争[³H]标记的胆固醇与NPC1L1蛋白的结合(图10B)。
进一步，用25-羟胆固醇处理CRL-1601/NPC1L1-EGFP细胞，在不同的时间点固定、染色并用双光子共聚焦显微镜观察荧光定位，通过对细胞内胆固醇含量及细胞内NPC1L1蛋白的定位进行定量分析，发现25-羟胆固醇能够显著抑制胆固醇的吸收及NPC1L1蛋白的内吞(图10C)。
综上所述，化合物25-羟胆固醇能够通过竞争胆固醇与NPC1L1的结合，从而抑制细胞对胆固醇的摄取。因此，NPC1L1蛋白的NH₂-结构域(18-260氨基酸)可以作为筛选胆固醇吸收抑制剂的靶点；25-羟胆固醇及其类似物可能作为新的胆固醇吸收抑制剂。
实施例7在NPC1L1氨基酸序列的986和987位插入3×Myc后，NPC1L1仍具有正常的生理功能
为了进一步研究NPC1L1的拓扑结构和功能，本发明人经过大量探索，鉴定出在NPC1L1蛋白的第986位氨基酸残基后插入3×Myc标签不影响NPC1L1的转运和对胆固醇的吸收(图11，12)。
正常培养条件下，NPC1L1/S986-3×Myc-L987主要定位在细胞核旁的区域(图11B，-60min)。当用1.5％的环化糊精处理细胞1个小时(图12B，0min)，使细胞胆固醇水平降低，NPC1L1/S986-3×Myc-L987蛋白被转运到细胞质膜。当再给细胞递送环化糊精包被的胆固醇1个小时后，NPC1L1/S986-3×Myc-L987又内吞到细胞质内并定位到ERC(图12B，60min)。该循环定位与野生型的NPC1L1相一致。
为了更进一步验证NPC1L1/S986-3×Myc-L987蛋白对胆固醇吸收的功能是否正常，本发明人用Filipin染色的方法来定量细胞内的胆固醇。首先用环化糊精去除细胞膜的胆固醇，然后再递送胆固醇，用Filipin染色观察胆固醇的吸收情况。如图11B，11C所示，在没有Ezetimibe存在的条件下，NPC1L1/S986-3×Myc-L987能够携带大量胆固醇进入细胞。在10μM Ezetimibe处理的条件下，NPC1L1/S986-3×Myc-L987部分被内吞进细胞质，胆固醇也部分被吸收。然而当用40μM Ezetimibe处理细胞，NPC1L1/S986-3×Myc-L987完全被抑制在细胞质膜上，胆固醇同时不能被内吞进入细胞。
因此，NPC1L1/S986-3×Myc-L987与野生型NPC1L1表现出相同的特性，即细胞内的胆固醇水平调节NPC1L1蛋白在细胞质膜和内吞循环体之间的循环转运，这一蛋白能介导胆固醇的吸收，并且吸收过程能被Ezetimibe特异性抑制。
本实施例所用的细胞是CRL1601，用瞬时转染的方法转染入含有NPC1L1/S986-3×Myc-L987表达框的pEGFP-N1质粒。
实施例8用免疫组化、流式细胞检测的方法分析NPC1L1在细胞内的定位
根据发明人对NPC1L1拓扑结构的研究，发明人认为，当NPC1L1/S986-3×Myc-L987蛋白转运到细胞质膜上时，3×Myc标签将会暴露到细胞外基质。如果不通透的细胞(不通透是指不通透细胞膜，在此条件下，外界小分子(如抗体)不能进入细胞内，抗体只标记细胞膜表面的NPC1L1，不能标记细胞内的NPC1L1)与抗Myc的抗体孵育，只有细胞膜上的NPC1L1/S986-3×Myc-L987可以被Myc抗体检测，因此可以利用这一特点来标记细胞膜上的NPC1L1。
如图12B所示，在没有通透的细胞中加入Myc抗体，然后用荧光标记的二抗检测，只有细胞膜上的NPC1L1/S986-3×Myc-L987被检测(图12B，0min)，细胞内的NPC1L1/S986-3×Myc-L987则不能被检测到(图12B，-60min和60min)。而在完全通透的细胞(通透是指在细胞膜上打孔，这样外界的小分子(如抗体)就能进入细胞膜，因此能够标记细胞内和细胞膜表面的NPC1L1蛋白)中，细胞内外的NPC1L1/S986-3×Myc-L987都可以被抗Myc抗体检测到(图12B，通透细胞染色)。该方法可以快速简便地分析NPC1L1的亚细胞定位。
为了对NPC1L1的蛋白定位更深入研究，发明人将含有NPC1L1/S986-3×Myc-L987蛋白编码框的pEGFP-N1载体转染大鼠的肝细胞系CRL1601，获得稳定表达NPC1L1/S986-3×Myc-L987-EGFP的细胞株，命名为CRL1601/NPC1L1/S986-3×Myc-L987-EGFP。利用CRL1601/NPC1L1/S986-3×Myc-L987-EGFP细胞，发明人用流式细胞仪分析了在环化糊精(CDX)抽提胆固醇前后，NPC1L1/S986-3×Myc-L987-EGFP蛋白的细胞亚定位变化。可以很明显的发现，CDX处理后，细胞膜上的NPC1L1/S986-3×Myc-L987-EGFP的量明显增加(图12C，D)。这又是一种快速简便地分析NPC1L1蛋白亚细胞定位的方法。
通透细胞的制备方法本领域已知，本实施例中，采用0.1-0.2％的Triton X 100处理细胞5分钟，获得通透细胞。
实施例7至实施例8表明，发明人构建了一个新的带有3×Myc标签的NPC1L1蛋白表达质粒，当表达的NPC1L1定位在细胞膜上时，3×Myc标签会暴露在细胞外基质。利用这一特点，发明人用免疫组化的方法标记膜上的NPC1L1蛋白，并且利用流式细胞检测也能简便的鉴定NPC1L1的亚细胞定位。因此，本发明人成功创建了一种新的分析NPC1L1亚细胞定位的方法，利用这一方法，能够快速简便地识别出NPC1L1在细胞内的定位。这一方法的建立，为高通量分析NPC1L1在细胞内的定位奠定了基础。
实施例9药物筛选方法
一.筛选方法如下：
1.初筛
以约20种化合物为一次筛选，将表达NPC1L1-EGFP的细胞种于12孔板；
48小时后用CDX处理细胞，减少细胞内的胆固醇，使NPC1L1蛋白定位于细胞膜；
用待选药物处理细胞一个小时；
将含有待选药物的培养基中加入CDX包被的胆固醇；
一个小时后观察NPC1L1蛋白的定位，找出影响NPC1L1蛋白定位的药物。
结果，本发明人在最初筛选的180多种化合物中发现了一个可以抑制NPC1L1蛋白内吞的化合物：β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁(β，β-DIMETHYLACRYL ALKANNIN，C6)(图13A-B)。
2.细筛
选择初筛中的阳性药物，用前述类似的方法处理细胞；
在不同的时间点固定，Filipin染色和封片；
用双光子显微镜观察，拍照，荧光定量细胞内的NPC1L1和胆固醇(图13C-D)。可见，β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁(C6)，可以抑制大概50％左右的NPC1L1的内吞和胆固醇的吸收。所以β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁可以作为一个潜在的抑制胆固醇吸收的化合物。
二.筛选方法如下：
本筛选方法采用的细胞是CRL1601，其中转染入含有NPC1L1蛋白的NH₂-结构域(18-260氨基酸)表达框的pEGFP-N1质粒，从而使细胞稳定表达NPC1L1蛋白的NH₂-结构域(18-260氨基酸)-EGFP，所述细胞命名为CRL-1601/NPC1L1(18-260)-EGFP，细胞裂解后，利用抗EGFP抗体免疫纯化得到NPC1L1(18-260)-EGFP蛋白，并在蛋白中加入[³H]标记的胆固醇，将上述制得的混合样品分为两组：
测试组：NPC1L1(18-260)-EGFP蛋白，其中加入候选物质；
对照组：NPC1L1(18-260)-EGFP蛋白，其中不加入候选物质。
检测两组中[³H]标记的胆固醇与NPC1L1蛋白的NH₂端结构域(18-260氨基酸)的结合情况，如测试组中胆固醇与NPC1L1蛋白的NH₂端结构域的结合量显著低于对照组中[³H]标记的胆固醇与NPC1L1蛋白的NH₂端结构域的结合量(低30％以上)，则所述候选物质是降胆固醇物质。
以25-羟胆固醇或27-羟胆固醇作为候选物质，结果发现，它们均能够竞争性地与NPC1L1蛋白的NH₂-结构域(18-260氨基酸)结合，从而抑制胆固醇与NPC1L1蛋白的NH₂-结构域(18-260氨基酸)的结合。
讨论
本发明人的数据表明Ezetimibe通过抑制NPC1L1蛋白的内吞来抑制胆固醇的吸收。其分子机制是Ezetimibe影响NPC1L1蛋白进入笼形蛋白包被的小泡。有趣的是Ezetimibe不影响转铁蛋白和LDL的内吞。这些结果均表明Ezetimibe是NPC1L1蛋白有效和特异的抑制剂。但是Ezetimibe怎样影响NPC1L1蛋白进入笼形蛋白包被的小泡还不知道。要阐明此问题，本发明人从NPC1L1蛋白内吞的初始阶段入手。NPC1L1蛋白含有甾醇感受结构域。人基因组中有6个蛋白含有此结构域：HMGCR，SCAP，NPC1，Patched，TRC8，和NPC1L1。可以推测NPC1L1蛋白的甾醇感受域可能直接结合胆固醇，通过构象变化从而与笼形蛋白/AP2复合体结合导致内吞。Ezetimibe可能竞争胆固醇与NPC1L1蛋白的结合。另一种可能是Ezetimib会影响NPC1L1蛋白的构象导致胆固醇不能促进NPC1L1蛋白与笼形蛋白/AP2复合体结合。Ezetimibe也可能影响NPC1L1蛋白周围的胆固醇的分布导致NPC1L1蛋白内吞的阻抑。
人通过从头合成和食物吸收获得胆固醇。与抑制胆固醇合成的药物(如：他汀类)相比，Ezetimibe是市场上唯一的抑制胆固醇吸收的药物。由于不同的个体基因型的差异导致不同人对Ezetimibe的敏感程度不同。因此，寻找更多的胆固醇吸收抑制剂显得尤为重要。本发明人的工作揭示了胆固醇吸收的分子机制，可以为新药筛选奠定生物学基础。同时，本发明人建立的细胞水平观察NPC1L1蛋白亚细胞定位的系统可以用于筛选NPC1L1蛋白内吞的抑制剂，这些抑制剂具有抑制胆固醇吸收药物的可能性。
细胞从外界物质交换主要通过四种方式：自由扩散、协助扩散、主动运输和胞吞和胞吐。其中自由扩散是疏水和简单的小分子直接通过细胞质膜磷脂双分子层，此过程不需要蛋白参与；协助扩散是细胞质膜上的通道蛋白介导的小分子从浓度高的一侧到低的一侧，如离子通道等；主动运输需要消耗能量，其也是蛋白介导的，如离子泵等；胞吞是通过细胞质膜的内陷介导的物质交换，包括吞噬作用和胞饮，胞饮又包括网格蛋白介导的内吞，caveolin介导的内吞和其他未知形式的内吞。
协助扩散和主动运输的介导蛋白是通道蛋白，其特点是此类蛋白是单体或者多聚体在细胞膜形成通道，让物质直接进出细胞膜，这些物质多为单分子小物质如水、葡萄糖和氨基酸等。内吞是通过细胞膜上的受体介导的。
LDL受体是胆固醇运输和内吞常见的分子受体，其特征是一次跨膜的膜蛋白。它的胞外区域可以结合LDL或者VLDL，然后通过胞质内一些特殊的motif募集内吞相关的蛋白进行内吞。而对于NPC1L1来说，它含有大概13次跨膜区域，而且NPC1L1促进的是单分子物质胆固醇的吸收，因此无论是在拓扑结构和配体方面，NPC1L1和LDL受体都大不相同，因此通常人们不会认为NPC1L1的功能和LDL受体类似。有意思的是参与胆固醇外排的蛋白ABCG5/8是由两个六次跨膜的蛋白组成的双分子复合体，其拓扑结构和NPC1L1有类似之处。有预测ABCG5/8通过类似于泵的方式通过水解ATP来外排胆固醇，与ABCG5/8很相似的ABCG1和ABCA1也被推测是分子泵。NPC1是和NPC1L1同源性很高的蛋白(同源性50％)，其拓扑结构和NPC1L1非常相似。NPC1在胆固醇从溶酶体向外(内质网和质膜)运输过程中起到关键作用。有报道表明体外表达的NPC1蛋白有泵脂肪酸的能力，但是不能泵胆固醇。结合ABCG5/8和NPC1研究，本领域人员通常很自然会推测NPC1L1可能是一个分子泵，通过向细胞内泵胆固醇来促进胆固醇的吸收。
而本发明人的实验结果却恰恰出乎意料。首先是如果NPC1L1是一个分子泵，那么无论在人体内还是细胞培养中，游离的单分子胆固醇将是最有效的底物。但是在人体中胆固醇要和胆汁酸形成micelle才能被有效吸收，而且在细胞培养中用CDX包被的胆固醇比游离的胆固醇更容易被NPC1L1吸收；其次，如果NPC1L1是一个分子泵，那么当给细胞胆固醇时，应该看到胆固醇先进入细胞，但是本发明人看到的是NPC1L1和胆固醇同时进入细胞内；最后，如果NPC1L1是一个分子泵，无论用微丝抑制剂还是沉默网格蛋白来降低NPC1L1内吞，都将增加胆固醇的吸收，但是本发明人看到的是胆固醇吸收也被抑制住了。这些结果不但不支持NPC1L1是分子泵的假说，反而证明了NPC1L1介导的胆固醇的吸收是类似于LDL受体内吞的方式。其实在NPC1的报道中不难看出在NPC1的体外实验中的分子泵底物是脂肪酸而不是其生理条件下的底物胆固醇，这说明NPC1在体内运输胆固醇的方式不像是分子泵，况且游离的单分子胆固醇对细胞有毒性，如果NPC1或者NPC1L1直接将游离单分子胆固醇泵入细胞质中，对细胞健康十分不利。
以上说明NPC1L1类似于胆固醇的受体，NPC1L1通过囊泡内吞的方式吸收胆固醇。目前现有技术中没有任何证据说明NPC1L1是胆固醇的受体而不是胆固醇通道，也没有说明当NPC1L1蛋白定位于细胞膜时是怎样吸收胆固醇的。并且现有技术中还没有提出具体的将NPC1L1蛋白作为靶点来筛选降胆固醇药物的方案。本发明第一次揭示了从NPC1L1蛋白的功能入手来筛选潜在降胆固醇物质，这比体外结合实验更可靠。正是由于首次揭示了NPC1L1蛋白通过囊泡内吞途径吸收胆固醇，所以本发明人才提出该发明，即通过分析NPC1L1蛋白内吞来筛选潜在的降胆固醇物质，并且筛选获得了一种活性化合物。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>中国科学院上海生命科学研究院
<120>基于分析NPC1L1蛋白亚细胞定位变化筛选降胆固醇新药的方法
<130>092669
<160>6
<170>PatentIn version 3.3
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<223>引物
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<223>寡核苷酸
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<223>寡核苷酸
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