以齐整小核菌为菌种生产高活性纤维素酶.pdf

本发明属微生物制造领域，涉及以齐整小核菌为菌种生产高活性纤维素酶的新用途，具体是以齐整小核菌作为生产菌种，将天然纤维素类物质经粉碎，高压喷爆处理后作为碳源，再添加氮源和无机盐配置成液体产酶培养基，然后进行深层液体发酵，发酵液经过滤、浓缩和喷雾干燥生产纤维素酶。本发明提供了以齐整小核菌为菌种生产纤维素酶的新用途，通过实验验证齐整小核菌具有产生高活性纤维素酶的特性，可广泛应用于纤维素酶制剂的发酵生产。

1、  以齐整小核菌为菌种生产高活性纤维素酶，其特征在于：以齐整小核菌作为生产菌种进行产酶发酵生产纤维素酶。

2、  一种权利要求1所述的以齐整小核菌为菌种生产高活性纤维素酶的方法，其特征在于：以齐整小核菌作为生产菌种，采用液体产酶培养基，经灭菌接入三角瓶液体菌种，进行液体深层发酵生产纤维素酶；
所述液体产酶培养基是将碳源、黄豆粉、(NH₄)₂SO₄、KH₂PO₄、CaCl₂、MgSO₄·7H₂O、MnSO₄、FeSO₄·7H₂O、ZnSO₄·7H₂O、CoCl₂和水经配制而成，其中按重量百分比计各组分的含量为：碳源1.5～2％，黄豆粉1.0～2％，(NH₄)₂SO₄ 0.02～0.1％，KH₂PO₄ 0.3％，CaCl₂0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，MnSO₄ 0.002‰，FeSO₄·7H₂O 0.0075‰，ZnSO₄·7H₂O 0.002‰，CoCl₂ 0.003‰，余量为水。

3、  根据权利要求2所述的以齐整小核菌为菌种生产高活性纤维素酶的方法，其特征在于：所述碳源是由农作物秸秆、木材废料经粉碎和高压喷爆处理而成。

4、  根据权利要求1所述的以齐整小核菌为菌种生产高活性纤维素酶的方法，其特征在于：所述生产方法是在发酵罐中装入液体产酶培养基，装入量为70％，液体产酶培养基pH值为5.0～6.0，发酵温度为28～30℃，通气量为1.0∶0.04～1.0∶1.0，发酵时间为96～120小时；发酵后发酵液经过膜过滤、真空浓缩和喷雾干燥即制成纤维素酶粗酶粉。

以齐整小核菌为菌种生产高活性纤维素酶
技术领域
本发明属微生物制造领域，具体涉及齐整小核菌(Sclerotiumrolfsii)在生产纤维素酶上的新用途。
背景技术
纤维素酶是指能够水解纤维素β-1，4糖苷键，使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖的酶。它不是指单一酶，而是指起协同作用的多组分的酶系。目前，这种酶系一般认为由三类酶组成：一是内切β-葡聚糖酶(亦称Cx酶、CMC酶)；二是外切β-葡聚糖酶(亦称C1酶、微晶纤维素酶)；三是β-葡萄糖苷酶(亦称CB酶或纤维二糖酶)。上述三类酶协同作用，可以将纤维素降解为简单糖。
纤维素酶生物技术行业起始于上个世纪80年代，最初是应用于动物饲料生产，随后是食品行业，现在已经广泛应用于纺织、洗涤剂、食品、酿造和制浆造纸工业等。纤维素酶制剂的应用是利用纤维素酶的四种性质即外切酶从纤维素末端降解纤维素、内切酶从链中间随机降解纤维素、β-葡萄糖苷酶作用于纤维二糖底物和CBD吸附纤维素底物的联合作用，把纤维素降解成葡萄糖。
纤维素酶广泛应用于食品、饲料、酿酒、纺织等领域，产纤维素酶的微生物涵盖细菌、放线菌和真菌。目前报道用于生产纤维素酶的微生物菌种较多的是丝状真菌，其中酶活力较强的菌种为木霉属(Trichoderma、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、担子菌(Basidiomycetes)类的褐腐真菌(Brown-rot fungi)和白腐真菌(White-rot fungi)，特别是绿色木霉(Trichoderma viride)及其近缘菌株等较为典型，是目前公认的较好的纤维素酶生产菌，但木霉菌易产生对人和动物有毒的真菌毒素，用其作为菌株生产的纤维素酶作为食品和饲料添加剂，需除去这些真菌毒素，从而会大大增加生产成本。
齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)是植物白绢病的病原菌，因其在侵染发病部位表面产生大量白色菌丝体，辐射状蔓延，形成白色绢丝状网膜，故名白绢病。属于半知菌亚门、丝孢纲、无孢目、小核菌属(Sclerotium)真菌，其有性态为罗耳阿太菌Athelia rolfsii，属担子菌亚门，非褶菌目，自然条件下不常发生有性态。齐整小核菌的寄主植物多达200种，如茄果类、瓜类、豆类、魔芋类蔬菜、果树、药材、茶、苜蓿、三叶草及金钱树、兰花、君子兰、蝴蝶兰、松鼠尾、冬珊瑚、瓜叶菊等多种花卉。以往国内外对于齐整小核菌的研究多侧重于齐整小核菌的病原菌特性及产胞外多糖上，未见有齐整小核菌用于生产纤维素酶的报道。
长期以来，缺乏高产菌株一直是制约纤维素酶大规模工业化生产的瓶颈，因此筛选获得优良的菌株是实现纤维素酶批量生产的关键。
发明内容
本发明的目的是提供一种齐整小核菌在纤维素酶生产中的用途，即以齐整小核菌作为生产菌种进行产酶发酵生产纤维素酶。
本发明所述齐整小核菌有多种获得方法，属于公知成熟技术，可利用多种微生物分离方法从多种植物白娟病病株或土壤中分离获得。
由于本发明首次公开了齐整小核菌能生产纤维素酶的用途，因此，只要以齐整小核菌为生产菌种发酵生产纤维素酶，均属于本发明的保护范围。
为了能更好地理解本发明所述的齐整小核菌用于生产纤维素酶的新用途，下面用发明人从金钱树(Zamioculcas zamiifolia)白绢病(Southern Blight)病株上分离到一株齐整小核菌菌株SM，对该菌株进行了纤维素酶活性测定、纤维素酶发酵生产培养基配方筛选和对获得的纤维素酶粗酶粉的酶活力测定等试验结果，说明齐整小核菌在生产纤维素酶方面的新用途。
1、齐整小核菌SM的分离、鉴定和产纤维酶活性测定
本发明从海南金钱树(Zamioculcas zamiifolia)白绢病(Southern Blight)病株上采集菌核(图1)，在超净工作台中经灭菌水洗净表面后，将菌核移接于羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为唯一碳源的培养基平板上，待菌落长出后进行刚果红染色初步测定其纤维素酶产生能力，然后用DNS法测对其进行纤维素酶活力复筛测定。结果表明，从金钱树白娟病病株获得的小核菌菌株SM在CMC-Na平板上生长良好，经刚果红染色可见清晰明亮的透明圈(图2)，表明其具有纤维素酶产生能力。经DNS法测定，其内切β-葡聚糖酶(CMC酶)活力为8.044U/ml，滤纸酶酶(FPA酶)活力为0.923U/ml，表明其纤维素酶活性高。从CMC-Na平板上挑取小核菌菌块移于PDA培养基平板上进行菌落形态观察，菌丝粗壮，生长快速，菌落呈白色放射絮状白色放射絮状(图3)，最后从菌落表面长出棕黄色菌核，菌丝体在显微镜下观察具有隔膜，白色，无产孢结构，菌核由外层的拟薄壁组织和内层的疏丝组织组成。经rDNA-ITS序列测序和序列提交Gene-Bank进行同源性比对分析(序列登录号为GQ121442)，与Gene-Bank中的齐整小核菌Athelia rolfsiiisolate SR-SC1菌株序列(登记号：EU338381.1)同源性最高，达99％。因而将从金钱树白娟病病株上分离筛选获得的小核菌菌株鉴定为半知菌亚门、丝孢纲、无孢目、小核菌属(Sclerotium)、齐整小核菌种(Sclerotium rolfsii)，其有性态为罗耳阿太菌Athelia rolfsii，属担子菌亚门。
表1.齐整小核菌SM产纤维素酶能力的DNS法复筛结果

2、齐整小核菌SM生产高活性纤维素酶的方法
以齐整小核菌作为生产菌种，采用液体产酶培养基，经灭菌接入三角瓶液体菌种，进行液体深层发酵生产纤维素酶。
上述液体产酶培养基是将碳源、黄豆粉、(NH₄)₂SO₄、KH₂PO₄、CaCl₂、MgSO₄·7H₂O、MnSO₄、FeSO₄·7H₂O、ZnSO₄·7H₂O、CoCl₂和水经配制而成，其中按重量百分比计各组分的含量为：碳源1.5～2％，黄豆粉1.0～2％，(NH₄)₂SO₄0.02～0.1％，KH₂PO₄03％，CaCl₂0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，MnSO₄0.002‰，FeSO₄·7H₂O0.0075‰，ZnSO₄·7H₂O 0.002‰，CoCl₂0.003‰，余量为水，起始pH5.0～6.0。
所述碳源是由农作物秸秆、木材废料经粉碎和高压喷爆处理而成。
所述生产方法是在发酵罐中装入液体产酶培养基，装入量为70％，液体产酶培养基pH值为5.0～6.0，发酵温度为28～30℃，通气量为1.0∶0.04～1.0∶1.0，发酵时间为96～120小时；发酵后发酵液经过膜过滤、真空浓缩和喷雾干燥即制成纤维素酶粗酶粉。
3、齐整小核菌SM发酵生产的纤维素酶粗酶粉酶活力测定
按照中华人民共和国国家发展和改革委员会2003年发布的《中华人民共和国轻工业行业标准·纤维素酶制剂》中所载方法测定CMC酶活力值、FPA酶活力值，参考上述文献中的方法测定生成的还原糖量，计算出β-葡萄糖苷酶活力值，测定结果如表2。
表2齐整小核菌SM发酵生产的纤维素酶粗酶粉酶活力测定结果

目前国内用于纤维素酶生产的菌株多为经过诱变选育的突变菌株，如，里氏木霉诱变菌株的CMC酶活力为20000U/g；长柄木霉诱变菌株的CMC酶活力为18000U/g；日本曲霉和斜卧青霉的CMC酶活力均为8000U/g。从上述酶活力测定数据可知，齐整小核菌野生型菌株SM发酵生产的纤维素酶粗酶粉的CMC酶活力达10000U/g以上，FPA酶活力达2000U/g，β-葡萄糖苷酶活力达3000U/g，说明齐整小核菌SM产生的纤维素酶活力高，可以把纤维素降解为简单糖。
本发明提供了以齐整小核菌为菌种生产纤维素酶的新用途，通过实验验证齐整小核菌具有产生高活性纤维素的特性，可广泛应用于纤维素酶制剂的发酵生产。
附图说明
图1齐整小核菌SM的菌核形态图。
图2齐整小核菌SM在CMC-Na上长出菌落后刚果红染色呈现的透明圈图。
图3齐整小核菌SM在PDA培养基上的菌落形态图。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。
实施例一
齐整小核菌产生的高活性纤维素酶的制备
初级种子培养基(PDA平板)：土豆200g洗净，去皮，切成小块，煮沸30min，纱布过滤，定容至1L，再加0.1％CMC-Na，1％葡萄糖，2％琼脂，自然pH，灭菌后倒平板。
次级种子培养基：土豆200g洗净，去皮，切成小块，煮沸30min，纱布过滤，定容至1L，再加0.1％CMC-Na，1％葡萄糖，自然pH，三角瓶分装后(装量20％)，121℃灭菌20min。
液体产酶培养基的配制：稻草粉2％，黄豆粉2％，(NH₄)₂SO₄0.5％，KH₂PO₄0.3％，CaCl₂0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，MnSO₄0.002‰，FeSO₄·7H₂O 0.0075‰，ZnSO₄·7H₂O 0.002‰，CoCl₂0.003‰，余量为水。
上述稻草粉的预处理：粉碎，高压喷爆。121℃灭菌20min。
以齐整小核菌属菌株SM为生产菌种，接入初级种子培养基，培养5天，平板培养基上会长出许多菌核，取若干菌核接入次级种子培养基，再以30℃，转速150r/min的条件摇瓶发酵培养8天，等到三角瓶内长出大量菌核后，将种子液接入液体产酶培养基中，发酵罐液体培养基装入量为70％，培养基pH值为4.0，发酵温度为28℃，通气量为1∶0.5，发酵时间为110小时。发酵后发酵液经过板框过滤除去菌丝，澄清发酵液经真空浓缩罐浓缩10倍，浓缩液经气流式喷雾干燥机(进风温度180℃)干燥制成纤维素酶粉。