用表面等离子共振技术检测染色体的方法及所用的芯片.pdf

本发明中提供了利用SPR技术检测染色体的方法，即针对在胎儿及新生儿中最常见的染色体异常(非整倍体)，设计染色体特异性的探针，对染色体特异的核酸标签进行定量检测，由此确定染色体拷贝数。本发明中还对SPR生物传感芯片的包被技术和检测技术进行了改进，使得临床应用SPR技术检测染色体拷贝数异常成为可能。应用本发明的方法和生物传感器芯片可以快速检测染色体拷贝数异常，其可以用于产前诊断及优生、优育，提高人口素质。

1.  一种用于人染色体快速检测SPR生物传感器芯片，该芯片基质为玻璃片，玻璃片表面镀有金属膜，金属膜表面经化学修饰形成巯基烃类单分子层，其上固定有对人染色体特异性的寡核苷酸探针，并且巯基烃类的末端官能团与葡聚糖相连。

2.  权利要求1的SPR生物传感器芯片，其中所述金属膜由选自铜、银、铝和金的金属构成，优选为金。

3.  权利要求1或2的SPR生物传感器芯片，其中巯基烃类选自分子式为HS(CH₂)_mR和HS(CH₂)_nR’的混合巯基烃类、分子式为R(CH₂)_mS-S(CH₂)_nR’的不对称双烃基二硫化物和分子式为R(CH₂)_mS(CH₂)_nR’的不对称双烃基硫化物，其中n和m代表亚甲基单位的数目，其为8-16的整数，R和R’代表烃链的末端，其为-CH₃、-OH、-COOH或NH₂。

4.  权利要求3的SPR生物传感器芯片，其中巯基烃类为巯基十一醇和巯基十六醇的混合巯基烃类、(CH₂)₁₁OH-S-S-(CH₂)₁₆OH或(CH₂)₁₁OH-S-(CH₂)₁₆COOH。

5.  一种使用表面等离子共振技术检测人染色体的方法，包括步骤：
(1)从待测样品中提取待测人基因组DNA，
(2)使用染色体特异寡核苷酸探针定量扩增染色体特异性核酸标签，
(3)用SPR测定并记录杂交、洗涤和再生引起的信号变化，
(4)根据上述信号差值确定所述染色体的差异。

6.  权利要求5的使用表面等离子共振技术检测人染色体的方法，其中所述差异为染色体拷贝数的差异。

7.  权利要求5的使用表面等离子共振技术检测人染色体的方法，其中所述待测样品是血液、羊水或其它细胞。

8.  权利要求5的方法，其中所述特异于所述染色体的探针选自SEQ ID NO：1-6。

9.  权利要求5的方法，其中所述特异于所述染色体的探针选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6。

10.  权利要求5的方法，其中所述染色体特异的寡核苷酸探针通过生物素-链霉亲和素系统或巯基作为固定剂固定到修饰层的表面。

11.  权利要求5的方法，其中所述的特异寡核苷酸探针包括DNA探针、RNA探针或PNA探针。

12.  权利要求5的方法，其中所述的特异寡核苷酸探针在5’端可连接与待检测区域不相关的核酸序列以提高杂交信号，也可以不连接。

13.  权利要求5的方法，其中所述的特异寡核苷酸探针包被到改良SPR生物传感芯片表面，探针5’端或3’端需进行标记，标记物包括但不限于巯基、生物素或氨基。

14.  权利要求5的方法，其中所述的特异寡核苷酸探针是DNA且是型特异性的，包括SEQ ID NO：1-6所示的序列及其反向互补序列。

15.  权利要求5的方法，其中所述的DNA探针，可以使用它们的部分或全部组合、检测部分或全部人类染色体。

16.  权利要求5的方法，其中的待测样品包括但不限于核酸样品，蛋白样品，还包括杂交缓冲液成分。

17.  权利要求5的方法，其中所述的核酸样品包括直接提取的核酸和经过PCR反应或其它方式扩增的核酸产物。

18.  权利要求5的方法，其中所述的PCR扩增核酸产物，可以是双链PCR产物，也可以是单链PCR产物，或者二者的混合物。

19.  权利要求5的方法，其中所述的杂交缓冲液为优化了的杂交缓冲液，其中含有但不限于1％-10％SSPE溶液和0.5％-10％硫酸葡聚糖溶液。

20.  权利要求5的方法，其中所述的待测样品，用于SPR生物传感器杂交检测时，采用静止或流动杂交，流动杂交时样品流速为5-50ul/min。

21.  权利要求5的方法，其中所述的杂交反应在大于室温下进行。

22.  权利要求5的方法，其中所述的杂交反应在35℃-60℃之间进行。

23.  用于检测人染色体的特异性探针，其具有SEQ ID NO：1-6中任项所示的序列及其反向互补序列。

24.  一种试剂盒，其包含权利要求1-4中任一项的SPR生物传感器芯片、核酸探针和说明书，其中所述核酸探针选自SEQ ID NO：1-6。

用表面等离子共振技术检测染色体的方法及所用的芯片
发明领域
本发明属于染色体检测领域。具体的，涉及一种用表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)检测染色体基因的方法。本发明也涉及用于上述方法的改良的SPR生物传感器芯片，以及包含该芯片和核酸探针的试剂盒。
背景技术
表面等离子体共振技术(SPR)是利用在金属膜/液面界面，由光的全反射引起的物理光学现象来分析分子间相互作用的技术。SPR仪由自动采样机械手、高分辨率的CCD照相仪和上面布有一个或多个流池的镀金或镀银SPR生物传感器芯片构成。SPR技术在检测、分析生物分子间的相互作用等方面得到广泛的应用。
SPR技术利用了能够在某些金属(特别是金、银)界面上激发产生的表面等离子波。当入射光以大于临界角的角度入射到金属界面上时，发生全反射，在合适的角度下，入射光的平行矢量与表面等离子波的频率相匹配时，发生共振，能量从入射光转移到表面等离子波中，反射光的反射率表现出急剧衰减(反射光强度最低时所对应的入射角称为“共振角”)。发生共振时的入射角或波长高度依赖于金属表面近表面的折射率。表面上的生物分子的结合会改变此处的折射率，从而引起发生共振的入射角的变化。
通过监测共振角的变化，可以实现实时检测传感芯片表面的生物分子间的相互作用。传统的SPR传感器测量完整的SPR曲线作为入射光角度或者波长的函数，这种模式应用广泛，但通量较低。而高通量的SPR仪可以通过成像系统实现同时检测成千上万个生物分子的相互作用。一个典型的SPR成像装置包括一个p偏振光源和一个随后接收来自SPR生物传感芯片的反射光的探测器。CCD照相仪以成像的方式来收集反射光强度。SPR成像检测以固定入射角的方式来检测时，光强度变化与由生物分子结合到表面后引起的折射率变化成比例。结果，引起的光暗度与结合到探测区的物质的量有关。另外影响SPR成像系统灵敏度的一个因素是光源强度。来自金属表面的信号强度与入射光强度成线性比例，因此相对于发光二极管和卤素灯，优先选择激光光源。
SPR仪是一种光学传感器，可以通过检测折射率的变化来检测金属表面的生物分子的结合。对金属-水界面的探测深度在200nm以内，这使得SPR成为一种比较理想的研究固定的生物分子与溶液中分析物质相互作用的工具。相对于传统的技术如基于荧光或ELISA的技术，SPR技术有如下几个优点：1，因为检测的是折射率，所以分析物质无需任何标记(如放射性或荧光标记)而直接用于检测；2，检测能够实时进行，可以让用户收集动力学数据；3，SPR是一项通用技术，能够检测宽范围的具有不同分子量和亲和力的分析物质。因此，SPR技术是一种研究生物分子相互作用的有力工具。至今，在研究领域内，SPR技术已经用于研究蛋白-肽相互作用、蛋白-DNA相互作用，DNA杂交等。但目前SPR方法还未有用于临床检测及诊断的报道。本发明申请人首次应用SPR技术进行临床检测及诊断的研究，包括人类染色体数目异常(非整倍体)的检测。
染色体数目异常是染色体畸变的一种重要类型，是指染色体数目不成倍地增加或减少，从而产生不同于正常染色体核型的细胞，也叫非整倍体。非整倍体是导致人类疾病和出生缺陷的一个重要潜在因素，在新生儿及胎儿中13、18、21、X和Y非整倍体是最常见的一些染色体异常。尽管到目前为止，染色体核型分析仍是最可靠的染色体病诊断方法，但在进行产前诊断时，由于细胞培养技术要求高，费时长，因而难以在一般的实验室常规开展。故有必要建立一种染色体异常快速检测方法，以便能在产前快速诊断出常见的染色体非整倍体。
发明概述
一方面，本发明实现了使用表面等离子共振技术(SPR)对人染色体拷贝数的检测。将染色体特异的探针包被在一种改良的SPR传感器芯片上，含经定量扩增的染色体特异的标志物的溶液，流过包被着特异寡核苷酸探针的一种改良的SPR生物传感芯片表面，分子间发生特异性结合时可引起传感芯片表面折射率的改变，导致SPR信号的改变，通过检测SPR信号改变而对染色体特异的标志物进行定性、定量检测。
另一方面，本发明提供了一种改良的SPR生物传感芯片，该芯片最内层为玻璃片，玻璃片表面镀上金属膜(可以是铜膜，银膜，铝膜或者金膜)形成裸金片。用强氧化剂或者等离子刻蚀法清洗裸金片，然后用超纯水和除气的乙醇清洗表面，接着将洁净的裸金片浸入巯基烃类化合物的乙醇溶液中，在洁净的金表面上形成巯基烃类的单种成分或混合成分的自组装单分子层(SAMs)。在合适的条件下使SAM表面暴露的末端官能团(-OH，-COOH)被葡聚糖修饰。本发明中，申请人用环氧活化方法联接葡聚糖。具体讲，使用环氧氯丙烷与十一醇反应，生成环氧化合物，然后用葡聚糖与固定了环氧氯丙烷的传感表面反应，形成葡聚糖修饰的表面。为了能够更好的与配体反应，可通过使前面修饰的芯片与溴乙酸溶液反应将葡聚糖表面羧甲基化。将NHS和EDC的水溶液通过葡聚糖修饰的传感芯片，使SAM表面的末端官能团重新暴露出来，从而使芯片表面被活化。注射PH值为弱酸性的链霉亲和素(SA)的醋酸缓冲液，以此反应来联接配体SA，最后以弱碱性的乙醇胺溶液封闭残存的活性位点。
一方面，一个SA分子可以结合多个生物素分子，这样将5’标记有生物素的核酸(包括DNA，RNA和PNA)探针分子的溶液通过芯片表面，探针就被包被到了芯片上。巯基(-SH)修饰的探针可以直接在金膜上形成单分子层，完成探针的包被。
另一方面，用含经定量扩增的染色体特异的核酸标签的溶液，流过包被着染色体特异的寡核苷酸探针的SPR生物传感芯片表面，杂交在SPR仪上进行，分析物的液体包括分析物和杂交液。
一方面，分析物包括DNA提取物，或PCR产物，或蛋白提取物，将它们与杂交液依照不同比例混合，加热变性或者不变性，进样，与包被探针的传感芯片反应，杂交温度应35℃以上。杂交可用静止杂交和流动杂交两种方式进行，静止杂交即将上样液通到芯片上以后，上样液静止不流动。流动杂交即上样液以不高于50ul/min的流速流过芯片表面完成杂交。杂交后可注射一定体积的洗涤液洗涤芯片表面清除非特异结合，也可以不洗涤。杂交反应信号以SPR角毫度(m°)或响应单元(RU)为单位，以扣除阴性对照检测信号后的值作为结果。
一方面，申请人对核酸杂交液的成分进行了优化，杂交液中含有1％-10％SSPE溶液和0.5％-10％硫酸葡聚糖溶液，极大提高杂交信号，提高了杂交速度。一般情况下，杂交之前记录一个SPR信号值，杂交之后再记录一个SPR信号值。根据两个信号值的不同来确定染色体拷贝数。
另一方面，待分析的染色体核酸样品包括直接从血液或羊水中提取的核酸和经过PCR扩增的核酸。PCR扩增初的核酸可以是双链DNA，也可以是单链DNA。单链DNA的PCR扩增使用改进了的引物，即，将一定长度的无关序列连接到一条引物的5’端，提高退火温度。单链DNA的扩增使用不对称PCR的方法，即先在较低的退火温度下扩增一定的循环数，扩增出一定数量的单链，再在较高的退火温度下扩增一定的循环数，扩增大量的单链。
一方面，芯片上所使用的核酸探针包括DNA探针，RNA探针，PNA探针，等。DNA探针长度一般为20-60nt。DNA探针5’端可连接与待检测区域不相关的核酸序列以提高杂交信号，不相关的核算序列包括复杂的序列，如随机生成的序列，也可以是简单重复序列，如polyA，polyT，polyC，polyG，也可以不连接。为了将DNA探针包被到传感器芯片表面，探针的一端(包括5’端和3’端)需进行标记，标记物包括但不限于巯基，生物素，氨基等。每一个芯片上可以包被多种探针，能够用于检测一种或数种染色体。
附图说明：
图1：SPR仪上1号正常人(二倍体)拷贝数检测记录图。
图2：SPR仪上2号正常人(二倍体)拷贝数检测记录图。
图3：SPR仪上3号唐氏综合症患者(21三体)拷贝数检测记录图。
图4：SPR仪上正常男性X染色体检测图。
图5：SPR仪上正常男性X染色体检测图。
图6：SPR仪上正常女性X染色体检测图之一。
图7：SPR仪上正常女性X染色体检测图之二。
图8：SPR仪上正常女性X染色体检测图之三。
具体实施方式
在第一方面，本发明提供了一种SPR生物传感器芯片，该芯片基质为玻璃片，玻璃片表面镀有金属膜，金属膜表面经化学修饰形成巯基烃类单分子层，并且巯基烃类的末端官能团与葡聚糖相连。
其中所述金属膜由选自铜、银、铝和金的金属构成，优选为金。
其中所述巯基烃类选自分子式为HS(CH₂)_mR和HS(CH₂)_nR’的混合巯基烃类、分子式为R(CH₂)_mS-S(CH₂)_nR’的不对称双烃基二硫化物和分子式为R(CH₂)_mS(CH₂)_nR’的不对称双烃基硫化物，其中n和m代表亚甲基单位的数目，其为8-16的整数，R和R’代表烃链的末端，其为-CH₃、-OH、-COOH或NH₂等。优选地，巯基烃类为巯基十一醇和巯基十六醇的混合巯基烃类、(CH₂)₁₁OH-S-S-(CH₂)₁₆OH或(CH₂)₁₁OH-S-(CH₂)₁₆COOH。
在第二方面，本发明提供了一种使用表面等离子共振技术检测染色体的方法，包括步骤：(1)从待测样品中提取待测人基因组DNA，
(2)使用染色体特异寡核苷酸探针定量扩增染色体特异性核酸标签，
(3)用SPR测定并记录杂交、洗涤和再生引起的信号变化，
(4)根据上述信号差值确定所述染色体的差异。
第三方面，本发明提供了用于染色体检测的特异性探针序列，所述序列具体如表1所示。
在本发明的检测方法中，其中所述差异为染色体拷贝数的差异，其中所述待测样品是血液、羊水或其它细胞。其中，染色体特异的寡核苷酸探针通过生物素-链霉亲和素系统或巯基作为固定剂固定到修饰层的表面。其中所述的特异寡核苷酸探针包括DNA探针，RNA探针，PNA探针，等。其中的特异寡核苷酸探针，5’端可连接与待检测区域不相关的核酸序列以提高杂交信号，也可以不连接。其中所述的特异寡核苷酸探针可包被到改良SPR生物传感芯片表面，探针5’端或3’端需进行标记，标记物包括但不限于巯基，生物素，氨基等。其中所述的DNA探针序列为型特异的，包括探针序列SEQ IDNo：1-6序列及其反向互补序列。其中所述的DNA探针，可以使用它们的部分或全部组合，检测部分或全部人类染色体。其中所述的待测样品，包括但不限于核酸样品，蛋白样品，还包括杂交缓冲液成分其中所述的核酸样品包括直接提取的核酸和经过PCR反应或其它方式扩增的核酸产物。其中所述的PCR扩增核酸产物，可以是双链PCR产物，也可以是单链PCR产物，或者二者的混合物。其中所述的杂交缓冲液为优化了的杂交缓冲液，其中含有但不限于1％-10％ SSPE溶液和0.5％-10％硫酸葡聚糖溶液。其中所述的待测样品，用于SPR生物传感器杂交检测时，采用静止或流动杂交，流动杂交时样品流速为5-50ul/min。其中所述的杂交反应，反应温度大于室温，在35℃-60℃之间进行。
在第四方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含本发明第一方面的SPR生物传感器芯片、核酸探针和说明书，其中所述核酸探针选自SEQ ID NO：1-6，优选选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5或者6。
实施例
下面通过实施例对本发明的技术方案进行详细阐述，所述实施例是例示性的，任何所述实施例的等价变体都包含在本发明内，本发明的保护范围不受实施例的限制。
实施例一：传感芯片的制备
(一)生物标记探针传感芯片的制备
1.传感芯片的葡聚糖修饰
a).裸金片的清洗
首先用强氧化剂(H₂SO₄:H₂O₂)或者等离子刻蚀法清洗裸金片，然后用超纯水和除气的乙醇清洗表面，之后以纯氮气流吹干。
b).自组装单分子层(SAMs)的制备
在洁净的金表面上形成巯基烃类的单种成分或混合成分的自组装单分子层(SAMs)，这种方式已经广泛用于化学或生物传感芯片的修饰。
在金表面制备SAMs的过程是：将洁净的裸金片浸入含1～10mM巯基烃类化合物的乙醇溶液中，室温下孵育12～18hr。
混合单分子层的合成有3个简便方法：
(1)混合烃基硫醇(HS(CH₂)_nR+HS(CH₂)_nR′)从溶液中的共吸附
(2)不对称双烃基二硫化物(R(CH2)_mS-S(CH2)_nR’)的吸附
(3)不对称双烃基硫化物(R(CH2)_mS(CH2)_nR’)的吸附，这儿n和m代表亚甲基单位的数目，R代表烃链的末端(-CH₃，-OH，-COOH，NH₂等)。
c).自组装单分子层(SAMs)的葡聚糖修饰
自组装单分子层形成后的修饰方法非常重要，因为这关系到表面是否能够有效引入具有生物学意义的复杂配基和大分子。在合适的反应条件下，SAMs表面暴露的末端官能团(-OH，-COOH)，先联接反应中间体葡聚糖，然后再联接到配体分子上。
本发明中，申请人用环氧活化方法联接葡聚糖。具体讲，使用～1mol·L^-1环氧氯丙烷与十一醇反应4h，生成环氧化合物，然后用300mg/ml的葡聚糖与固定了环氧氯丙烷的传感表面在25℃下反应20h，形成葡聚糖修饰的表面。为了能够更好的与配体反应，葡聚糖表面需要羧甲基化：将前面修饰的芯片浸入1mol·L^-1溴乙酸溶液中反应16h即可。
2.链霉亲和素(SA)包被
在葡聚糖修饰的传感芯片上进行SA的固定：把70ul含50mM NHS和200mM EDC的水溶液注射到葡聚糖修饰的传感芯片上进行表面活化后，再注射含有200ug/ml SA的醋酸缓冲液(10mM，pH4.5)，以此反应来联接配体SA，最后以70ul 1M乙醇胺溶液(pH 8.6)封闭残存的活性位点。
3.生物素标记的探针联接
反应在SPR仪上进行，进样的流速5ul/min。注入100ul溶解在缓冲液(0.01M HEPES，0.15M NaCl，10mM MgCl₂，pH7.4)中的生物素标记探针(1.25ng/ul)与传感芯片表面包被的链霉亲和素进行反应，这样生物素标记的探针就连接到了芯片上，可以在SPR仪器上进行下一步的杂交检测。
另外，本发明人发现了新的特异于染色体的核酸，它们可以作为探针用于本发明的方法中，获得较好的效果。表1给出了这些探针的序列，序列标识号。
表1