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作为癌症标志物的结肠癌相关的转录物 1(CCAT-1)
    发明领域 本发明涉及癌症标志物 CCAT-1 和 CCAT-1 在癌症诊断和成像中的用途。
     发明背景
     结肠和直肠的腺癌 (CRC) 是每年在世界范围内影响超过一百万人的常见疾病 (1)。 目前的 CRC 筛选主要是基于大便潜血检验，而诊断是基于结肠镜检查和组织活 检。 目前的筛选程序对于降低 CRC- 相关的死亡率具有一些作用 (2)，但是需要更准确的 筛选和诊断形式。 化疗剂单独或与靶向治疗联合改善了转移性患者的中位数存活率，并 降低了经历 CRC 的完全切除和处于复发的高风险的患者 ( 具有淋巴结转移灶或不利的组 织学的患者， (3)) 中的疾病复发。 尽管 CRC 治疗有大的进展，但是约 50％的诊断患有 CRC 的患者将在诊断后 5 年内死于疾病。
     在正常组织中不表达的 CRC- 特异性分子是用于治疗的潜在靶标。 现在几乎没 有在 CRC 中独特表达而在正常组织中不表达的分子标志物。 使用 cDNA 阵列的普查没有 鉴定可用于诊断和用作治疗靶标的 CRC 相关的分子标志物。
     发明概述
     本发明是基于在癌细胞特别是结肠、直肠癌中特异性表达的独特核酸转录 物 的 鉴 定、 分 离 和 测 序。 根 据 其 独 特 表 达 谱， 该 分 子 被 称 为 结 肠 癌 相 关 的 转 录 物 1(CCAT-1)。 该分子的完整序列公开于下文，并被命名为 SEQID NO ：1。
     随后，还发现 CCAT-1 在肺癌中表达。 因此，通过其第一方面，本发明提供诊 断癌症或癌前病变的方法，包括测量生物样品中 SEQ ID NO.1(CCAT-1) 或其片段的表达 水平 ；其中生物样品中 SEQ ID NO.1(CCAT-1) 或其片段的表达指示癌症或癌前病变。
     在一种实施方案中，所述方法还包括将在生物样品中测量的所述表达水平与标 准进行比较，其中生物样品中 SEQ ID NO.1(CCAT-1) 或其片段的更高的表达水平指示癌 症或癌前病变。
     在一种实施方案中，本发明的方法包括 ：
     (a) 从获自受治疗者的生物样品中分离核酸 ；
     (b) 将能够识别 CCAT-1 的探针与所述核酸在允许形成杂交复合体的条件下杂 交 ；和
     (c) 将杂交复合体形成与标准进行比较 ；
     其中生物样品中更高水平的杂交复合体指示癌症或癌前病变。
     在另一种实施方案中，本发明的方法包括 ：
     (a) 从获自受治疗者的生物样品中分离核酸 ；
     (b) 在所述分离的核酸中扩增 CCAT-1 或其任何片段 ；
     (c) 显现 CCAT-1 扩增产物 ；和
     (d) 将 CCAT-1 扩增产物的量与标准进行比较 ；
     其中更高水平的 CCAT-1 扩增产物的存在指示癌症或癌前病变。
     在具体实施方案中，所述扩增通过使用 CCAT-1 特异性探针的聚合酶链式反应
     (PCR) 进行。 在优选的实施方案中，所述 PCR 是实时定量 PCR。
     根据本发明的术语癌症或癌前病变的诊断还涵盖癌症或癌前病变的分期，以及 体内成像。
     根据本发明的一种实施方案，所述标准是通过测量未患癌症的受治疗者中 CCAT-1 的表达水平而确定的。
     在另一种实施方案中，所述标准是通过测量所述同一受治疗者的非癌组织中 CCAT-1 的表达水平而确定的。
     根据本发明的某些实施方案，所述癌症选自以下组成的组 ：结肠癌、直肠癌、 肺癌和所述癌症的转移灶，包括微转移灶 (micro-metastase)。
     根据另一种实施方案，本发明的方法诊断的癌前病变是腺瘤性息肉。
     根据本发明的某些实施方案，所述生物样品选自以下组成的组 ：组织、血液、 尿、粪便和骨髓样品。 优选地所述生物样品是组织活检。 组织活检可获自例如结肠、直 肠、肝、肺和淋巴结。
     在另一种实施方案中， CCAT-1 表达水平是通过原位杂交测量的。
     在 另 一 方 面， 本 发 明 提 供 一 种 分 离 的 寡 核 苷 酸， 其 包 含 SEQ ID NO ： 1(CCAT-1) 或其互补序列的至少 8 个连续核苷酸，优选地用作探针或引物。 在一个具体 实施方案中，寡核苷酸探针包含 SEQ ID NO ：5。
     根据某些实施方案，本发明的分离的寡核苷酸意图用于检测生物样品中的 CCAT-1 表达。
     根据某些实施方案，本发明的分离的寡核苷酸意图用于诊断癌症。
     在另一方面，本发明提供一种用于检测生物样品中 CCAT-1 的表达的方法，包 括：
     (a) 从所述生物样品分离核酸 ；
     (b) 将本发明的寡核苷酸探针与所述核酸在允许形成杂交复合体的条件下杂交 ； 和
     (c) 将杂交复合体形成与标准进行比较，其中生物样品中更高水平的杂交复合体 指示样品中 CCAT-1 的表达。
     在一种实施方案中，所述方法还包括在杂交之前扩增所述生物样品中转录的核 酸。
     在另一方面，本发明提供一种分离的核酸，其包含与 SEQ ID NO ：1 具有至少 85％同源性的 CCAT-1 或其片段。在一种实施方案中，所述分离的核酸包含 SEQ ID NO ： 1 或其片段的核酸序列。 在一种实施方案中，所述核酸是 mRNA。 在另一种实施方案 中，所述核酸是 cDNA。
     在另一方面，本发明提供组合物，包括药物组合物，其包含如上所述的本发明 的分离的寡核苷酸、分离的寡核苷酸探针或分离的核酸。 在具体实施方案中，所述组合 物被连接至基质。
     本发明还包括包含本发明的分离的核酸的载体，以及包含所述载体的宿主细 胞。
     在另一方面，本发明提供一种试剂盒，其被划分以容纳用于测量获自受治疗者的生物样品中的 CCAT-1 表达水平的至少一种试剂，所述至少一种试剂包含与 CCAT-1 转 录物的至少一种片段杂交的至少一种寡核苷酸探针或引物。
     在又一方面，本发明提供一种阵列，其包含具有多种区段的基质，其中所述区 段中的至少一种包含与 CCAT-1 或其片段杂交的探针。
     本发明还包括癌症或癌前病变的成像，所述癌症或癌前病变包括但不限于腺瘤 性息肉、结肠或直肠的原发性腺癌、肺癌、淋巴结转移灶和远端转移灶，通过向受治疗 者施用能够识别 CCAT-1 的探针，其中所述探针轭合至包括但不限于放射性同位素、荧 光染料、可见染料 (visible dye) 或纳米颗粒的指示分子，并通过成像装置检测标记。
     附图简述
     为了理解本发明和查看其在实践中可如何被实施，下面将参考附图，仅通过非 限制性实施例来描述实施方案，其中 ：
     图 1 是显示商业可获得的来自正常组织的 cDNA 板中 CCAT-1 转录物水平的实时 PCR 定量分析的图。 左侧的柱代表结肠癌细胞系 SK-Co-10 中的 CCAT-1 转录物水平。
     图 2 是显示结肠癌 ( 黑色条 ) 和相邻的正常组织 ( 白色条 ) 中的 CCAT-1 转录物 水平的实时 PCR 分析的图。 样品编号显示在 X- 轴。 C ＝对照 /SK-CO-10。 图 3 是显示低浓度 HT-29 细胞中 CCAT-1 的校准曲线的图。 扩增在获自未患结 肠癌的受治疗者的外周血单核细胞 (PBMC) 中稀释的增加浓度的 HT-29 结肠癌细胞中的 CCAT-1。 扩增的 CCAT-1 cDNA 的相对量 (RQ) 显示于 y- 轴，并使用单独获自未患结肠 癌的受治疗者的 PBMC 作为参考样品进行计算。 CCAT-1 cDNA 的相对量与 HT-29 肿瘤 细胞浓度相关。 最低剂量 ：1×106 个 PBMC 中 5 个肿瘤细胞至高达 1×106 个 PBMC 中 500 个肿瘤细胞 (HT29)。
     图 4 是显示中间浓度的 HT-29 细胞的校准的图。 扩增在获自未患结肠癌的 受 治 疗 者 的 PBMC 中 稀 释 的 增 加 浓 度 的 HT-29 结 肠 癌 细 胞 中 的 CCAT-1。 扩 增 的 CCAT-1cDNA 的相对量 (RQ) 使用单独获自未患结肠癌的受治疗者的 PBMC 作为参考样 品进行计算。 CCAT-1cDNA 的相对量 (y- 轴 ) 与 HT-29 肿瘤细胞浓度相关。 最低剂量 ： 1×106 个 PBMC 中 500 个肿瘤细胞 (HT29) 至高达 1×106 个 PBMC 中 10,000 个肿瘤细胞 (HT29)。 右侧的柱是仅 PBMC 的对照。
     图 5 是显示高浓度的 HT-29 细胞的校准的图。 扩增在获自未患结肠癌的受治疗 者的 PBMC 中稀释的增加浓度的 HT-29 结肠癌细胞中的 CCAT-1。 扩增的 CCAT-1cDNA 的相对量 (RQ) 显示于 y- 轴，并使用单独获自未患结肠癌的受治疗者的 PBMC 作为参考 样品进行计算。 CCAT-1cDNA 的相对量与 HT-29 肿瘤细胞浓度相关。 最低剂量 ：1×106 个 PBMC 中 1,000 个肿瘤细胞至高达 1×106 个 PBMC 中 1,000,000 个肿瘤细胞 (HT29)。 右侧的柱是对照样品，其仅含有获自未患结肠癌的受治疗者的 PMBC。
     图 6 是显示结肠腺瘤 ( 腺瘤性息肉 ) 和衍生自结肠腺癌的肝转移灶中的 CCAT-1 表达的图。 410TCo- 肿瘤组织、316TCO- 肿瘤组织、 NN ＝获自具有结肠癌以外的疾病 的患者的正常结肠粘膜。 P1 和 P2 ＝获自结肠的腺瘤性息肉的组织。 M ＝获自肝转移灶 ( 转移性结肠癌 ) 的组织。
     图 7 是显示通过不同的检测方法鉴定的哨兵淋巴结 (SLN) 的百分比的图，所 述检测方法包括苏木精和伊红染色 (H&E)、免疫组织化学 (IHC) 和聚合酶链式反应
     (PCR)。 图 8 是显示通过实时定量 PCR 的细胞角蛋白 -20(CK20) 扩增曲线的图。
     图 9 是显示通过实时定量 PCR(qPCR) 的 CCAT-1 扩增曲线的图。
     图 10 是显示粪便样品中 CCAT-1 的 qPCR 结果的图。 结果显示为 CCAT-1 和看 家基因 (GAPDH) 的表达之间的关系。 每个柱代表与从同一样品扩增的 GAPDH cDNA 的 量相比的 CCAT-1cDNA 的相对量 (RQ)。 NTC( 左侧的柱 ) 显示内部阴性对照 - 获自未 患结肠癌的受治疗者的外周血淋巴细胞。 没有 CCAT-1cDNA 存在。 样品 t391 和 t374 是 阳性对照 - 结肠组织的原发性腺癌。 这些样品显示 CCAT-1 的高表达。 来自健康志愿者 的粪便样品 ：(C46-C8)。 任何样品 (n ＝ 9) 中都没有 CCAT-1 表达。 患有结肠或直肠 腺癌的患者的粪便样品 ：(P25-P1)。 在 4/12 样品中发现了 CCAT-1 表达。
     图 11 是显示通过实时 PCR 定量分析测量的、九个阴性对照的外周血 ( 健康志愿 者 ) 和两个结肠腺癌样品 ( 左侧的柱 ) 中的 CCAT-1 表达的图。
     图 12 是 显 示 结 肠 癌 患 者 的 外 周 血 样 品 中 的 CCAT-1 表 达 的 图。 扩 增 的 CCAT-1cDNA 的相对量 (RQ ；显示于 y- 轴 ) 是与获自未患结肠癌的受治疗者 (NC) 的 PBMC 的对照样品相比。
     图 13 是显示与 HT-29 相比的 18 个结肠直肠癌细胞系中的相对 CCAT-1 表达的 图。 表达水平通过实时 ( 定量 )PCR 确定。 任何给定样品中的相对 CCAT-1 表达是与 HT-29 结肠癌细胞系 ( ＝ 1) 中的 CCAT-1 表达相比。
     图 14 是显示与 HT-29 相比的 16 个肺癌细胞系中的相对 CCAT-1 表达的图。 表 达水平通过实时 ( 定量 )PCR 确定。 任何给定样品中的相对 CCAT-1 表达是与 HT-29 结 肠癌细胞系 ( ＝ 1) 中的 CCAT-1 表达相比。
     图 15A 显示用作原位探针的 165bp 核酸序列 (SEQ ID NO ：X) ；图 15B 是显示 pBluescript 载体的 RNA 印迹分析的照片。 泳道 1 ：序列梯。 泳道 2 ：pBluescript 载体和 插入序列。
     图 16 是基于筛选的原位杂交的范例。 结肠腺癌 (a) 和相邻的正常粘膜 (b) 中的 CCAT-1 的比较染色。 在肿瘤组织 (a) 中观察到更强的 CCAT-1 染色，相比之下，相邻 的正常粘膜中的 CCAT-1 染色的强度较低。
     图 17 是显示健康志愿者的外周血样品中的 CCAT-1 表达的图。
     实施方案详述
     定义
     如本文所用，术语 “CCAT-1”指结肠癌相关的转录物 1(Colon CancerAssociated Transcript 1)。
     如本文所用，术语 “CCAT-1 的片段” 或 “CCAT-1 转录物的片段” 指 CCAT-1 基因转录物的片段，其可用作寡核苷酸或核酸探针、引物或反义寡核苷酸。
     如本文所用，术语 “多核苷酸” 和 “寡核苷酸” 可互换使用，并包括任何长度 的核苷酸的聚合形式，所述核苷酸是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、或其类似物。 以下 是多核苷酸的非限制性实例 ：基因或基因片段、外显子、内含子、信使 RNA(mRNA)、 转移 RNA(tRNA)、核糖体 RNA(rRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、 质粒、载体、具有任何序列的分离的 DNA、具有任何序列的分离的 RNA、核酸探针和引
     物。 多核苷酸可包含修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。 核苷酸的序列 可被非核苷酸组分中断。 多核苷酸还可在聚合后修饰，诸如通过与标记组分轭合。 该术 语还包括双链和单链分子二者。
     CCAT-1 的 “互补转录物”或 “探针”指与 CCAT-1 互补的、用于检测 CCAT-1 的 cDNA 或 mRNA 的至少一部分的存在的核酸分子或序列。 检测通过鉴定探针和测定的 序列之间的杂交复合体进行。 探针可被连接至固体支持物或可检测的标记。 探针一般 是单链的。 探针通常包含 10 至 200 个核苷酸。 探针的特定性质将取决于特定的用途， 并且其确定在本领域技术人员的能力范围之内。 一般而言，探针将在高严格性条件下与 CCAT-1 的 cDNA 或 mRNA 的至少一部分杂交。
     如本文所用， “引物” 指通过与靶标杂交而结合感兴趣的样品中存在的靶标或 “模板” 靶标，然后促进与靶标互补的多核苷酸的聚合的短的多核苷酸。
     “聚合酶链式反应” (PCR) 是其中复制拷贝是由靶标多核苷酸使用由正向引物 和反向引物组成的一组引物，通常是一对引物，和作为聚合催化剂的 DNA 聚合酶生成的 反应。
     应理解，引物也可用作杂交反应，诸如 DNA 或 RNA 印迹分析中的探针，例如， 如 Sambrook J. 等 人 ：A Laboratory Manual( 实 验 室 手 册 ). 第 2 版， Cold Spring Harbor Laboratory， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， N.Y.，1989 中所 述。 如本文所用，术语 “cDNA” 指互补 DNA。 “cDNA” 指分离的多核苷酸、核 酸分子或其任何片段或互补序列。 它可通过重组技术或合成方法起源，是双链或单链， 代表编码和 / 或非编码 5’ 和 3’ 序列。 如本文所用， “结肠直肠癌” 或 “CRC” 指特 征为包括盲肠、升结肠、横结肠、降结肠、乙状结肠和直肠的肠道细胞的癌症的医学病 症。
     如本文所用， “癌前病变” 或 “腺瘤性息肉” 指特征为结肠粘膜的恶性转化但 没有侵入基底膜的组织学证据的医学病症。
     如本文所用， “肺癌” 指特征为肺细胞的癌症的医学病症。
     “载体” 包括将插入的多核苷酸转入宿主细胞的自我复制的核酸分子。 该术语 意图包括主要功能是将核酸分子插入细胞的载体、主要功能是核酸复制的复制载体和功 能为 DNA 或 RNA 的转录和 / 或翻译的表达载体。 还意图包括提供多于一种上述功能的 载体。
     术语 “宿主细胞” 涵盖充当载体或掺入外源核酸分子诸如多核苷酸的接受者的 任何单独的细胞或细胞培养物。 具体地，宿主细胞涵盖能够充当包含 CCAT-1 的至少一 部分的载体的接受者的细胞。 它还涵盖由于天然的、偶然的或有意的突变而有时可能未 必与原始的亲代细胞在基因型或表型上相同的细胞后代。 原核细胞或真核细胞适于充当 本发明中的宿主细胞。 宿主细胞包括但不限于细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、动物细 胞，包括哺乳动物细胞，如鼠、大鼠、猿猴或人类细胞。
     如本文所用，“差异表达”指增加的、更高 ( 上调的或存在的 ) 或降低的 ( 下调 的或不存在的 ) 基因表达，如通过生物样品中转录的寡核苷酸 ( 如 mRNA) 的不存在、存 在或量的变化所检测的。 “更高的表达水平” 涵盖比对照样品中检测的表达水平或标准
     高至少 2 倍、2.5 倍、3 倍、5 倍、10 倍或更高的表达水平。 该术语还指细胞或组织中有 核苷酸序列的表达，而对照细胞中未检测到表达。
     如本文所用， “杂交” 指其中至少一种多核苷酸反应以形成经由核苷酸残基的 碱基之间的氢键稳定的复合体的反应。 氢键可通过 Watson-Crick 碱基配对、以任何其他 序列特异性方式发生。 杂交反应可构成更广泛过程中的步骤，诸如 PCR 反应的起始。
     杂交反应可在不同严格性的条件下进行。 在严格性条件下，彼此具有至少 60％、65％、70％、75％同一性的核酸分子保持互相杂交。 高严格性杂交条件的非限制 性实例是在 6× 氯化钠 / 柠檬酸钠 (SSC) 中在大约 45℃下杂交，然后在 0.2×SSC 和 0.1％ SDS 中在 50℃、在 55℃或在约 60℃或更高温度下漂洗一次或多次。
     当杂交在两个单链多核苷酸之间以反平行构型发生时，这些多核苷酸被描述为 互补。
     能够与本发明的核酸分子 SEQ NO ：1(CCAT) 杂交的分子还包括能够与其杂交 的多核苷酸片段。 在本文中，片段被理解为意指长度足以与 CCAT-1 转录物杂交的核酸 分子的部分。 因此，术语片段意指这些分子的序列与 CCAT-1 转录物的序列在一个或多 个位置不同但仍显示与这些序列或其部分的高度同源性。 在此语境中，同源性意指至少 40％的序列同一性、特别地至少 60％、至少 80％、至少 85％、至少 90％或超过 95％的同 一性。
     优选地，同源性的程度是通过将相应序列与 SEQ ID NO ：1 的核苷酸序列进行 比较而确定的。 在被比较的序列不具有相同长度的此类情形中，同源性的程度优选地指 较短的序列中与较长的序列中的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分比。 同源性或同 一性的程度可通过例如已知的基于计算机比对的程序诸如 ClustalW 来评估， ClustalW 由 European BioinformaticsInstitute(EBI) 和 European Molecular Biology Laboratory(EMBL) 分 发。 ClustalW 可以从各种来源诸如例如 ：www.ebi.ac.uk/clustalw 下载。 当使用 ClustalW 软件包 2.0 版本来确定特定的序列是否与根据本发明的 SEQ NO ：1 具有例如 85％同一性 时，比较可通过其中提供的默认设置进行。
     “生物样品” 在本文使用其广泛含义，并可包括体液 ；细胞制品的可溶级分或 培养细胞的培养基的等份 ；从细胞中分离或提取的染色体、细胞器或细胞膜 ；溶解或结 合至基质的基因组 DNA、RNA 或 cDNA ；细胞 ；活检，组织包括肿瘤组织、结肠直肠样 品和非结肠直肠样品 ；组织印迹 (tissue print) ；指纹、口腔细胞 (buccal cell)、皮肤或毛 发 ；和类似样品。
     “基质” 指结合核酸的任何硬质或半硬质支持物，并包括膜、过滤器、芯片、 载玻片、干胶片、纤维、磁性或非磁性珠、凝胶、毛细管或其他管、平板、聚合物、 纳米颗粒和微颗粒，其具有多种表面形式，包括孔 (well)、沟 (trench)、针 (pin)、槽 (channel) 和小孔 (pore)。
     本发明是基于对结肠癌相关的转录物 -1(CCAT-1) 的鉴定， CCAT-1 是长 2528 碱基对 (bp) 并且位于染色体 8q 24.21 上的新的非编码 RNA。
     发明人发现 CCAT-1 存在于多种癌组织和细胞系包括结肠癌、直肠癌、肺癌中 和结肠的癌前病变 ( 腺瘤性息肉 ) 中，但在正常组织中如果有的话，以非常低的水平被检 测到，如本文所公开的。 因此， CCAT-1 可充当癌细胞的标志物，并且尤其可用于生物样品中的结肠直肠癌、肺癌和癌前病变 ( 腺瘤性息肉 ) 的鉴定。
     因此，本发明提供 CCAT-1 或其序列的任何部分作为用于对患有结肠直肠癌 (CRC)、癌前病变 ( 腺瘤性息肉 ) 和肺癌的患者进行诊断、分期 ( 病理学评估 )、成像和 术后监测的特异性分子诊断标志物的用途。
     这些活动可在体外，或通过递送用于患者中的肿瘤成像的组合物而在体内进 行。
     检测可使用聚合酶链式反应 (PCR)、原位杂交技术或本领域已知的任何检测技 术实现。
     根据本发明的一些实施方案，提供用于筛选、诊断和分析患者和 / 或患者样品 以检测 CCAT-1 表达的证据的组合物和方法。 CCAT-1 的表达暗示原发性或转移的结肠 直肠癌或原发性或转移性肺癌。 在本发明的另一方面，提供可用于显现原发性或转移的 结肠直肠癌或原发性或转移性肺癌细胞的组合物和方法。
     筛选和诊断组合物和方法可用于监测处于直肠结肠癌或肺癌的高风险组的个 体，诸如那些过去已被诊断患有局部性疾病、转移的疾病的个体，或那些在遗传上与所 述疾病关联的个体，或那些具有过去被诊断患有癌症的一级和二级家族成员的个体。 具 有结肠炎性病症诸如溃疡性结肠炎或克隆氏结肠炎病史的个体和具有吸烟史的个体也将 被视为处于结肠直肠癌或肺癌的高风险组的个体。 体外筛选和诊断组合物和方法可用于 监测正在经历或已经接受结肠直肠癌或肺癌治疗的个体以确定癌症是否被除去。 筛选和 诊断组合物和方法可用于监测诸如通过遗传筛选和 / 或家族史被鉴定为有遗传素因的个 体。 因此，可鉴定处于发展结肠直肠癌和肺癌风险的个体，并可从此类个体中分离 样品。 本发明可用于诊断显示至少一种癌症症状或特征，如在相关组织中存在息肉的个 体。 本发明尤其可用于监测被鉴定为具有包括亲属曾患有结肠直肠癌或肺癌的家族病史 的个体。 同样地，本发明尤其可用于监测接受治疗并除去肿瘤或以其他方式被缓解的个 体。
     根据本发明，提供结合 CCAT-1 基因转录物的化合物。
     结肠癌、直肠癌或肺癌的检测可使用获自癌症患者或怀疑患有癌症的个体的任 何生物样品进行，所述生物样品包括但不限于，组织、血液、骨髓、粪便、尿、淋巴结 或任何体液。 在特异性实施方案中，所述生物样品是取自怀疑为癌性的组织的活检 ( 如 针吸活检或结肠镜检查中取出的组织 )。 在具体的实施方案中，所述样品是粪便样品。
     组织样品可通过外科技术获得。 本领域技术人员将理解可获得用于根据本发明 的分析和检查的测试样品的多样性。 另外，本领域技术人员将理解，对于获得组织样品 目的，本发明可使用另外的程序。
     在一种实施方案中，使用血液作为生物样品。 如果是这种情况，可通过例如离 心从血液样品中分离其中包含的细胞。
     在优选的实施方案中，生物样品获自人类。
     在任何生物样品中检测到 CCAT-1 基因转录物的存在表明该生物样品含有肿瘤 细胞。
     组织样品任选地通过标准技术如超声处理、机械破碎或化学裂解匀浆。
     用于外科病理学的组织切片制品可以冷冻并使用标准技术制备。 对组织切片的 原位杂交测定对固定的细胞进行。
     CCAT-1 基因转录物的存在可使用本领域已知的多种技术来确定，例如使用特异 性引物的基因转录物或其片段的聚合酶链式反应 (PCR) 扩增和扩增产物的检测，以及与 CCAT-1 特异性探针的杂交。
     CCAT-1 基因转录物的存在还可使用诸如原位杂交等技术在组织切片中确定。
     为此，本发明提供用来在本发明的程序中鉴定 CCAT-1 的寡核苷酸探针和寡核 苷酸引物。
     在另一方面，本发明提供试剂盒，其包含诸如寡核苷酸探针和寡核苷酸引物等 组分。 应理解，本文提供的实例不意图限制本发明的范围。
     如上文指出的，生物样品中的 CCAT-1 基因转录物的检测可使用聚合酶链式反 应 (PCR) 技术进行。 PCR 是本领域已知的，并且被常规地实践于诊断和研究两方面。 它 公开于例如美国专利第 4,683,202 和 5,075,216 号。 简要而言， PCR 通过提供与待扩增的 靶标核苷酸序列杂交的引物来提供 DNA/RNA 序列的扩增。 引物组通常含有两个引物 (+ 正向和 - 反向 )。 该反应还采用核苷酸和聚合酶。 聚合酶根据与杂交的引物相邻的序列 填充互补的核苷酸。 扩增循环造成所需产物的指数扩增。
     PCR 引物是基于序列信息根据常规的方案设计的。 CCAT-1 转录物的核苷酸序 列如 SEQ ID NO ：1 所列。
     对于 PCR，通常从生物样品中的细胞提取 RNA 并分析，或可选地，将 RNA 转 化为 cDNA。 此类转化也是标准做法。
     当 CCAT-1 转录物存在于生物样品中时， PCR 将得到包含 CCAT-1 转录物的原 始 mRNA 的指数拷贝。
     如果 CCAT-1 不存在，PCR 将不会得到可检测的扩增产物。 适于 PCR 的引物一 般为 8-25 个核苷酸长、15-30 个核苷酸长或 18-50 个核苷酸长。 典型的引物包含 15-25 个核苷酸。 这些引物与 CCAT-1 转录物或其对应 cDNA 的序列相同或互补。 这是这些引 物与 CCAT-1 转录物或其片段杂交的原因。
     将之前获自生物样品的 mRNA 或其对应 cDNA 与引物、核苷酸和聚合酶按照已 知的 PCR 方案混合。 混合物经历一系列温度循环。 当 CCAT-1 转录物或其对应的 cDNA 存在于混合物时，引物将杂交，CCAT-1 转录物将以指数扩增。 当 CCAT-1 转录物不存在 时，则不会观察到可检测的扩增。 扩增产物可通过本领域熟知的许多程序检测，例如， 通过凝胶电泳。
     当从生物样品中回收到小量转录的多核苷酸时， PCR 是有利的。
     本发明还提供适于旨在扩增 CCAT-1 转录物的 PCR 反应的多核苷酸引物。
     根据本发明，可以组装用于检测生物样品中 CCAT-1 转录物的存在的诊断试剂 盒。 此类诊断试剂盒包含适于检测 CCAT-1 的试剂。 作为非限制性实例，此类试剂盒包 含至少一种寡核苷酸探针和 / 或至少一种寡核苷酸引物。 通常，本发明的试剂盒还包含 所用试剂的容器。 另外，这些试剂盒可包含核苷酸大小标志物以用于凝胶分析中来确定 检测的核酸的大小。 本发明的试剂盒可另外包括进行测定的说明和方案。 还可提供阳性 对照和阴性对照作为试剂盒组件的一部分。在另一种实施方案中，确定样品中是否含有表达 CCAT-1 的细胞是通过对从生 物样品中提取的 mRNA 进行 RNA 印迹分析。 RNA 印迹分析是本领域技术人员已知的方 法。 参见，如 Sambrook 等人，(1989)MolecularCloning ：A Laboratory Manual( 分子克隆 实验室手册 )， Cold Spring HarborLaboratory Press， Cold Spring Harbor， N.Y.
     另外， mRNA 提取、通过电泳的 mRNA 分离、印迹分析、探针和引物制备和杂 交技术是已知的，并且进行这些技术的材料是商业可获得的。
     信使 RNA 可通过例如使用 poly dT 柱来提取，并且材料通过电泳分离，并，例 如，转移到硝酸纤维素纸上。
     标记的探针通常用于显现固定于所述纸上的 mRNA 的存在。 这些探针具有与 CCAT-1 转录物或其片段互补的核苷酸序列。
     为此，SEQ ID NO ：1 中的序列信息可用于制备探针或分离和克隆 CCAT-1 转录 物。 此类探针为至少 8、15、30、40 或 100 个核苷酸的段。 探针可以是 DNA 或 RNA，它 优选地为单链，并且通常应与 SEQ ID NO ：1 的相应片段具有至少 65％的序列同源性。
     探针可在报道子分子的存在下使用寡标记或 PCR 扩增产生。 含有 CCAT-1 的 cDNA 或其片段的载体可用于产生信使 RNA 探针，例如通过加入 RNA 聚合酶和标记的核 苷酸。 本领域技术人员可用商业可获得的试剂盒和材料来进行这些过程。 杂交的严格性通过许多因素诸如探针内的 GC 含量、温度和盐浓度确定。 特别 地，严格性可通过降低盐浓度或提高杂交温度而增加。 在高严格性下，杂交复合体将仅 在核酸高度互补时保持稳定。
     杂交的条件是本领域技术人员熟知的，如参见 Sambrook 等人，如上所述。
     本发明的试剂盒可因此含有有用的试剂来实施 RNA 印迹技术以检测生物样品中 CCAT-1 转录物的存在。 该试剂盒任选地包含可用作探针以与转录的 CCAT-1 或其片段 杂交的寡核苷酸。 探针可以被放射性标记。 还可任选地提供阳性对照和阴性对照以及适 当的大小标志物。
     用于检测 CCAT-1 转录物的存在的另一技术是通过寡核苷酸杂交。 多核苷酸的 杂交是本领域技术人员已知的。 此方法也采用含有与 CCAT-1 转录物的核苷酸序列杂交 的特异性核苷酸序列的可检测的探针。
     来自生物样品的 RNA 通常被固定于滤纸或类似材料。 加入探针并保持在仅当探 针适当地与固定的材料互补时允许杂交的条件下。
     这些条件应具有足够的严格性以洗掉与固定的材料部分杂交的探针。 在滤纸上 检测到探针表明 CCAT-1 转录物的存在。
     用于杂交测定的探针包含与 CCAT-1 基因转录物的序列互补的至少 8、12、15、 20、30、50 或 100 个核苷酸。
     SEQ ID NO ：1 中公开的序列信息可被本领域技术人员用于制备本发明的探针。 可优化杂交过程的条件以使样品中不完全互补的多核苷酸造成的背景信号最小。
     本发明因此还包括可用作寡核苷酸杂交的探针的标记的寡核苷酸。 标记的探针 涵盖放射标记的核苷酸或通过可容易获得的系统以其它方式可检测的探针。 标记的探针 通常包括通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段可测量的标记。 作为非 限制性实例，此类标记可包含放射性物质 (32P、35S、3H、125I)、荧光染料 ( 洋地黄毒苷、
     荧光素、5- 溴脱氧尿苷 (bromodesoxyuridin)、乙酰氨基芴 )、生物素、纳米颗粒和类似标 记。 此类寡核苷酸通常在其 3’ 和 5’ 端标记。
     特别地，与 CCAT-1 或其序列的任何部分互补的转录物 ( 例如 SEQ IDNo ：4) 可 被轭合至荧光探针，包括但不限于可见范围内的荧光标签 ( 例如 CY3.0 或 CY 5.0) 或近红 外范围的探针 ( 例如 Cy 5.5)，以用于体外或体内检测或成像结肠癌或直肠癌和肺癌。 另 外，与 CCAT-1 或其序列的任何部分互补的转录物可被轭合至或掺入到纳米颗粒、微颗 粒或脂质体以检测或成像癌症。
     与 CCAT-1 或其序列的任何部分互补的转录物可被轭合至放射性同位素以检测 或成像癌症。 与 CCAT-1 或其序列的任何部分互补的转录物可被轭合至合成的聚合物以 检测或成像癌症。
     与 CCAT-1 或其序列的任何部分互补的转录物可被轭合至其它生物剂，包括但 不限于抗体、毒素或其它肽，以检测或成像癌症。
     可装配对进行本发明的杂交方法有用的试剂盒。 这些试剂盒还提供与 CCAT-1 转录物杂交的标记的寡核苷酸。 在一种实施方案中，所述标记的探针是放射标记的。 还 可在所述试剂盒中包括阳性对照和阴性对照以及大小标志物，诸如多核苷酸序列梯。 这 些试剂盒还可包含用于进行所述测定的说明。
     本发明的杂交技术还涵盖原位杂交以检测生物样品诸如组织切片中表达 CCAT-1 的细胞。 因此，本发明还涉及可用于进行原位杂交的探针。 这些探针被设计为与生物样 品中存在的互补核酸序列杂交。 可使用荧光显微镜来显现荧光标志物标记的探针。
     为此，本发明还提供用于进行原位杂交的试剂盒。 原位杂交可用于检测组织切 片中 CCAT-1 的 mRNA 序列。 可使用荧光标志物来检测对应于 CCAT-1 转录物或其互补 序列的序列。
     本发明还涉及重组载体，包括包含 CCAT-1 基因转录物、其片段或互补序列的 表达载体。
     本发明还涉及包含此类载体的宿主细胞，并涉及使用此类重组细胞表达 CCAT-1 的方法。 宿主细胞的实例包括酵母细胞诸如酿酒酵母 (S.cerevisiae)、昆虫细胞诸如草 地贪夜蛾 (S.frugiperda)、细菌诸如大肠杆菌 (E.coli) 和哺乳动物细胞诸如中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞。
     本发明还提供一种分离的寡核苷酸，其包含 CCAT-1 基因转录物 (SEQID NO ： 1) 或其片段的序列。 特别地，本发明涉及与 SEQ ID NO ：1 具有至少 85％同源性的分离 的寡核苷酸。 本发明涉及分离的 CCAT-1，包括其片段。
     本发明的重组表达载体可用于转化宿主以制备用于制备本发明的分离的寡核苷 酸的重组表达系统。 表达载体可含有转录控制元件 ( 如启动子和增强子 )。 这些元件可 选自多种来源，其根据它们在特定宿主中的效率选择。 使用重组 DNA 技术或合成技术将 载体、 cDNA 和调节元件合并在一起。
     本领域技术人员可通过使用商业可获得的表达载体引入此类包含本发明的 CCAT-1 多核苷酸的分子，以用于熟知的表达系统，诸如本文描述的那些。
     除了通过重组技术产生这些多核苷酸分子之外，还可采用自动化核酸合成仪来 生产 CCAT-1 或其片段。 此类技术是本领域技术人员熟知的。CCAT-1 转录物、相应于 CCAT-1 的 cDNA、其片段、寡核苷酸、以上任何的互 补 RNA 和 DNA 分子以及 PNA 可用于检测或测量差异的 CCAT-1 表达、增加的表达水平。 这些测量可监测治疗干预过程中的 mRNA 水平。 其还可用于本发明的诊断程序或实际的 预后确定。 这些测量还可用于分期癌症组织诸如 CRC 或肺癌。
     与差异表达相关的癌症包括特异性结肠癌或直肠癌以及肺癌。 诊断测定可使用 如上文所述的杂交或扩增技术。 它们可用于比较获自患者的生物样品与标准样品中的基 因表达，以检测 CCAT-1 的差异基因表达或增加的表达水平。 用于此比较的定量方法是 本领域技术人员熟知的。 特别地，可使用定量 PCR(qPCR) 或实时定量 PCR(RT-qPCR) 分析来定量生物样品中的 CCAT-1 表达水平。 简要而言，实时定量 PCR 在扩增过程中 提供同步的监测。 随着扩增产物随程序继续而积累，其被连续地检测。 定量 PCR 和 RT-qPCR 是本领域技术人员已知的程序。
     作为非限制性实例，标记的探针可与从获自患者的生物样品制备的核酸混合。 将混合物保持在形成杂交复合体的条件下。 特定的培养之后，漂洗样品，并定量杂交复 合体的信号量。 还可将信号与标准值进行比较。 与正常标准相比获自个体的生物样品中 更高的 CCAT-1 信号指示癌症 ( 如 CRC 或肺癌 )。
     为了提供用于建立 CCAT-1 的差异表达或增加的表达的标准，评估了正常和疾 病的表达水平。 使取自正常受治疗者的核酸样品和与 CCAT-1 互补的寡核苷酸探针在允 许杂交的条件下反应。 然后测量杂交复合体的量。 可将以此方式获得的标准值与获自受 测试个体的生物样品的值进行比较。
     标准水平可通过测量未患癌症的个体 ( 称为 “正常受治疗者”) 中的 CCAT-1 表 达确定。 可选地，标准水平可根据生物样品中的参考基因的表达水平确定，所述生物样 品任选地为受测试个体的生物样品。 参考基因可以是看家基因，诸如本文中示例的看家 基因 ( 如 GAPDH)。 因此可通过与参考基因的表达水平相比的 CCAT-1 表达比值的增加 或以其它方式标准化的 CCAT-1 表达测量值的增加来鉴定生物样品中的差异 CCAT-1 表 达。
     标准还可通过比较组织与视为没有癌症的周围组织 ( 也称为 “非癌组织” 或 “正常组织” ) 中的 CCAT-1 水平来确定。
     在一些实施方案中，本发明的 CCAT-1 引物和 / 或探针可配制成多种形式，包括 溶液、悬浮液、乳液或冻干粉末。 制剂通过通常使用的技术灭菌。
     在另一方面，本发明提供一种寡核苷酸的阵列，其包含具有多个区段的基质， 其中至少一个所述区段包含与 CCAT-1 或其片段杂交的探针。 在特异性实施方案中，阵 列包含本发明的探针，如 SEQ ID NO ：5。 实施例 本文下面提供的实施例例证了本发明，但不意图限制本发明的范围。
     实施例 1 ：CCAT-1 的发现
     患者、细胞系、组织和 RNA
     结肠癌细胞系 HT-29 和 SK-CO-10 获自 ATCC(Manassas，VA)。 HT29 用于制备 代表性差异分析 (Representational difference analysis，RDA) 实验的待测 RNA。 结肠癌和
     相邻的正常组织样本获自由 Ludwig Institute 维持的组织库 (#4 至 29) 或 Hadassah-Hebrew 大学医学中心的组织库 (#96-218)。所有样品来自经历外科肿瘤切除并签署经设施内伦理 委员会 (InstitutionalReview Board(IRB)) 批准的书面知情同意书的患者。 总 RNA 通过异 硫氰酸胍 /CsCl 梯度纯化方法或 Trizol 试剂 (Sigma-Aldrich，St.Louis，MO) 获得。 正常 组织 RNA 板获自 Clontech(Mountain view， CA)。
     RDA 和 cDNA 克隆
     代表性差异分析 (RDA) 如先前所述地进行 (4)。 HT29 构成待测 RNA。 对于 驱动 RNA(driver)， RNA 汇集自三种正常的结肠组织。 利用 Tsp509I 或 DpnII 作为限制 性内切核酸酶进行三轮扩增。 分离和测序第二和第三扩增循环后产生的片段。 使用通过 RDA 鉴定的部分长度 CCAT-1 转录物在 λ-ZAPII 载体系统 (Stratagene， La Jolla， CA) 中筛选 HT29 cDNA 文库，由此获得全长 cDNA。
     CCAT-1 基因转录物和表达
     从 HT29 cDNA 文库克隆的全长 CCAT-1 cDNA 长 2528bp。 该转录物对应于跨越 nt.1-194 和 195-2528 的两个外显子，如通过针对两个带有约 9kb 的长内含子的染色体 -8 基因组克隆 (AC027531 和 AC020688) 的 BLAST 分析所揭示的。 该 cDNA 与在畸胎癌 (5) 中鉴定的 AK125310 相同。 与 AK125310 相比， CCAT-1 缺乏其 5’ - 端的 86 个核 苷酸，并在 3’ 具有附加的 313 个核苷酸。 CCAT-1(SEQ ID NO.1) 的完整序列为 ：
     GCCTTAATAGCTAGCTGGATGAATGTTTAACTTCTAGGCCAGGCACTACTCTG TCCCAACAATAAGCCCTGTACATTGGGAAAGGTGCCGAGACATGAACTTTGGTCTTCT CTGCAATCCATCTGGAGCATTCACTGACAACATCGACTTTGAAGTTGCACTGACCTGG CCAGCCCTGCCACTTACCAGGTTGGCTCTGTATGGCTAAGCGTTTTCTCCTAAAATCC CTTGAAAACTGTGAGAAGACCATAAGAAGATCATATCTTTAATTCTATTTCACAAGTCA CACAATATTCCAATCAAATACAGATGGTTGAGAAAAGTCATCCATCTTCCCTCCCCAC CCTCCCACAGCCCCTCAACCACTGCCCTGAAACTTATATGCTGTTATCCGCAGCTCCAT CTGGAGCATCACAGCTACTGTCAACCCTGACGCTCTTTCTGAAAAAACACCGGATGG ACATCAGAACTATTTCTTTAAGGATGTTACTGAGCCACACAGGAAAACTTGCCTTATG ATTTTGAATGCACGGATCTGATTTGACTAAACATGATAACTAGAGAATCACCCAATCTA CTCCCATTTTCAACTCTAAATCATCAGAGTGTCTCAAATCCAAAGCACACACAGACCA GCCTGGCCAACACGGTGAAACTCCACCCCTACTAAAAGTATAAAAATTATCCAGGTGT GGTGGCGGGCGCCTGTAATCCAAGCTACTTGGGAGTCTGGAGGCAGGAGAATCCCTT GAACCTGGGAGATGGAGGTTGCAGTGAGCAGAGATCACACCACCGCACTCTAGCCTG GGCCACAAATCAACAACAACAACAACAACAAAAAACAAAGCGCACACAGAGACTGA GGTCCTCTTTGGCATTGAGAAGATGGCTATGCAAGTCCCAACTAGCAAGTGCAAACTT CCCAGCTTCACTTCTGCCAGTGTCCCTTCACCCCTTCTCAACCCCACTGGGAGGCAGG AGGGTGCTTGACAATAACAGCCTTGGCATCACTCTGCCAGGGTGTAATAGGAACTGTT ACAATTCTGAGATTCTGTGTAAGCACTGGCCTTTCTGCCTAGAATGCCTTCTCCTCTCT TTTTTAACTGCATGCTCCTATTTATCTTTCAAAGCCCGGAAAAAATAACACTGCACACG GGAAATGCTCCCTTCCTACTGCAGTCATTTAGATGACTCTATGCCATTCCATTCATTTC
     TCTTTCCTACCACAGAAGTGCTTTGAGATTTTGGAGTCAGACTGCTTGAACTTGAATC CTGGCCCTCTCATCAGAGACTTGACTTATTTTAGGCAAGTTATATAACCAATTTTACCTC AGTTCCTTACCCATAAAATGGGTCTAATGAGAGTACCTACCACACAGAATTTTGATGA AAACTGAATGAGATGAAGGCCTTTAAGGCAGTGGTCCCCAACCCTGGGGACACAGAC AGGTACCATTTTGTGGCCTGTTAGGAACTGGGCCACACAGCAGGAGGTGAGCAGTGG GTGAGTGAGATCAGCGTTATTTACAGCTGCTCCCCATTGCTCACCTTACTGCCTGAGCT CCACCTCCTGTCAGATCAGCAGTGGCATTAAATTCTCATAGCAGCACAAACCCTGTCA TGAACTGCACATGCGAGGGATCTAGGTTGTGCGCTCCTTATGAGAATCTAATGCCTAA TGACCTGTCACCGTCTCCCATCACCCCTAGATGGGAGTGTCTAGTTGCAGGAAACAAG CTCAGGGCTTCCACTGATTCTACATTATGGTGAGTTGTATAATTATTTCATTATATAATAC AATGTAATAATAATAGAAACACAGTGCACAACAAATGTAATGTGCTTGAATCATCCCC AAACCATCCCAGTCCACGGTCTTCCACATTTTGTCTTTTCACAAAATTGTCTTCCACA AAACTGGTCCCTGGTGCCAAAAAGGCTTGGGACCACTGCTTTAAAGCCTTTGCATAG TGCTTAGAATTGAGGGGGAAAAAAAAAACAAAAACAATGTAGCTAGTTGCTACAATC ACTATATTGGTGAGTTTCAAAAGGAAAAGAATTCTGTCCCATTTATGCTTGAGCCTTG AGTTGCTAACCAAGCCTGACACAAAATTACTGTTGAAGGGATGTGTGAGTCCTAATTG AAATGAGGCCTCTTAAGGGAATTGTGGACCAAACCCCAAGCAGGCAGAAAGCCGTAT CTTAATTATTGCAAGTATTTCAGGCAAGGTGTGGATGGCCATTTGAATTCAAGCAGAC TAGGACCTGGGATGAGAAAGAAGGTGTGTACGTGACTTGATCTTTGAACTTTAGCTCA CCATCTGGAAGAAGGCTGAGTATTCTCTGCACTCACATAGTAGCTAATGCCTACTCCCC AGCCACCCACAATTCTTTCTGTAGGAAGGCTCGCTAGAATACTTTGTGATATTGGATAT TAGTTCCATATTCTACTGTGTATCTTAGTTCAACCAAATTGTAATCATCTGATATTTATTT CTTTTAATATAAATATAAGTATATTAAGTCTTAAAAAAAAAAAAAAAA
     实时 RT-PCR
     1μg 总 RNA 用于 10μl 反应中的反转录，其中 2μl 用于 PCR。 所有实验进行 两个重复或三个重复。 PCR 使用以下引物进行 45 个循环 ( 变性 ：95℃，15 秒钟 ；退火 / 延伸 ：60℃，1 分钟 ) ：正向引物 ：5’ -TCACTGACAACATCGACTTTGAAG(SEQ ID NO ：2) ；反向引物 ：5’ -GGAGAAAACGCTTAGCCATACAG(SEQ ID NO ：3) ；探针 (SEQ ID NO ：4) ：6Fam-CTGGCCAGCCCTGCCACTTACCA-Tamra。根据生产商的说明 进行绝对定量 (PE Biosystems， User Manual 2( 用户手册 2))。 GAPDH 基因用作参考基 因。 相应地，每个样品根据其 GAPDH 含量 ( 表达水平 ) 以及针对校准物 (SK-CO-10) 被 标准化。 相对量通过下式确定 ： 绘制相应于含有 CCAT-1cDNA的质粒 DNA 的稀释液的标准曲线，并使用该曲线确定 SK-CO-10 中 CCAT-1mRNA 的 量。 将此因子乘以各样品的相对量以获得作为 fg/100ng cDNA 的 CCAT-1 量。 所有实验 使用 ABI Prism 7000 系统 (Applied Biosystems， Foster City， CA) 进行。
     实施例 2 ：正常组织以及结肠和直肠的腺癌中的 CCAT-1 表达
     通 过 定 量 实 时 PCR 检 验 了 一 组 18 种 正 常 组 织 中 CCAT-1 的 表 达 ( 图 1)。 CCAT-1 表达在 0.008fg( 骨骼肌 ) 至肾中的 402fg 范围内。 与 SK-CO-10 相比，正常组织中的 CCAT-1 水平低 20- 倍 ( 肾 ) 至超过 350- 倍 ( 结肠 )。 相反，肿瘤组织中的平 均 CCAT-1mRNA 水平为 2090fg(p ＜ 0.0001，与正常的结肠相比 )，并在 280fg(27) 至超 过 8000fg(11) 范围内，图 2。 在与肿瘤相邻的正常组织中，平均 CCAT-1mRNA 水平为 587fg(p ＝ 0.04，与正常的结肠相比 )，并在 0.1fg(N29) 至 6631fg(N14) 范围内，图 2。 在图 2 中，研究了肿瘤和相邻的正常组织的配对样品。
     实施例 3 ：外周血单核细胞 (PBMC) 中的 CCAT-1 校准曲线
     此研究部分的所有实验使用 ABI Prism 7500 系统 (Applied Biosystems， Foster City，CA) 进行。 为了对给定样品中的 CCAT-1 含量定量测量，生成了校准曲线。 结肠 癌细胞系 HT-29 和 COLO-205 获自 ATCC(Manassas， VA)。 外周血单核细胞 (PBMC) 获自 10 位健康志愿者的外周血。 PBMC 通过菲可 (Ficole) 梯度方法分离，并在 -70℃储 存。 将 PBMC 和结肠癌细胞以结肠癌细胞的增加的浓度混合 (1 ∶ 1×106、1 ∶ 5×105、 1 ∶ 1×105、1 ∶ 5×104、1 ∶ 1×104、1 ∶ 5×103、1 ∶ 1×103、1 ∶ 500、1 ∶ 100、 1 ∶ 50、1 ∶ 10、1 ∶ 1，和纯的结肠癌细胞 )。
     提取 RNA 并进行 CCAT-1 的实时 PCR。 为了研究 CCAT-1 的 RT_PCR 对检测 小群体癌细胞的敏感性，我们生成了校准曲线 ( 图 3-5)。 将增加的浓度的结肠癌细胞系 (HT29) 细胞与 106 个 PBMC 混合。 癌细胞检测的最低阈值为 106 个 PBMC 中 5 个癌细胞 的浓度 ( 图 3)。
     实施例 4 ：正常结肠粘膜、前恶性 (pre-malignant) 粘膜、腺瘤性息肉、结肠原 发性腺癌和远端转移灶中的 CCAT-1 表达
     将获自由于良性疾患经历结肠切除的患者的正常结肠粘膜样品、与结肠腺癌位 点相邻的正常粘膜样品、腺瘤性息肉样品、结肠或直肠的原发性腺癌样品以及来自肝或 腹膜转移灶的样品在液氮中急速冷冻。 从所有组织样品中按照先前所述提取 RNA 并进行 CCAT-1 的实时定量 PCR( 图 6)。
     实施例 5 ：结肠癌患者的血液和淋巴结中隐性转移疾病的检测
     患者
     年龄超过 18 岁的具有组织学证实的结肠原发性腺癌的患者被提供参与此研究。 具有远端转移灶的患者或者接受在先放疗或化疗的患者被排除在研究外。 研究方案得到 Institutional Review Board(IRB， HelsinkiCommittee)Hadassah-Hebrew 大学医学中心的批 准。 获得了所有研究参与人员的书面知情同意书。
     哨兵淋巴结定位和收获
     患者经历包括含有引流淋巴系统的正常楔形肠系膜的结肠腺癌的标准外科切 除。 取出外科样本 ( 结肠和肠系膜 ) 之后，立即使用结核菌素注射器和针头在肿瘤周围 的四个象限浆膜下注射 ( 活体外 )2-5ml 异舒泛蓝染料 (Patent Blue V， France)。 然后在 后桌 (back table) 上评估肿瘤和淋巴结的总体切除，并解剖肠系膜的所有蓝色结。
     活体外鉴定 SLN 之后，将沿着结的纵轴通过门 (hilum) 划分的一半 SLN 在液氮 中急速冷冻。 原发性肿瘤的一小部分 ( 整个肿瘤体积的～ 25％ ) 和正常粘膜的少量样品 (0.5 克 ) 相似地急速冷冻。 使用单独的仪器进行活体外 SLN 和原发性肿瘤切除，以使结 的肿瘤细胞污染最小。
     病理学处理和细胞角蛋白免疫组织化学带有附着的肠系膜的原发性肿瘤样本和剩余的一半 SLN 作为分别标记的样本被 提交至 Hadassah-Hebrew 大学医学中心病理学系。一旦证实结肠腺癌的诊断，福尔马林固 定、石蜡包埋的蓝色结即经受大约 40μm 厚度的四个水平 (level) 的连续步骤切片，并用 H&E 染色。 此外，在块的第二和第四水平制备两个未染色的载玻片以用于免疫组织化学 染色，一个用于细胞角蛋白抗体染色，另一个充当阴性对照。 使用亲和素 - 生物素 - 过 氧化物酶复合物方法对福尔马林固定和石蜡包埋的 SLN 切片进行免疫组织化学。 商业获 得的细胞角蛋白抗体混合物用于此研究 ( 广谱角蛋白 (Pan-keratin)AE1/AE3，CAM 5.2， 35bH11， Ventana Medical Systems， Tucson， AZ)。 内源过氧化物酶通过与 1％过氧化氢 一起培养来抑制。 二氨基联苯胺四盐酸盐 (DAB， Biogenex， San Ramon， CA) 用作色 原体。 福尔马林固定、石蜡包埋的扁桃体切片用作阳性对照，并将来自 SLN 块的一个切 片与阴性对照缓冲液一起培养。 对来自 SLN 的每个组织块检查了总计四个 H&E 和两个 细胞角蛋白免疫染色切片。 如果鉴定了展示结肠癌细胞的解剖学和细胞学特征的强烈阳 性的单个细胞或细胞群集，则细胞角蛋白免疫染色被视为阳性。
     实施例 6 ：哨兵淋巴结中的细胞角蛋白 -20、 CCAT-1 的 RT-PCR
     RNA 提取
     所有样品 ( 肿瘤、淋巴结、血液和正常组织 ) 的总 RNA 提取通过 TriReagent 方 法进行。 在合成 cDNA 之前，在凝胶上运行产物以评估 RNA 质量。
     将冷冻样品在干冰中粉碎，使用 Polytron 匀浆机在 Trireagent(molecular research center， inc.， Cincinnati， oh， usa) 中匀浆，并根据生产商的说明进行处理。
     实时 RT-PCR
     1μg 总 RNA 用于 20μl 反应中使用随机引物的反转录，其中 2μl 用于 PCR。 所 有实验进行两个重复。 PCR 进行 40 个循环 ( 变性 ：95℃，15 秒钟 ；退火 / 延伸 ：60℃， 1 分钟 )，使用 CK20 特异性引物和 探针 (AppliedBiosystems，如所需地测定 )。 对于 CCAT-1 表达分析，使用的引物如上文所述。 每种样品根据其 GAPDH 含量进行标 准化。 针对 CK20 表达计算对校准物的相对定量。
     因为在淋巴结和外周血淋巴细胞中， CCAT-1 阴性样品即使通过实时 PCR 在 绝对量上也是不可检测的，所以相对量确定是无关的，并且分析的样品仅评估为此转 录物表达的阳性或阴性。 这部分研究的所有实验使用 ABI Prism 7500 系统 (Applied Biosystems， Foster City， CA) 进行。 提取 RNA，并对 CCAT-1 进行实时 PCR。
     结肠癌患者的哨兵淋巴结中的 CCAT 1 表达
     对所有肿瘤和 SLN 组织以及获自无恶性肿瘤患者的 2 个正常淋巴结和获自健康 个体的 3 个 PBMC 样品进行实时 PCR。 所有五个阴性对照中无 CCAT-1 的表达并且仅有 痕量 CK20。 因此，对于 CK-20 值， “阳性” PCR 被设置为与阴性对照值相比 RNA 含 量高 50 倍，并且因为阴性对照没有 CCAT-1 的扩增，我们使用具有 CCAT-1 含量的每个 SLN 作为阳性。 通过 H&E 在 7/44 患者中、通过 CK 的 IHC 在 14/44 患者中 ( 通过卡方 检验，与 H&E 相比 p ＜ 0.0001) 和通过 PCR 在 23/44 患者中 ( 通过卡方检验，与 H&E 相 比 p ＝ 0.006，图 6，表 1) 鉴定了具有 CRC 转移灶的哨兵淋巴结。 所有 H&E 阳性 SLN 通过 CK 的 IHC 和通过 PCR 也是阳性。 但是，在仅通过 CK 的 IHC 为阳性的七个 SLN
     中，四个还是通过 PCR 阳性的。 通过 H&E 和 IHC 为阴性的另外 12 个 SLN 通过 PCR 为 阳性 ( 图 7)。
     呈现了 CK-20 和 CCAT-1 的 qPCR 扩增曲线 ( 图 8-9)。 与 CCAT-1 相比，通过 CK-20 扩增了更高量的 cDNA。
     表 1 ：通过检测方法， SLN 中 CRC 转移灶的存在
     样品 332 456 193 195 479 480 485 400 400 491 491 491 375 360 353 307 434H&E 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阳性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阳性IHC 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阳性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阳性CK 肿瘤 CK SLN CCAT-1 肿瘤 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阳性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阳性 阳性 阳性 阳性 阴性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性CCAT-1 SLN 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阳性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阳性 阳性19CN 102027128 A CN 102027143 A说阳性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阳性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阳性 阴性 阴性 阴性 阴性 阳性 阴性 阴性 阴性 阳性 阴性 阴性 阴性 阴性 阳性 阳性 阳性 阳性 阴性 阴性 阴性 阳性 阳性 阴性 阴性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性明书阳性 阳性 阴性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阳性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阳性 阴性 阴性 阴性 阳性17/24 页434 435 435 441 447 354 381 391 361 374 395 395 358 340 340 392 404 410 313 318 373阳性 阳性 阴性 阳性 阳性 阳性 阳性 阴性 阴性 阳性 阳性 阴性 阴性 阴性 阳性 阴性 阳性 阴性 阳性 阳性 阳性20CN 102027128 A CN 102027143 A说阴性 阴性 阴性 阴性 阳性 阳性 阴性 阳性 阴性 阴性 阳性 阳性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性明书阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阳性 阴性 阴性 阳性 阳性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性18/24 页429 397 498 498 498 501 LN LN 血液 血液 血液
     阴性 阳性 阴性 阴性 阳性 阳性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性实施例 7 ：用于使用 CCAT-1 的 CRC 早期检测的基于 RNA 的粪便测定
     因为在淋巴结和外周血淋巴细胞中， CCAT-1 阴性样品即使通过实时 PCR 在 绝对量上也是不可检测的，所以相对量确定是无关的，并且分析的样品仅评估为此转 录物表达的阳性或阴性。 这部分研究的所有实验使用 ABI Prism 7500 系统 (Applied Biosystems， Foster City， CA) 进行。
     提取 RNA，并对 CCAT-1 进行实时 PCR。
     粪便样品
     年龄超过 18 岁的呈现有原发性、非转移性 ( 临床 I-III 期 ) 结肠癌诊断的男性或 女性患者、或在胃肠病学日间护理部 (day-care) 的被安排经历完整结肠镜检查的患者参 加此研究。
     第 1 组 -(N ＝ 15) 经历组织学证明的结肠癌的切除手术的患者 ；
     第 2 组 -(N ＝ 15) 经历完整结肠镜检查而没有在结肠镜检查中发现任何肿瘤或息 肉的患者。
     研究设计
     收集粪便样品并立即在液氮中急速冷冻。
     来自组织学证明的结肠腺癌的总 RNA 用作 PCR 的阳性对照。 阴性 PCR 对照包 括来自健康志愿者的 PBMC 和没有模板的反应混合物 ( 内部对照 )。
     CRC 患者的粪便样品中的 CCAT-1 表达
     从 15 位具有腺癌的患者和 15 位没有腺癌的患者收集粪便样品。
     RNA 提取
     粪便样品获自所有研究参与人员 (n ＝ 30)。
     RNA 可提取自新鲜样品，然而此类样品可能未含有用于分析的足量 RNA。 来自 结肠镜检查或结肠手术的肠道准备之前的患者的结肠洗液也可用于充足量和质量的 RNA 提取。 但是，此方法要求通过离心的多个浓缩步骤。 发现优选的 RNA 提取方法是通过 在液氮中急速冷冻粪便样本。 此方法产生用于分析的足量 RNA。 分析了各种量的粪便 样品，最高的 RNA 量和质量在 150mg 新鲜冷冻粪便中实现。 比较了三种不同的 RNA 提 取试剂盒，最佳结果是由 试剂盒实现的。 最终确定 RNA 提取方案之后，从 12/15(80.0％ ) 研究组样品和 9/15(60.0％ ) 对照组样品中成功提取了 RNA。
     PCR 结果
     最初在正常结肠样品中研究了所有三种标志物 (A33、Co58 和 CCAT-1)。 A-33 和 CO-58 二者在正常组织中表达，因此我们选择集中在 CCAT-1 作为我们的测定的单一 标志物。
     对具有充足 RNA 的所有样品 (n ＝ 21) 进行实时 ( 定量 )PCR。 没有证据表明 健康个体 (n ＝ 9) 的粪便中有 CCAT-1。 4/12(33.3％ ) 的来自 CRC 患者的粪便样品中有 CCAT-1 的显著表达 (p ＝ 0.001，表 2 和图 10)。
     表 2 ：CRC 患者的临床和分子特性。实施例 8 ：结肠癌患者的外周血中 CCAT-1 的存在
     血液样品
     15ml 血液获自参与研究的患者 (n ＝ 20)。 血液样品通过菲可梯度方法分离，并 在 -70℃储存。 提取 RNA 并进行 CCAT-1 的实时 PCR。 将结果与校准曲线进行比较。
     结肠癌患者的外周血中的 CCAT-1 表达
     为了研究 CCAT-1 的 RT-PCR 对检测小数量癌细胞的敏感性，我们生成了校准曲 线。
     将增加的浓度的结肠癌细胞系 (HT29) 细胞与 106 个 PBMC 混合。 癌细胞检测 的最低阈值为在 106 个 PBMC 中 50 个癌细胞的浓度 ( 图 3-5)。
     如图 11 中可见的，在健康个体的外周血样品中不能检测到 CCAT-1 表达。 相 反，可容易地在结肠癌患者的外周血样品中检测到不同程度的 CCAT-1 表达 ( 图 12)。
     实施例 9 ：另外的结肠直肠癌细胞系中的 CCAT-1 表达
     在宽范围的结肠直肠癌 (CRC) 细胞系中检查了 CCAT-1 的表达。 选择了 18 种 CRC 细胞系用于实验。 在这一环境中， HT-29 被设置为 CCAT-1 表达的参考。 从所有 细胞系中提取 RNA，并使用确立的方法生成 cDNA。 使用实时定量 PCR 即 qPCR 测量此 组 CRC 细胞系中的相对 CCAT-1 表达。
     表 3 ：与 HT-29 相比，18 种 CRC 细胞系中的 CCAT-1 表达的实时 ( 定量 )PCR 结果。
     CRC 细胞系 平均 Ct HT29 CaCO2 HCT15 LS 174T SK-CO-1 SW 403 SW 1222 SW 620 SW 802 SW 837 CO 61 SK-C0-11 SK CO 10 25.2 20.49 21.102 20.974 19.739 19.725 19.584 21.282 19.901 18.677 19.613 18.461 20.02523CN 102027128 A CN 102027143 A说SW1083 HT29 LOVO WS1116 SW48 SK-CO-17明书21/24 页21.026 26.229 21.04 21.366 20.244 20.34平均 Ct ＝扩增的 PCR 循环数 ( 循环数越低，样品中的特异性 cDNA 含量越高， CCAT-1 表达越高 )。
     图 13 显示与 HT-29 相比，18 种结肠直肠癌细胞系的相对 CCAT-1 表达。 将任何 给定样品中的相对 CCAT-1 表达与 HT-29( ＝ 1) 中的 CCAT-1 表达进行比较。 相对表达 值根据给定样品、样品中的看家基因 (GPADH) 和 HT-29 样品之间的平均 Ct 差异计算。
     实施例 10 ：代表结肠直肠癌以外的癌症的细胞系中的 CCAT-1 表达
     为了例证其他类型的人类癌症中的 CCAT-1 表达，通过 qPCR 筛选了代表几种常 见的人类癌症的多个细胞系的 CCAT-1 表达。
     非小细胞肺癌
     非小细胞肺癌 (NSCLC) 是人类肺癌的最常见形式。 它还是世界范围内癌症相关 死亡的主要原因。
     对比研究了来自 NSCLC 患者的人类肿瘤组织与相应的正常肺组织中的 CCAT-1 表达。 还研究了代表 NSCLC 的 16 种细胞系。 CCAT-1 表达通过定量 PCR 分析确定。
     表 4 ：16 种肺癌细胞系中的 CCAT-1 表达的实时 ( 定量 )PCR 结果
     样品 HT 29 612T 612N 615T 615N 618T平均 Ct 25.5 25.356 0 30.377 36.17 37.5492-ddCt 1 0.3175 结肠校准物 NSCLC 肿瘤组织 相应的肺组织 0.0117 8E-05 6E-05 NSCLC 肿瘤组织 相应的肺组织 NSCLC 肿瘤组织24CN 102027128 A CN 102027143 A说37.407 29.953 32.276 25.769 0 25.355 25.477 26-867 25.091 0 31.842 0 27.729 0 28.378 0 20.259 31.673 36.392明书相应的肺组织 NSCLC 肿瘤组织 相应的肺组织 NSCLC NSCLC22/24 页618N 629T 629N sk-lc-7 sk-lc-29 KNS-6 A549 sk-lc-1 sk-lc-12 SW1271 Luci4 calul sk-luci-8 sk-lc-13 sk-lc-5 sk-lc-19 Luci-13 SHP-77 sk-lc-2
     0.0001 0.0081 0.003 0.04850.0177 0.308 4.5159 0.2512NSCLC NSCLC NSCLC NSCLC NSCLC0.003NSCLC NSCLC0.0273NSCLC NSCLC0.0485NSCLC NSCLC2.9302 0.0003 0.0002NSCLC NSCLC NSCLC平均 Ct ＝扩增的 PCR 循环数 ( 循环数越低，样品中的特异性 cDNA 含量越高， CCAT-1 表达越高 )。 2-ddCt. ＝看家基因 (GPADH)Ct、 HT-29Ct 和感兴趣的样品 Ct 之 间计算的对数差异。 在 2/16 细胞系 (12.5％ ) 中测量到 CCAT-1 的过表达，这 2 个细胞 系是 sk-lc-1 和 Luci-13( 参见表 4)。NSCLC 细胞系中的 CCAT-1 表达 ：相对表达通过看家基因、HT-29( ＝ 1) 和感 兴趣的样品之间的 Ct 差异计算。
     图 14 显示与 HT-29 相比，16 种 NSCLC 癌症细胞系的相对 CCAT-1 表达。 将 任何给定样品中的相对 CCAT-1 表达与 HT-29( ＝ 1) 中的 CCAT-1 表达进行比较。 相对 表达值根据给定样品、看家基因 (GPADH) 和 HT-29 样品之间的平均 Ct 差异计算。
     实施例 11 ：乳腺癌细胞系中的 CCAT-1 表达
     乳腺癌是女性中癌症相关的死亡的主要原因。 尽管诊断和治疗有很大进展，但 是晚期患者的总体结果很差。 用于诊断、分期和治疗的新靶标对于改善两种疾病的结果 都是重要的。 因此，使用 qPCR 筛选了代表乳腺癌的 13 种细胞系的 CCAT-1 表达。
     表 5 ：乳腺癌细胞系中 CCAT-1 表达的实时 ( 定量 )PCR 结果
     平均 Ct ＝扩增的 PCR 循环数 ( 循环数越低，样品中的特异性 cDNA 含量越高， CCAT-1 表达越高 )。
     2-ddCt. ＝看家基因 (GPADH)Ct、 HT-29Ct 和感兴趣的样品 Ct 之间计算的对数 差异。
     所研究的 13 种乳腺癌细胞系中没有显著的 CCAT-1 表达。 此外，还研究了 6 种 黑素瘤细胞系中的 CCAT-1 表达。 没有一种黑素瘤细胞系显示显著的 CCAT-1 表达。
     实施例 12 ：原位杂交分析
     为了验证结肠癌组织中的 CCAT-1 表达和研究表达的形态学模式，进行了原位 杂交。
     来自含有肿瘤组织 (n ＝ 2) 和相邻的正常粘膜 (n ＝ 2) 的石蜡块的载玻片被用于染色。 制备 CCAT-1 的探针 ( 显示于图 16A ；SEQ ID NO.5) 以用于分析 CCAT-1 表达 的形态学模式，该探针具有以下序列 ：
     CCCGGATCCGCCTTAATAGCTAGCTGGATGAATGTTTAACTTCTAGGC
     CAGGCACTACTCTGTCCCAACAATAAGCCCTGTACATTGGGAAAGGT
     GCCGAGACATGAACTTTGGTCTTCTCTGCAATCCATCTGGAGCATTCA
     CTGACAACATCGACTTTGAAGTTGCACTGACGGGTGT
     因 为 该 基 因 不 被 翻 译， 所 以 将 探 针 克 隆 到 两 个 不 同 质 粒 以 生 成 有 义 和 反 义 探 针。 合 成 反 义 RNA 探 针， 插 入 序 列 通 过 T7 RNA 聚 合 酶 被 插 入 到 pBluescript-KS(pBSKS，细菌载体，3Kbp 长 )，并合成有义 RNA 探针，插入序列通过 T7 RNA 聚合酶被插入到 pBluescript-SK(pBSKS，细菌载体，3Kbp 长 )。 插入序列的大小为 165bp( 图 15)。 两个质粒为 ：
     1.pBluescript-SK(+)[pBSSK+]，细菌载体，3Kbp 长。
     2.pBluescript-KS(-)[pBSKS-]，细菌载体，3Kbp 长。
     这些载体是商业可得的，例如通过 Stratagene， CA.。 应理解，在这一点上，可 使用其他载体和相似的载体。
     图 16B 例证了基于筛选的原位杂交，其中显示了结肠腺癌 (a) 和相邻的正常粘膜 (b) 中的 CCAT-1 染色。 更强的 CCAT-1 染色见于肿瘤组织 (a)，相比之下，相邻的正常 粘膜中如果有 CCAT-1 染色的话，也是更低的强度。 这与显示与肿瘤相邻的正常粘膜中 的低 CCAT-1 表达的实时 PCR 结果相互关联。
     实施例 13 ：健康志愿者的外周血中的 CCAT-1 表达
     还研究了健康志愿者 (n ＝ 10) 的血液样品中的 CCAT-1 表达。
     图 17 是显示健康志愿者的外周血样品中的 CCAT-1 表达的图。 在所有血液样品 中未检测到 CCAT-1cDNA 的相对量 ( 表达 )。 如所预期的，作为阳性对照的含有肿瘤组 织的 T-400 样品中有强的 CCAT-1 扩增。
     参考文献
     1.Cancer statistics( 癌 症 统 计 学 )，2000.Greenlee RT-CA Cancer J Clin-2000 Jan-Feb ；50(1) ：7-33.
     2.Midgley R， Kerr D.Colorectal cancer( 结 肠 直 肠 癌 ).Lancet 1999 ；353 ： 391-399.
     3.Cohen Am，Kelsen D，Slatz L，等人 Adjuvant therapy for colorectalcancer( 结肠 直肠癌的佐剂治疗 ).Curr Prob Cancer 1998 ；22 ：5-65.
     发明背景
     结肠和直肠的腺癌 (CRC) 是每年在世界范围内影响超过一百万人的常见疾病 (1)。 目前的 CRC 筛选主要是基于大便潜血检验，而诊断是基于结肠镜检查和组织活 检。 目前的筛选程序对于降低 CRC- 相关的死亡率具有一些作用 (2)，但是需要更准确的 筛选和诊断形式。 化疗剂单独或与靶向治疗联合改善了转移性患者的中位数存活率，并 降低了经历 CRC 的完全切除和处于复发的高风险的患者 ( 具有淋巴结转移灶或不利的组 织学的患者， (3)) 中的疾病复发。 尽管 CRC 治疗有大的进展，但是约 50％的诊断患有 CRC 的患者将在诊断后 5 年内死于疾病。
     在正常组织中不表达的 CRC- 特异性分子是用于治疗的潜在靶标。 现在几乎没 有在 CRC 中独特表达而在正常组织中不表达的分子标志物。 使用 cDNA 阵列的普查没有 鉴定可用于诊断和用作治疗靶标的 CRC 相关的分子标志物。
    发明概述
     本发明是基于在癌细胞特别是结肠、直肠癌中特异性表达的独特核酸转录 物 的 鉴 定、 分 离 和 测 序。 根 据 其 独 特 表 达 谱， 该 分 子 被 称 为 结 肠 癌 相 关 的 转 录 物 1(CCAT-1)。 该分子的完整序列公开于下文，并被命名为 SEQID NO ：1。
     随后，还发现 CCAT-1 在肺癌中表达。 因此，通过其第一方面，本发明提供诊 断癌症或癌前病变的方法，包括测量生物样品中 SEQ ID NO.1(CCAT-1) 或其片段的表达 水平 ；其中生物样品中 SEQ ID NO.1(CCAT-1) 或其片段的表达指示癌症或癌前病变。
     在一种实施方案中，所述方法还包括将在生物样品中测量的所述表达水平与标 准进行比较，其中生物样品中 SEQ ID NO.1(CCAT-1) 或其片段的更高的表达水平指示癌 症或癌前病变。
     在一种实施方案中，本发明的方法包括 ：
     (a) 从获自受治疗者的生物样品中分离核酸 ；
     (b) 将能够识别 CCAT-1 的探针与所述核酸在允许形成杂交复合体的条件下杂 交 ；和
     (c) 将杂交复合体形成与标准进行比较 ；
     其中生物样品中更高水平的杂交复合体指示癌症或癌前病变。
     在另一种实施方案中，本发明的方法包括 ：
     (a) 从获自受治疗者的生物样品中分离核酸 ；
     (b) 在所述分离的核酸中扩增 CCAT-1 或其任何片段 ；
     (c) 显现 CCAT-1 扩增产物 ；和
     (d) 将 CCAT-1 扩增产物的量与标准进行比较 ；
     其中更高水平的 CCAT-1 扩增产物的存在指示癌症或癌前病变。
     在具体实施方案中，所述扩增通过使用 CCAT-1 特异性探针的聚合酶链式反应
     (PCR) 进行。 在优选的实施方案中，所述 PCR 是实时定量 PCR。
     根据本发明的术语癌症或癌前病变的诊断还涵盖癌症或癌前病变的分期，以及 体内成像。
     根据本发明的一种实施方案，所述标准是通过测量未患癌症的受治疗者中 CCAT-1 的表达水平而确定的。
     在另一种实施方案中，所述标准是通过测量所述同一受治疗者的非癌组织中 CCAT-1 的表达水平而确定的。
     根据本发明的某些实施方案，所述癌症选自以下组成的组 ：结肠癌、直肠癌、 肺癌和所述癌症的转移灶，包括微转移灶 (micro-metastase)。
     根据另一种实施方案，本发明的方法诊断的癌前病变是腺瘤性息肉。
     根据本发明的某些实施方案，所述生物样品选自以下组成的组 ：组织、血液、 尿、粪便和骨髓样品。 优选地所述生物样品是组织活检。 组织活检可获自例如结肠、直 肠、肝、肺和淋巴结。
     在另一种实施方案中， CCAT-1 表达水平是通过原位杂交测量的。
     在 另 一 方 面， 本 发 明 提 供 一 种 分 离 的 寡 核 苷 酸， 其 包 含 SEQ ID NO ： 1(CCAT-1) 或其互补序列的至少 8 个连续核苷酸，优选地用作探针或引物。 在一个具体 实施方案中，寡核苷酸探针包含 SEQ ID NO ：5。
     根据某些实施方案，本发明的分离的寡核苷酸意图用于检测生物样品中的 CCAT-1 表达。
     根据某些实施方案，本发明的分离的寡核苷酸意图用于诊断癌症。
     在另一方面，本发明提供一种用于检测生物样品中 CCAT-1 的表达的方法，包 括：
     (a) 从所述生物样品分离核酸 ；
     (b) 将本发明的寡核苷酸探针与所述核酸在允许形成杂交复合体的条件下杂交 ； 和
     (c) 将杂交复合体形成与标准进行比较，其中生物样品中更高水平的杂交复合体 指示样品中 CCAT-1 的表达。
     在一种实施方案中，所述方法还包括在杂交之前扩增所述生物样品中转录的核 酸。
     在另一方面，本发明提供一种分离的核酸，其包含与 SEQ ID NO ：1 具有至少 85％同源性的 CCAT-1 或其片段。在一种实施方案中，所述分离的核酸包含 SEQ ID NO ： 1 或其片段的核酸序列。 在一种实施方案中，所述核酸是 mRNA。 在另一种实施方案 中，所述核酸是 cDNA。
     在另一方面，本发明提供组合物，包括药物组合物，其包含如上所述的本发明 的分离的寡核苷酸、分离的寡核苷酸探针或分离的核酸。 在具体实施方案中，所述组合 物被连接至基质。
     本发明还包括包含本发明的分离的核酸的载体，以及包含所述载体的宿主细 胞。
     在另一方面，本发明提供一种试剂盒，其被划分以容纳用于测量获自受治疗者的生物样品中的 CCAT-1 表达水平的至少一种试剂，所述至少一种试剂包含与 CCAT-1 转 录物的至少一种片段杂交的至少一种寡核苷酸探针或引物。
     在又一方面，本发明提供一种阵列，其包含具有多种区段的基质，其中所述区 段中的至少一种包含与 CCAT-1 或其片段杂交的探针。
     本发明还包括癌症或癌前病变的成像，所述癌症或癌前病变包括但不限于腺瘤 性息肉、结肠或直肠的原发性腺癌、肺癌、淋巴结转移灶和远端转移灶，通过向受治疗 者施用能够识别 CCAT-1 的探针，其中所述探针轭合至包括但不限于放射性同位素、荧 光染料、可见染料 (visible dye) 或纳米颗粒的指示分子，并通过成像装置检测标记。
     附图简述
     为了理解本发明和查看其在实践中可如何被实施，下面将参考附图，仅通过非 限制性实施例来描述实施方案，其中 ：
     图 1 是显示商业可获得的来自正常组织的 cDNA 板中 CCAT-1 转录物水平的实时 PCR 定量分析的图。 左侧的柱代表结肠癌细胞系 SK-Co-10 中的 CCAT-1 转录物水平。
     图 2 是显示结肠癌 ( 黑色条 ) 和相邻的正常组织 ( 白色条 ) 中的 CCAT-1 转录物 水平的实时 PCR 分析的图。 样品编号显示在 X- 轴。 C ＝对照 /SK-CO-10。 图 3 是显示低浓度 HT-29 细胞中 CCAT-1 的校准曲线的图。 扩增在获自未患结 肠癌的受治疗者的外周血单核细胞 (PBMC) 中稀释的增加浓度的 HT-29 结肠癌细胞中的 CCAT-1。 扩增的 CCAT-1 cDNA 的相对量 (RQ) 显示于 y- 轴，并使用单独获自未患结肠 癌的受治疗者的 PBMC 作为参考样品进行计算。 CCAT-1 cDNA 的相对量与 HT-29 肿瘤 细胞浓度相关。 最低剂量 ：1×106 个 PBMC 中 5 个肿瘤细胞至高达 1×106 个 PBMC 中 500 个肿瘤细胞 (HT29)。
     图 4 是显示中间浓度的 HT-29 细胞的校准的图。 扩增在获自未患结肠癌的 受 治 疗 者 的 PBMC 中 稀 释 的 增 加 浓 度 的 HT-29 结 肠 癌 细 胞 中 的 CCAT-1。 扩 增 的 CCAT-1cDNA 的相对量 (RQ) 使用单独获自未患结肠癌的受治疗者的 PBMC 作为参考样 品进行计算。 CCAT-1cDNA 的相对量 (y- 轴 ) 与 HT-29 肿瘤细胞浓度相关。 最低剂量 ： 1×106 个 PBMC 中 500 个肿瘤细胞 (HT29) 至高达 1×106 个 PBMC 中 10,000 个肿瘤细胞 (HT29)。 右侧的柱是仅 PBMC 的对照。
     图 5 是显示高浓度的 HT-29 细胞的校准的图。 扩增在获自未患结肠癌的受治疗 者的 PBMC 中稀释的增加浓度的 HT-29 结肠癌细胞中的 CCAT-1。 扩增的 CCAT-1cDNA 的相对量 (RQ) 显示于 y- 轴，并使用单独获自未患结肠癌的受治疗者的 PBMC 作为参考 样品进行计算。 CCAT-1cDNA 的相对量与 HT-29 肿瘤细胞浓度相关。 最低剂量 ：1×106 个 PBMC 中 1,000 个肿瘤细胞至高达 1×106 个 PBMC 中 1,000,000 个肿瘤细胞 (HT29)。 右侧的柱是对照样品，其仅含有获自未患结肠癌的受治疗者的 PMBC。
     图 6 是显示结肠腺瘤 ( 腺瘤性息肉 ) 和衍生自结肠腺癌的肝转移灶中的 CCAT-1 表达的图。 410TCo- 肿瘤组织、316TCO- 肿瘤组织、 NN ＝获自具有结肠癌以外的疾病 的患者的正常结肠粘膜。 P1 和 P2 ＝获自结肠的腺瘤性息肉的组织。 M ＝获自肝转移灶 ( 转移性结肠癌 ) 的组织。
     图 7 是显示通过不同的检测方法鉴定的哨兵淋巴结 (SLN) 的百分比的图，所 述检测方法包括苏木精和伊红染色 (H&E)、免疫组织化学 (IHC) 和聚合酶链式反应
     (PCR)。 图 8 是显示通过实时定量 PCR 的细胞角蛋白 -20(CK20) 扩增曲线的图。
     图 9 是显示通过实时定量 PCR(qPCR) 的 CCAT-1 扩增曲线的图。
     图 10 是显示粪便样品中 CCAT-1 的 qPCR 结果的图。 结果显示为 CCAT-1 和看 家基因 (GAPDH) 的表达之间的关系。 每个柱代表与从同一样品扩增的 GAPDH cDNA 的 量相比的 CCAT-1cDNA 的相对量 (RQ)。 NTC( 左侧的柱 ) 显示内部阴性对照 - 获自未 患结肠癌的受治疗者的外周血淋巴细胞。 没有 CCAT-1cDNA 存在。 样品 t391 和 t374 是 阳性对照 - 结肠组织的原发性腺癌。 这些样品显示 CCAT-1 的高表达。 来自健康志愿者 的粪便样品 ：(C46-C8)。 任何样品 (n ＝ 9) 中都没有 CCAT-1 表达。 患有结肠或直肠 腺癌的患者的粪便样品 ：(P25-P1)。 在 4/12 样品中发现了 CCAT-1 表达。
     图 11 是显示通过实时 PCR 定量分析测量的、九个阴性对照的外周血 ( 健康志愿 者 ) 和两个结肠腺癌样品 ( 左侧的柱 ) 中的 CCAT-1 表达的图。
     图 12 是 显 示 结 肠 癌 患 者 的 外 周 血 样 品 中 的 CCAT-1 表 达 的 图。 扩 增 的 CCAT-1cDNA 的相对量 (RQ ；显示于 y- 轴 ) 是与获自未患结肠癌的受治疗者 (NC) 的 PBMC 的对照样品相比。
    图 13 是显示与 HT-29 相比的 18 个结肠直肠癌细胞系中的相对 CCAT-1 表达的 图。 表达水平通过实时 ( 定量 )PCR 确定。 任何给定样品中的相对 CCAT-1 表达是与 HT-29 结肠癌细胞系 ( ＝ 1) 中的 CCAT-1 表达相比。
     图 14 是显示与 HT-29 相比的 16 个肺癌细胞系中的相对 CCAT-1 表达的图。 表 达水平通过实时 ( 定量 )PCR 确定。 任何给定样品中的相对 CCAT-1 表达是与 HT-29 结 肠癌细胞系 ( ＝ 1) 中的 CCAT-1 表达相比。
     图 15A 显示用作原位探针的 165bp 核酸序列 (SEQ ID NO ：X) ；图 15B 是显示 pBluescript 载体的 RNA 印迹分析的照片。 泳道 1 ：序列梯。 泳道 2 ：pBluescript 载体和 插入序列。
     图 16 是基于筛选的原位杂交的范例。 结肠腺癌 (a) 和相邻的正常粘膜 (b) 中的 CCAT-1 的比较染色。 在肿瘤组织 (a) 中观察到更强的 CCAT-1 染色，相比之下，相邻 的正常粘膜中的 CCAT-1 染色的强度较低。
     图 17 是显示健康志愿者的外周血样品中的 CCAT-1 表达的图。
     实施方案详述
     定义
     如本文所用，术语 “CCAT-1”指结肠癌相关的转录物 1(Colon CancerAssociated Transcript 1)。
     如本文所用，术语 “CCAT-1 的片段” 或 “CCAT-1 转录物的片段” 指 CCAT-1 基因转录物的片段，其可用作寡核苷酸或核酸探针、引物或反义寡核苷酸。
     如本文所用，术语 “多核苷酸” 和 “寡核苷酸” 可互换使用，并包括任何长度 的核苷酸的聚合形式，所述核苷酸是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、或其类似物。 以下 是多核苷酸的非限制性实例 ：基因或基因片段、外显子、内含子、信使 RNA(mRNA)、 转移 RNA(tRNA)、核糖体 RNA(rRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、 质粒、载体、具有任何序列的分离的 DNA、具有任何序列的分离的 RNA、核酸探针和引
     物。 多核苷酸可包含修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。 核苷酸的序列 可被非核苷酸组分中断。 多核苷酸还可在聚合后修饰，诸如通过与标记组分轭合。 该术 语还包括双链和单链分子二者。
     CCAT-1 的 “互补转录物”或 “探针”指与 CCAT-1 互补的、用于检测 CCAT-1 的 cDNA 或 mRNA 的至少一部分的存在的核酸分子或序列。 检测通过鉴定探针和测定的 序列之间的杂交复合体进行。 探针可被连接至固体支持物或可检测的标记。 探针一般 是单链的。 探针通常包含 10 至 200 个核苷酸。 探针的特定性质将取决于特定的用途， 并且其确定在本领域技术人员的能力范围之内。 一般而言，探针将在高严格性条件下与 CCAT-1 的 cDNA 或 mRNA 的至少一部分杂交。
     如本文所用， “引物” 指通过与靶标杂交而结合感兴趣的样品中存在的靶标或 “模板” 靶标，然后促进与靶标互补的多核苷酸的聚合的短的多核苷酸。
     “聚合酶链式反应” (PCR) 是其中复制拷贝是由靶标多核苷酸使用由正向引物 和反向引物组成的一组引物，通常是一对引物，和作为聚合催化剂的 DNA 聚合酶生成的 反应。
     应理解，引物也可用作杂交反应，诸如 DNA 或 RNA 印迹分析中的探针，例如， 如 Sambrook J. 等 人 ：A Laboratory Manual( 实 验 室 手 册 ). 第 2 版， Cold Spring Harbor Laboratory， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， N.Y.，1989 中所 述。 如本文所用，术语 “cDNA” 指互补 DNA。 “cDNA” 指分离的多核苷酸、核 酸分子或其任何片段或互补序列。 它可通过重组技术或合成方法起源，是双链或单链， 代表编码和 / 或非编码 5’ 和 3’ 序列。 如本文所用， “结肠直肠癌” 或 “CRC” 指特 征为包括盲肠、升结肠、横结肠、降结肠、乙状结肠和直肠的肠道细胞的癌症的医学病 症。
     如本文所用， “癌前病变” 或 “腺瘤性息肉” 指特征为结肠粘膜的恶性转化但 没有侵入基底膜的组织学证据的医学病症。
     如本文所用， “肺癌” 指特征为肺细胞的癌症的医学病症。
     “载体” 包括将插入的多核苷酸转入宿主细胞的自我复制的核酸分子。 该术语 意图包括主要功能是将核酸分子插入细胞的载体、主要功能是核酸复制的复制载体和功 能为 DNA 或 RNA 的转录和 / 或翻译的表达载体。 还意图包括提供多于一种上述功能的 载体。
     术语 “宿主细胞” 涵盖充当载体或掺入外源核酸分子诸如多核苷酸的接受者的 任何单独的细胞或细胞培养物。 具体地，宿主细胞涵盖能够充当包含 CCAT-1 的至少一 部分的载体的接受者的细胞。 它还涵盖由于天然的、偶然的或有意的突变而有时可能未 必与原始的亲代细胞在基因型或表型上相同的细胞后代。 原核细胞或真核细胞适于充当 本发明中的宿主细胞。 宿主细胞包括但不限于细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、动物细 胞，包括哺乳动物细胞，如鼠、大鼠、猿猴或人类细胞。
     如本文所用，“差异表达”指增加的、更高 ( 上调的或存在的 ) 或降低的 ( 下调 的或不存在的 ) 基因表达，如通过生物样品中转录的寡核苷酸 ( 如 mRNA) 的不存在、存 在或量的变化所检测的。 “更高的表达水平” 涵盖比对照样品中检测的表达水平或标准
     高至少 2 倍、2.5 倍、3 倍、5 倍、10 倍或更高的表达水平。 该术语还指细胞或组织中有 核苷酸序列的表达，而对照细胞中未检测到表达。
     如本文所用， “杂交” 指其中至少一种多核苷酸反应以形成经由核苷酸残基的 碱基之间的氢键稳定的复合体的反应。 氢键可通过 Watson-Crick 碱基配对、以任何其他 序列特异性方式发生。 杂交反应可构成更广泛过程中的步骤，诸如 PCR 反应的起始。
     杂交反应可在不同严格性的条件下进行。 在严格性条件下，彼此具有至少 60％、65％、70％、75％同一性的核酸分子保持互相杂交。 高严格性杂交条件的非限制 性实例是在 6× 氯化钠 / 柠檬酸钠 (SSC) 中在大约 45℃下杂交，然后在 0.2×SSC 和 0.1％ SDS 中在 50℃、在 55℃或在约 60℃或更高温度下漂洗一次或多次。
     当杂交在两个单链多核苷酸之间以反平行构型发生时，这些多核苷酸被描述为 互补。
     能够与本发明的核酸分子 SEQ NO ：1(CCAT) 杂交的分子还包括能够与其杂交 的多核苷酸片段。 在本文中，片段被理解为意指长度足以与 CCAT-1 转录物杂交的核酸 分子的部分。 因此，术语片段意指这些分子的序列与 CCAT-1 转录物的序列在一个或多 个位置不同但仍显示与这些序列或其部分的高度同源性。 在此语境中，同源性意指至少 40％的序列同一性、特别地至少 60％、至少 80％、至少 85％、至少 90％或超过 95％的同 一性。
     优选地，同源性的程度是通过将相应序列与 SEQ ID NO ：1 的核苷酸序列进行 比较而确定的。 在被比较的序列不具有相同长度的此类情形中，同源性的程度优选地指 较短的序列中与较长的序列中的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分比。 同源性或同 一性的程度可通过例如已知的基于计算机比对的程序诸如 ClustalW 来评估， ClustalW 由 European BioinformaticsInstitute(EBI) 和 European Molecular Biology Laboratory(EMBL) 分 发。 ClustalW 可以从各种来源诸如例如 ：www.ebi.ac.uk/clustalw 下载。 当使用 ClustalW 软件包 2.0 版本来确定特定的序列是否与根据本发明的 SEQ NO ：1 具有例如 85％同一性 时，比较可通过其中提供的默认设置进行。
     “生物样品” 在本文使用其广泛含义，并可包括体液 ；细胞制品的可溶级分或 培养细胞的培养基的等份 ；从细胞中分离或提取的染色体、细胞器或细胞膜 ；溶解或结 合至基质的基因组 DNA、RNA 或 cDNA ；细胞 ；活检，组织包括肿瘤组织、结肠直肠样 品和非结肠直肠样品 ；组织印迹 (tissue print) ；指纹、口腔细胞 (buccal cell)、皮肤或毛 发 ；和类似样品。
     “基质” 指结合核酸的任何硬质或半硬质支持物，并包括膜、过滤器、芯片、 载玻片、干胶片、纤维、磁性或非磁性珠、凝胶、毛细管或其他管、平板、聚合物、 纳米颗粒和微颗粒，其具有多种表面形式，包括孔 (well)、沟 (trench)、针 (pin)、槽 (channel) 和小孔 (pore)。
     本发明是基于对结肠癌相关的转录物 -1(CCAT-1) 的鉴定， CCAT-1 是长 2528 碱基对 (bp) 并且位于染色体 8q 24.21 上的新的非编码 RNA。
     发明人发现 CCAT-1 存在于多种癌组织和细胞系包括结肠癌、直肠癌、肺癌中 和结肠的癌前病变 ( 腺瘤性息肉 ) 中，但在正常组织中如果有的话，以非常低的水平被检 测到，如本文所公开的。 因此， CCAT-1 可充当癌细胞的标志物，并且尤其可用于生物样品中的结肠直肠癌、肺癌和癌前病变 ( 腺瘤性息肉 ) 的鉴定。
     因此，本发明提供 CCAT-1 或其序列的任何部分作为用于对患有结肠直肠癌 (CRC)、癌前病变 ( 腺瘤性息肉 ) 和肺癌的患者进行诊断、分期 ( 病理学评估 )、成像和 术后监测的特异性分子诊断标志物的用途。
     这些活动可在体外，或通过递送用于患者中的肿瘤成像的组合物而在体内进 行。
     检测可使用聚合酶链式反应 (PCR)、原位杂交技术或本领域已知的任何检测技 术实现。
     根据本发明的一些实施方案，提供用于筛选、诊断和分析患者和 / 或患者样品 以检测 CCAT-1 表达的证据的组合物和方法。 CCAT-1 的表达暗示原发性或转移的结肠 直肠癌或原发性或转移性肺癌。 在本发明的另一方面，提供可用于显现原发性或转移的 结肠直肠癌或原发性或转移性肺癌细胞的组合物和方法。
     筛选和诊断组合物和方法可用于监测处于直肠结肠癌或肺癌的高风险组的个 体，诸如那些过去已被诊断患有局部性疾病、转移的疾病的个体，或那些在遗传上与所 述疾病关联的个体，或那些具有过去被诊断患有癌症的一级和二级家族成员的个体。 具 有结肠炎性病症诸如溃疡性结肠炎或克隆氏结肠炎病史的个体和具有吸烟史的个体也将 被视为处于结肠直肠癌或肺癌的高风险组的个体。 体外筛选和诊断组合物和方法可用于 监测正在经历或已经接受结肠直肠癌或肺癌治疗的个体以确定癌症是否被除去。 筛选和 诊断组合物和方法可用于监测诸如通过遗传筛选和 / 或家族史被鉴定为有遗传素因的个 体。 因此，可鉴定处于发展结肠直肠癌和肺癌风险的个体，并可从此类个体中分离 样品。 本发明可用于诊断显示至少一种癌症症状或特征，如在相关组织中存在息肉的个 体。 本发明尤其可用于监测被鉴定为具有包括亲属曾患有结肠直肠癌或肺癌的家族病史 的个体。 同样地，本发明尤其可用于监测接受治疗并除去肿瘤或以其他方式被缓解的个 体。
     根据本发明，提供结合 CCAT-1 基因转录物的化合物。
     结肠癌、直肠癌或肺癌的检测可使用获自癌症患者或怀疑患有癌症的个体的任 何生物样品进行，所述生物样品包括但不限于，组织、血液、骨髓、粪便、尿、淋巴结 或任何体液。 在特异性实施方案中，所述生物样品是取自怀疑为癌性的组织的活检 ( 如 针吸活检或结肠镜检查中取出的组织 )。 在具体的实施方案中，所述样品是粪便样品。
     组织样品可通过外科技术获得。 本领域技术人员将理解可获得用于根据本发明 的分析和检查的测试样品的多样性。 另外，本领域技术人员将理解，对于获得组织样品 目的，本发明可使用另外的程序。
     在一种实施方案中，使用血液作为生物样品。 如果是这种情况，可通过例如离 心从血液样品中分离其中包含的细胞。
     在优选的实施方案中，生物样品获自人类。
     在任何生物样品中检测到 CCAT-1 基因转录物的存在表明该生物样品含有肿瘤 细胞。
     组织样品任选地通过标准技术如超声处理、机械破碎或化学裂解匀浆。
     用于外科病理学的组织切片制品可以冷冻并使用标准技术制备。 对组织切片的 原位杂交测定对固定的细胞进行。
     CCAT-1 基因转录物的存在可使用本领域已知的多种技术来确定，例如使用特异 性引物的基因转录物或其片段的聚合酶链式反应 (PCR) 扩增和扩增产物的检测，以及与 CCAT-1 特异性探针的杂交。
     CCAT-1 基因转录物的存在还可使用诸如原位杂交等技术在组织切片中确定。
     为此，本发明提供用来在本发明的程序中鉴定 CCAT-1 的寡核苷酸探针和寡核 苷酸引物。
     在另一方面，本发明提供试剂盒，其包含诸如寡核苷酸探针和寡核苷酸引物等 组分。 应理解，本文提供的实例不意图限制本发明的范围。
     如上文指出的，生物样品中的 CCAT-1 基因转录物的检测可使用聚合酶链式反 应 (PCR) 技术进行。 PCR 是本领域已知的，并且被常规地实践于诊断和研究两方面。 它 公开于例如美国专利第 4,683,202 和 5,075,216 号。 简要而言， PCR 通过提供与待扩增的 靶标核苷酸序列杂交的引物来提供 DNA/RNA 序列的扩增。 引物组通常含有两个引物 (+ 正向和 - 反向 )。 该反应还采用核苷酸和聚合酶。 聚合酶根据与杂交的引物相邻的序列 填充互补的核苷酸。 扩增循环造成所需产物的指数扩增。
    PCR 引物是基于序列信息根据常规的方案设计的。 CCAT-1 转录物的核苷酸序 列如 SEQ ID NO ：1 所列。
     对于 PCR，通常从生物样品中的细胞提取 RNA 并分析，或可选地，将 RNA 转 化为 cDNA。 此类转化也是标准做法。
     当 CCAT-1 转录物存在于生物样品中时， PCR 将得到包含 CCAT-1 转录物的原 始 mRNA 的指数拷贝。
     如果 CCAT-1 不存在，PCR 将不会得到可检测的扩增产物。 适于 PCR 的引物一 般为 8-25 个核苷酸长、15-30 个核苷酸长或 18-50 个核苷酸长。 典型的引物包含 15-25 个核苷酸。 这些引物与 CCAT-1 转录物或其对应 cDNA 的序列相同或互补。 这是这些引 物与 CCAT-1 转录物或其片段杂交的原因。
     将之前获自生物样品的 mRNA 或其对应 cDNA 与引物、核苷酸和聚合酶按照已 知的 PCR 方案混合。 混合物经历一系列温度循环。 当 CCAT-1 转录物或其对应的 cDNA 存在于混合物时，引物将杂交，CCAT-1 转录物将以指数扩增。 当 CCAT-1 转录物不存在 时，则不会观察到可检测的扩增。 扩增产物可通过本领域熟知的许多程序检测，例如， 通过凝胶电泳。
     当从生物样品中回收到小量转录的多核苷酸时， PCR 是有利的。
     本发明还提供适于旨在扩增 CCAT-1 转录物的 PCR 反应的多核苷酸引物。
     根据本发明，可以组装用于检测生物样品中 CCAT-1 转录物的存在的诊断试剂 盒。 此类诊断试剂盒包含适于检测 CCAT-1 的试剂。 作为非限制性实例，此类试剂盒包 含至少一种寡核苷酸探针和 / 或至少一种寡核苷酸引物。 通常，本发明的试剂盒还包含 所用试剂的容器。 另外，这些试剂盒可包含核苷酸大小标志物以用于凝胶分析中来确定 检测的核酸的大小。 本发明的试剂盒可另外包括进行测定的说明和方案。 还可提供阳性 对照和阴性对照作为试剂盒组件的一部分。在另一种实施方案中，确定样品中是否含有表达 CCAT-1 的细胞是通过对从生 物样品中提取的 mRNA 进行 RNA 印迹分析。 RNA 印迹分析是本领域技术人员已知的方 法。 参见，如 Sambrook 等人，(1989)MolecularCloning ：A Laboratory Manual( 分子克隆 实验室手册 )， Cold Spring HarborLaboratory Press， Cold Spring Harbor， N.Y.
     另外， mRNA 提取、通过电泳的 mRNA 分离、印迹分析、探针和引物制备和杂 交技术是已知的，并且进行这些技术的材料是商业可获得的。
     信使 RNA 可通过例如使用 poly dT 柱来提取，并且材料通过电泳分离，并，例 如，转移到硝酸纤维素纸上。
     标记的探针通常用于显现固定于所述纸上的 mRNA 的存在。 这些探针具有与 CCAT-1 转录物或其片段互补的核苷酸序列。
     为此，SEQ ID NO ：1 中的序列信息可用于制备探针或分离和克隆 CCAT-1 转录 物。 此类探针为至少 8、15、30、40 或 100 个核苷酸的段。 探针可以是 DNA 或 RNA，它 优选地为单链，并且通常应与 SEQ ID NO ：1 的相应片段具有至少 65％的序列同源性。
     探针可在报道子分子的存在下使用寡标记或 PCR 扩增产生。 含有 CCAT-1 的 cDNA 或其片段的载体可用于产生信使 RNA 探针，例如通过加入 RNA 聚合酶和标记的核 苷酸。 本领域技术人员可用商业可获得的试剂盒和材料来进行这些过程。 杂交的严格性通过许多因素诸如探针内的 GC 含量、温度和盐浓度确定。 特别 地，严格性可通过降低盐浓度或提高杂交温度而增加。 在高严格性下，杂交复合体将仅 在核酸高度互补时保持稳定。
     杂交的条件是本领域技术人员熟知的，如参见 Sambrook 等人，如上所述。
     本发明的试剂盒可因此含有有用的试剂来实施 RNA 印迹技术以检测生物样品中 CCAT-1 转录物的存在。 该试剂盒任选地包含可用作探针以与转录的 CCAT-1 或其片段 杂交的寡核苷酸。 探针可以被放射性标记。 还可任选地提供阳性对照和阴性对照以及适 当的大小标志物。
     用于检测 CCAT-1 转录物的存在的另一技术是通过寡核苷酸杂交。 多核苷酸的 杂交是本领域技术人员已知的。 此方法也采用含有与 CCAT-1 转录物的核苷酸序列杂交 的特异性核苷酸序列的可检测的探针。
     来自生物样品的 RNA 通常被固定于滤纸或类似材料。 加入探针并保持在仅当探 针适当地与固定的材料互补时允许杂交的条件下。
     这些条件应具有足够的严格性以洗掉与固定的材料部分杂交的探针。 在滤纸上 检测到探针表明 CCAT-1 转录物的存在。
     用于杂交测定的探针包含与 CCAT-1 基因转录物的序列互补的至少 8、12、15、 20、30、50 或 100 个核苷酸。
     SEQ ID NO ：1 中公开的序列信息可被本领域技术人员用于制备本发明的探针。 可优化杂交过程的条件以使样品中不完全互补的多核苷酸造成的背景信号最小。
     本发明因此还包括可用作寡核苷酸杂交的探针的标记的寡核苷酸。 标记的探针 涵盖放射标记的核苷酸或通过可容易获得的系统以其它方式可检测的探针。 标记的探针 通常包括通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段可测量的标记。 作为非 限制性实例，此类标记可包含放射性物质 (32P、35S、3H、125I)、荧光染料 ( 洋地黄毒苷、
     荧光素、5- 溴脱氧尿苷 (bromodesoxyuridin)、乙酰氨基芴 )、生物素、纳米颗粒和类似标 记。 此类寡核苷酸通常在其 3’ 和 5’ 端标记。
     特别地，与 CCAT-1 或其序列的任何部分互补的转录物 ( 例如 SEQ IDNo ：4) 可 被轭合至荧光探针，包括但不限于可见范围内的荧光标签 ( 例如 CY3.0 或 CY 5.0) 或近红 外范围的探针 ( 例如 Cy 5.5)，以用于体外或体内检测或成像结肠癌或直肠癌和肺癌。 另 外，与 CCAT-1 或其序列的任何部分互补的转录物可被轭合至或掺入到纳米颗粒、微颗 粒或脂质体以检测或成像癌症。
     与 CCAT-1 或其序列的任何部分互补的转录物可被轭合至放射性同位素以检测 或成像癌症。 与 CCAT-1 或其序列的任何部分互补的转录物可被轭合至合成的聚合物以 检测或成像癌症。
     与 CCAT-1 或其序列的任何部分互补的转录物可被轭合至其它生物剂，包括但 不限于抗体、毒素或其它肽，以检测或成像癌症。
     可装配对进行本发明的杂交方法有用的试剂盒。 这些试剂盒还提供与 CCAT-1 转录物杂交的标记的寡核苷酸。 在一种实施方案中，所述标记的探针是放射标记的。 还 可在所述试剂盒中包括阳性对照和阴性对照以及大小标志物，诸如多核苷酸序列梯。 这 些试剂盒还可包含用于进行所述测定的说明。
     本发明的杂交技术还涵盖原位杂交以检测生物样品诸如组织切片中表达 CCAT-1 的细胞。 因此，本发明还涉及可用于进行原位杂交的探针。 这些探针被设计为与生物样 品中存在的互补核酸序列杂交。 可使用荧光显微镜来显现荧光标志物标记的探针。
     为此，本发明还提供用于进行原位杂交的试剂盒。 原位杂交可用于检测组织切 片中 CCAT-1 的 mRNA 序列。 可使用荧光标志物来检测对应于 CCAT-1 转录物或其互补 序列的序列。
     本发明还涉及重组载体，包括包含 CCAT-1 基因转录物、其片段或互补序列的 表达载体。
     本发明还涉及包含此类载体的宿主细胞，并涉及使用此类重组细胞表达 CCAT-1 的方法。 宿主细胞的实例包括酵母细胞诸如酿酒酵母 (S.cerevisiae)、昆虫细胞诸如草 地贪夜蛾 (S.frugiperda)、细菌诸如大肠杆菌 (E.coli) 和哺乳动物细胞诸如中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞。
     本发明还提供一种分离的寡核苷酸，其包含 CCAT-1 基因转录物 (SEQID NO ： 1) 或其片段的序列。 特别地，本发明涉及与 SEQ ID NO ：1 具有至少 85％同源性的分离 的寡核苷酸。 本发明涉及分离的 CCAT-1，包括其片段。
     本发明的重组表达载体可用于转化宿主以制备用于制备本发明的分离的寡核苷 酸的重组表达系统。 表达载体可含有转录控制元件 ( 如启动子和增强子 )。 这些元件可 选自多种来源，其根据它们在特定宿主中的效率选择。 使用重组 DNA 技术或合成技术将 载体、 cDNA 和调节元件合并在一起。
     本领域技术人员可通过使用商业可获得的表达载体引入此类包含本发明的 CCAT-1 多核苷酸的分子，以用于熟知的表达系统，诸如本文描述的那些。
     除了通过重组技术产生这些多核苷酸分子之外，还可采用自动化核酸合成仪来 生产 CCAT-1 或其片段。 此类技术是本领域技术人员熟知的。CCAT-1 转录物、相应于 CCAT-1 的 cDNA、其片段、寡核苷酸、以上任何的互 补 RNA 和 DNA 分子以及 PNA 可用于检测或测量差异的 CCAT-1 表达、增加的表达水平。 这些测量可监测治疗干预过程中的 mRNA 水平。 其还可用于本发明的诊断程序或实际的 预后确定。 这些测量还可用于分期癌症组织诸如 CRC 或肺癌。
     与差异表达相关的癌症包括特异性结肠癌或直肠癌以及肺癌。 诊断测定可使用 如上文所述的杂交或扩增技术。 它们可用于比较获自患者的生物样品与标准样品中的基 因表达，以检测 CCAT-1 的差异基因表达或增加的表达水平。 用于此比较的定量方法是 本领域技术人员熟知的。 特别地，可使用定量 PCR(qPCR) 或实时定量 PCR(RT-qPCR) 分析来定量生物样品中的 CCAT-1 表达水平。 简要而言，实时定量 PCR 在扩增过程中 提供同步的监测。 随着扩增产物随程序继续而积累，其被连续地检测。 定量 PCR 和 RT-qPCR 是本领域技术人员已知的程序。
     作为非限制性实例，标记的探针可与从获自患者的生物样品制备的核酸混合。 将混合物保持在形成杂交复合体的条件下。 特定的培养之后，漂洗样品，并定量杂交复 合体的信号量。 还可将信号与标准值进行比较。 与正常标准相比获自个体的生物样品中 更高的 CCAT-1 信号指示癌症 ( 如 CRC 或肺癌 )。
     为了提供用于建立 CCAT-1 的差异表达或增加的表达的标准，评估了正常和疾 病的表达水平。 使取自正常受治疗者的核酸样品和与 CCAT-1 互补的寡核苷酸探针在允 许杂交的条件下反应。 然后测量杂交复合体的量。 可将以此方式获得的标准值与获自受 测试个体的生物样品的值进行比较。
     标准水平可通过测量未患癌症的个体 ( 称为 “正常受治疗者”) 中的 CCAT-1 表 达确定。 可选地，标准水平可根据生物样品中的参考基因的表达水平确定，所述生物样 品任选地为受测试个体的生物样品。 参考基因可以是看家基因，诸如本文中示例的看家 基因 ( 如 GAPDH)。 因此可通过与参考基因的表达水平相比的 CCAT-1 表达比值的增加 或以其它方式标准化的 CCAT-1 表达测量值的增加来鉴定生物样品中的差异 CCAT-1 表 达。
     标准还可通过比较组织与视为没有癌症的周围组织 ( 也称为 “非癌组织” 或 “正常组织” ) 中的 CCAT-1 水平来确定。
     在一些实施方案中，本发明的 CCAT-1 引物和 / 或探针可配制成多种形式，包括 溶液、悬浮液、乳液或冻干粉末。 制剂通过通常使用的技术灭菌。
     在另一方面，本发明提供一种寡核苷酸的阵列，其包含具有多个区段的基质， 其中至少一个所述区段包含与 CCAT-1 或其片段杂交的探针。 在特异性实施方案中，阵 列包含本发明的探针，如 SEQ ID NO ：5。 实施例 本文下面提供的实施例例证了本发明，但不意图限制本发明的范围。
     实施例 1 ：CCAT-1 的发现
     患者、细胞系、组织和 RNA
     结肠癌细胞系 HT-29 和 SK-CO-10 获自 ATCC(Manassas，VA)。 HT29 用于制备 代表性差异分析 (Representational difference analysis，RDA) 实验的待测 RNA。 结肠癌和
     相邻的正常组织样本获自由 Ludwig Institute 维持的组织库 (#4 至 29) 或 Hadassah-Hebrew 大学医学中心的组织库 (#96-218)。所有样品来自经历外科肿瘤切除并签署经设施内伦理 委员会 (InstitutionalReview Board(IRB)) 批准的书面知情同意书的患者。 总 RNA 通过异 硫氰酸胍 /CsCl 梯度纯化方法或 Trizol 试剂 (Sigma-Aldrich，St.Louis，MO) 获得。 正常 组织 RNA 板获自 Clontech(Mountain view， CA)。
     RDA 和 cDNA 克隆
     代表性差异分析 (RDA) 如先前所述地进行 (4)。 HT29 构成待测 RNA。 对于 驱动 RNA(driver)， RNA 汇集自三种正常的结肠组织。 利用 Tsp509I 或 DpnII 作为限制 性内切核酸酶进行三轮扩增。 分离和测序第二和第三扩增循环后产生的片段。 使用通过 RDA 鉴定的部分长度 CCAT-1 转录物在 λ-ZAPII 载体系统 (Stratagene， La Jolla， CA) 中筛选 HT29 cDNA 文库，由此获得全长 cDNA。
     CCAT-1 基因转录物和表达
     从 HT29 cDNA 文库克隆的全长 CCAT-1 cDNA 长 2528bp。 该转录物对应于跨越 nt.1-194 和 195-2528 的两个外显子，如通过针对两个带有约 9kb 的长内含子的染色体 -8 基因组克隆 (AC027531 和 AC020688) 的 BLAST 分析所揭示的。 该 cDNA 与在畸胎癌 (5) 中鉴定的 AK125310 相同。 与 AK125310 相比， CCAT-1 缺乏其 5’ - 端的 86 个核 苷酸，并在 3’ 具有附加的 313 个核苷酸。 CCAT-1(SEQ ID NO.1) 的完整序列为 ：
     GCCTTAATAGCTAGCTGGATGAATGTTTAACTTCTAGGCCAGGCACTACTCTG TCCCAACAATAAGCCCTGTACATTGGGAAAGGTGCCGAGACATGAACTTTGGTCTTCT CTGCAATCCATCTGGAGCATTCACTGACAACATCGACTTTGAAGTTGCACTGACCTGG CCAGCCCTGCCACTTACCAGGTTGGCTCTGTATGGCTAAGCGTTTTCTCCTAAAATCC CTTGAAAACTGTGAGAAGACCATAAGAAGATCATATCTTTAATTCTATTTCACAAGTCA CACAATATTCCAATCAAATACAGATGGTTGAGAAAAGTCATCCATCTTCCCTCCCCAC CCTCCCACAGCCCCTCAACCACTGCCCTGAAACTTATATGCTGTTATCCGCAGCTCCAT CTGGAGCATCACAGCTACTGTCAACCCTGACGCTCTTTCTGAAAAAACACCGGATGG ACATCAGAACTATTTCTTTAAGGATGTTACTGAGCCACACAGGAAAACTTGCCTTATG ATTTTGAATGCACGGATCTGATTTGACTAAACATGATAACTAGAGAATCACCCAATCTA CTCCCATTTTCAACTCTAAATCATCAGAGTGTCTCAAATCCAAAGCACACACAGACCA GCCTGGCCAACACGGTGAAACTCCACCCCTACTAAAAGTATAAAAATTATCCAGGTGT GGTGGCGGGCGCCTGTAATCCAAGCTACTTGGGAGTCTGGAGGCAGGAGAATCCCTT GAACCTGGGAGATGGAGGTTGCAGTGAGCAGAGATCACACCACCGCACTCTAGCCTG GGCCACAAATCAACAACAACAACAACAACAAAAAACAAAGCGCACACAGAGACTGA GGTCCTCTTTGGCATTGAGAAGATGGCTATGCAAGTCCCAACTAGCAAGTGCAAACTT CCCAGCTTCACTTCTGCCAGTGTCCCTTCACCCCTTCTCAACCCCACTGGGAGGCAGG AGGGTGCTTGACAATAACAGCCTTGGCATCACTCTGCCAGGGTGTAATAGGAACTGTT ACAATTCTGAGATTCTGTGTAAGCACTGGCCTTTCTGCCTAGAATGCCTTCTCCTCTCT TTTTTAACTGCATGCTCCTATTTATCTTTCAAAGCCCGGAAAAAATAACACTGCACACG GGAAATGCTCCCTTCCTACTGCAGTCATTTAGATGACTCTATGCCATTCCATTCATTTC
     TCTTTCCTACCACAGAAGTGCTTTGAGATTTTGGAGTCAGACTGCTTGAACTTGAATC CTGGCCCTCTCATCAGAGACTTGACTTATTTTAGGCAAGTTATATAACCAATTTTACCTC AGTTCCTTACCCATAAAATGGGTCTAATGAGAGTACCTACCACACAGAATTTTGATGA AAACTGAATGAGATGAAGGCCTTTAAGGCAGTGGTCCCCAACCCTGGGGACACAGAC AGGTACCATTTTGTGGCCTGTTAGGAACTGGGCCACACAGCAGGAGGTGAGCAGTGG GTGAGTGAGATCAGCGTTATTTACAGCTGCTCCCCATTGCTCACCTTACTGCCTGAGCT CCACCTCCTGTCAGATCAGCAGTGGCATTAAATTCTCATAGCAGCACAAACCCTGTCA TGAACTGCACATGCGAGGGATCTAGGTTGTGCGCTCCTTATGAGAATCTAATGCCTAA TGACCTGTCACCGTCTCCCATCACCCCTAGATGGGAGTGTCTAGTTGCAGGAAACAAG CTCAGGGCTTCCACTGATTCTACATTATGGTGAGTTGTATAATTATTTCATTATATAATAC AATGTAATAATAATAGAAACACAGTGCACAACAAATGTAATGTGCTTGAATCATCCCC AAACCATCCCAGTCCACGGTCTTCCACATTTTGTCTTTTCACAAAATTGTCTTCCACA AAACTGGTCCCTGGTGCCAAAAAGGCTTGGGACCACTGCTTTAAAGCCTTTGCATAG TGCTTAGAATTGAGGGGGAAAAAAAAAACAAAAACAATGTAGCTAGTTGCTACAATC ACTATATTGGTGAGTTTCAAAAGGAAAAGAATTCTGTCCCATTTATGCTTGAGCCTTG AGTTGCTAACCAAGCCTGACACAAAATTACTGTTGAAGGGATGTGTGAGTCCTAATTG AAATGAGGCCTCTTAAGGGAATTGTGGACCAAACCCCAAGCAGGCAGAAAGCCGTAT CTTAATTATTGCAAGTATTTCAGGCAAGGTGTGGATGGCCATTTGAATTCAAGCAGAC TAGGACCTGGGATGAGAAAGAAGGTGTGTACGTGACTTGATCTTTGAACTTTAGCTCA CCATCTGGAAGAAGGCTGAGTATTCTCTGCACTCACATAGTAGCTAATGCCTACTCCCC AGCCACCCACAATTCTTTCTGTAGGAAGGCTCGCTAGAATACTTTGTGATATTGGATAT TAGTTCCATATTCTACTGTGTATCTTAGTTCAACCAAATTGTAATCATCTGATATTTATTT CTTTTAATATAAATATAAGTATATTAAGTCTTAAAAAAAAAAAAAAAA
     实时 RT-PCR
     1μg 总 RNA 用于 10μl 反应中的反转录，其中 2μl 用于 PCR。 所有实验进行 两个重复或三个重复。 PCR 使用以下引物进行 45 个循环 ( 变性 ：95℃，15 秒钟 ；退火 / 延伸 ：60℃，1 分钟 ) ：正向引物 ：5’ -TCACTGACAACATCGACTTTGAAG(SEQ ID NO ：2) ；反向引物 ：5’ -GGAGAAAACGCTTAGCCATACAG(SEQ ID NO ：3) ；探针 (SEQ ID NO ：4) ：6Fam-CTGGCCAGCCCTGCCACTTACCA-Tamra。根据生产商的说明 进行绝对定量 (PE Biosystems， User Manual 2( 用户手册 2))。 GAPDH 基因用作参考基 因。 相应地，每个样品根据其 GAPDH 含量 ( 表达水平 ) 以及针对校准物 (SK-CO-10) 被 标准化。 相对量通过下式确定 ： 绘制相应于含有 CCAT-1cDNA的质粒 DNA 的稀释液的标准曲线，并使用该曲线确定 SK-CO-10 中 CCAT-1mRNA 的 量。 将此因子乘以各样品的相对量以获得作为 fg/100ng cDNA 的 CCAT-1 量。 所有实验 使用 ABI Prism 7000 系统 (Applied Biosystems， Foster City， CA) 进行。
     实施例 2 ：正常组织以及结肠和直肠的腺癌中的 CCAT-1 表达
     通 过 定 量 实 时 PCR 检 验 了 一 组 18 种 正 常 组 织 中 CCAT-1 的 表 达 ( 图 1)。 CCAT-1 表达在 0.008fg( 骨骼肌 ) 至肾中的 402fg 范围内。 与 SK-CO-10 相比，正常组织中的 CCAT-1 水平低 20- 倍 ( 肾 ) 至超过 350- 倍 ( 结肠 )。 相反，肿瘤组织中的平 均 CCAT-1mRNA 水平为 2090fg(p ＜ 0.0001，与正常的结肠相比 )，并在 280fg(27) 至超 过 8000fg(11) 范围内，图 2。 在与肿瘤相邻的正常组织中，平均 CCAT-1mRNA 水平为 587fg(p ＝ 0.04，与正常的结肠相比 )，并在 0.1fg(N29) 至 6631fg(N14) 范围内，图 2。 在图 2 中，研究了肿瘤和相邻的正常组织的配对样品。
     实施例 3 ：外周血单核细胞 (PBMC) 中的 CCAT-1 校准曲线
     此研究部分的所有实验使用 ABI Prism 7500 系统 (Applied Biosystems， Foster City，CA) 进行。 为了对给定样品中的 CCAT-1 含量定量测量，生成了校准曲线。 结肠 癌细胞系 HT-29 和 COLO-205 获自 ATCC(Manassas， VA)。 外周血单核细胞 (PBMC) 获自 10 位健康志愿者的外周血。 PBMC 通过菲可 (Ficole) 梯度方法分离，并在 -70℃储 存。 将 PBMC 和结肠癌细胞以结肠癌细胞的增加的浓度混合 (1 ∶ 1×106、1 ∶ 5×105、 1 ∶ 1×105、1 ∶ 5×104、1 ∶ 1×104、1 ∶ 5×103、1 ∶ 1×103、1 ∶ 500、1 ∶ 100、 1 ∶ 50、1 ∶ 10、1 ∶ 1，和纯的结肠癌细胞 )。
     提取 RNA 并进行 CCAT-1 的实时 PCR。 为了研究 CCAT-1 的 RT_PCR 对检测 小群体癌细胞的敏感性，我们生成了校准曲线 ( 图 3-5)。 将增加的浓度的结肠癌细胞系 (HT29) 细胞与 106 个 PBMC 混合。 癌细胞检测的最低阈值为 106 个 PBMC 中 5 个癌细胞 的浓度 ( 图 3)。
     实施例 4 ：正常结肠粘膜、前恶性 (pre-malignant) 粘膜、腺瘤性息肉、结肠原 发性腺癌和远端转移灶中的 CCAT-1 表达
     将获自由于良性疾患经历结肠切除的患者的正常结肠粘膜样品、与结肠腺癌位 点相邻的正常粘膜样品、腺瘤性息肉样品、结肠或直肠的原发性腺癌样品以及来自肝或 腹膜转移灶的样品在液氮中急速冷冻。 从所有组织样品中按照先前所述提取 RNA 并进行 CCAT-1 的实时定量 PCR( 图 6)。
     实施例 5 ：结肠癌患者的血液和淋巴结中隐性转移疾病的检测
     患者
     年龄超过 18 岁的具有组织学证实的结肠原发性腺癌的患者被提供参与此研究。 具有远端转移灶的患者或者接受在先放疗或化疗的患者被排除在研究外。 研究方案得到 Institutional Review Board(IRB， HelsinkiCommittee)Hadassah-Hebrew 大学医学中心的批 准。 获得了所有研究参与人员的书面知情同意书。
     哨兵淋巴结定位和收获
     患者经历包括含有引流淋巴系统的正常楔形肠系膜的结肠腺癌的标准外科切 除。 取出外科样本 ( 结肠和肠系膜 ) 之后，立即使用结核菌素注射器和针头在肿瘤周围 的四个象限浆膜下注射 ( 活体外 )2-5ml 异舒泛蓝染料 (Patent Blue V， France)。 然后在 后桌 (back table) 上评估肿瘤和淋巴结的总体切除，并解剖肠系膜的所有蓝色结。
     活体外鉴定 SLN 之后，将沿着结的纵轴通过门 (hilum) 划分的一半 SLN 在液氮 中急速冷冻。 原发性肿瘤的一小部分 ( 整个肿瘤体积的～ 25％ ) 和正常粘膜的少量样品 (0.5 克 ) 相似地急速冷冻。 使用单独的仪器进行活体外 SLN 和原发性肿瘤切除，以使结 的肿瘤细胞污染最小。
     病理学处理和细胞角蛋白免疫组织化学带有附着的肠系膜的原发性肿瘤样本和剩余的一半 SLN 作为分别标记的样本被 提交至 Hadassah-Hebrew 大学医学中心病理学系。一旦证实结肠腺癌的诊断，福尔马林固 定、石蜡包埋的蓝色结即经受大约 40μm 厚度的四个水平 (level) 的连续步骤切片，并用 H&E 染色。 此外，在块的第二和第四水平制备两个未染色的载玻片以用于免疫组织化学 染色，一个用于细胞角蛋白抗体染色，另一个充当阴性对照。 使用亲和素 - 生物素 - 过 氧化物酶复合物方法对福尔马林固定和石蜡包埋的 SLN 切片进行免疫组织化学。 商业获 得的细胞角蛋白抗体混合物用于此研究 ( 广谱角蛋白 (Pan-keratin)AE1/AE3，CAM 5.2， 35bH11， Ventana Medical Systems， Tucson， AZ)。 内源过氧化物酶通过与 1％过氧化氢 一起培养来抑制。 二氨基联苯胺四盐酸盐 (DAB， Biogenex， San Ramon， CA) 用作色 原体。 福尔马林固定、石蜡包埋的扁桃体切片用作阳性对照，并将来自 SLN 块的一个切 片与阴性对照缓冲液一起培养。 对来自 SLN 的每个组织块检查了总计四个 H&E 和两个 细胞角蛋白免疫染色切片。 如果鉴定了展示结肠癌细胞的解剖学和细胞学特征的强烈阳 性的单个细胞或细胞群集，则细胞角蛋白免疫染色被视为阳性。
     实施例 6 ：哨兵淋巴结中的细胞角蛋白 -20、 CCAT-1 的 RT-PCR
     RNA 提取
     所有样品 ( 肿瘤、淋巴结、血液和正常组织 ) 的总 RNA 提取通过 TriReagent 方 法进行。 在合成 cDNA 之前，在凝胶上运行产物以评估 RNA 质量。
     将冷冻样品在干冰中粉碎，使用 Polytron 匀浆机在 Trireagent(molecular research center， inc.， Cincinnati， oh， usa) 中匀浆，并根据生产商的说明进行处理。
     实时 RT-PCR
     1μg 总 RNA 用于 20μl 反应中使用随机引物的反转录，其中 2μl 用于 PCR。 所 有实验进行两个重复。 PCR 进行 40 个循环 ( 变性 ：95℃，15 秒钟 ；退火 / 延伸 ：60℃， 1 分钟 )，使用 CK20 特异性引物和 探针 (AppliedBiosystems，如所需地测定 )。 对于 CCAT-1 表达分析，使用的引物如上文所述。 每种样品根据其 GAPDH 含量进行标 准化。 针对 CK20 表达计算对校准物的相对定量。
     因为在淋巴结和外周血淋巴细胞中， CCAT-1 阴性样品即使通过实时 PCR 在 绝对量上也是不可检测的，所以相对量确定是无关的，并且分析的样品仅评估为此转 录物表达的阳性或阴性。 这部分研究的所有实验使用 ABI Prism 7500 系统 (Applied Biosystems， Foster City， CA) 进行。 提取 RNA，并对 CCAT-1 进行实时 PCR。
     结肠癌患者的哨兵淋巴结中的 CCAT 1 表达
     对所有肿瘤和 SLN 组织以及获自无恶性肿瘤患者的 2 个正常淋巴结和获自健康 个体的 3 个 PBMC 样品进行实时 PCR。 所有五个阴性对照中无 CCAT-1 的表达并且仅有 痕量 CK20。 因此，对于 CK-20 值， “阳性” PCR 被设置为与阴性对照值相比 RNA 含 量高 50 倍，并且因为阴性对照没有 CCAT-1 的扩增，我们使用具有 CCAT-1 含量的每个 SLN 作为阳性。 通过 H&E 在 7/44 患者中、通过 CK 的 IHC 在 14/44 患者中 ( 通过卡方 检验，与 H&E 相比 p ＜ 0.0001) 和通过 PCR 在 23/44 患者中 ( 通过卡方检验，与 H&E 相 比 p ＝ 0.006，图 6，表 1) 鉴定了具有 CRC 转移灶的哨兵淋巴结。 所有 H&E 阳性 SLN 通过 CK 的 IHC 和通过 PCR 也是阳性。 但是，在仅通过 CK 的 IHC 为阳性的七个 SLN
     中，四个还是通过 PCR 阳性的。 通过 H&E 和 IHC 为阴性的另外 12 个 SLN 通过 PCR 为 阳性 ( 图 7)。
     呈现了 CK-20 和 CCAT-1 的 qPCR 扩增曲线 ( 图 8-9)。 与 CCAT-1 相比，通过 CK-20 扩增了更高量的 cDNA。
     表 1 ：通过检测方法， SLN 中 CRC 转移灶的存在
    样品 332 456 193 195 479 480 485 400 400 491 491 491 375 360 353 307 434H&E 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阳性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阳性IHC 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阳性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阳性CK 肿瘤 CK SLN CCAT-1 肿瘤 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阳性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阳性 阳性 阳性 阳性 阴性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性CCAT-1 SLN 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阳性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阳性 阳性19CN 102027128 A CN 102027143 A说阳性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阳性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阳性 阴性 阴性 阴性 阴性 阳性 阴性 阴性 阴性 阳性 阴性 阴性 阴性 阴性 阳性 阳性 阳性 阳性 阴性 阴性 阴性 阳性 阳性 阴性 阴性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性明书阳性 阳性 阴性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阳性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阳性 阴性 阴性 阴性 阳性17/24 页434 435 435 441 447 354 381 391 361 374 395 395 358 340 340 392 404 410 313 318 373阳性 阳性 阴性 阳性 阳性 阳性 阳性 阴性 阴性 阳性 阳性 阴性 阴性 阴性 阳性 阴性 阳性 阴性 阳性 阳性 阳性20CN 102027128 A CN 102027143 A说阴性 阴性 阴性 阴性 阳性 阳性 阴性 阳性 阴性 阴性 阳性 阳性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性明书阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阳性 阴性 阴性 阳性 阳性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性18/24 页429 397 498 498 498 501 LN LN 血液 血液 血液
    阴性 阳性 阴性 阴性 阳性 阳性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性实施例 7 ：用于使用 CCAT-1 的 CRC 早期检测的基于 RNA 的粪便测定
     因为在淋巴结和外周血淋巴细胞中， CCAT-1 阴性样品即使通过实时 PCR 在 绝对量上也是不可检测的，所以相对量确定是无关的，并且分析的样品仅评估为此转 录物表达的阳性或阴性。 这部分研究的所有实验使用 ABI Prism 7500 系统 (Applied Biosystems， Foster City， CA) 进行。
     提取 RNA，并对 CCAT-1 进行实时 PCR。
     粪便样品
     年龄超过 18 岁的呈现有原发性、非转移性 ( 临床 I-III 期 ) 结肠癌诊断的男性或 女性患者、或在胃肠病学日间护理部 (day-care) 的被安排经历完整结肠镜检查的患者参 加此研究。
     第 1 组 -(N ＝ 15) 经历组织学证明的结肠癌的切除手术的患者 ；
     第 2 组 -(N ＝ 15) 经历完整结肠镜检查而没有在结肠镜检查中发现任何肿瘤或息 肉的患者。
     研究设计
     收集粪便样品并立即在液氮中急速冷冻。
     来自组织学证明的结肠腺癌的总 RNA 用作 PCR 的阳性对照。 阴性 PCR 对照包 括来自健康志愿者的 PBMC 和没有模板的反应混合物 ( 内部对照 )。
     CRC 患者的粪便样品中的 CCAT-1 表达
     从 15 位具有腺癌的患者和 15 位没有腺癌的患者收集粪便样品。
     RNA 提取
     粪便样品获自所有研究参与人员 (n ＝ 30)。
     RNA 可提取自新鲜样品，然而此类样品可能未含有用于分析的足量 RNA。 来自 结肠镜检查或结肠手术的肠道准备之前的患者的结肠洗液也可用于充足量和质量的 RNA 提取。 但是，此方法要求通过离心的多个浓缩步骤。 发现优选的 RNA 提取方法是通过 在液氮中急速冷冻粪便样本。 此方法产生用于分析的足量 RNA。 分析了各种量的粪便 样品，最高的 RNA 量和质量在 150mg 新鲜冷冻粪便中实现。 比较了三种不同的 RNA 提 取试剂盒，最佳结果是由 试剂盒实现的。 最终确定 RNA 提取方案之后，从 12/15(80.0％ ) 研究组样品和 9/15(60.0％ ) 对照组样品中成功提取了 RNA。
     PCR 结果
     最初在正常结肠样品中研究了所有三种标志物 (A33、Co58 和 CCAT-1)。 A-33 和 CO-58 二者在正常组织中表达，因此我们选择集中在 CCAT-1 作为我们的测定的单一 标志物。
     对具有充足 RNA 的所有样品 (n ＝ 21) 进行实时 ( 定量 )PCR。 没有证据表明 健康个体 (n ＝ 9) 的粪便中有 CCAT-1。 4/12(33.3％ ) 的来自 CRC 患者的粪便样品中有 CCAT-1 的显著表达 (p ＝ 0.001，表 2 和图 10)。
    
    表 2 ：CRC 患者的临床和分子特性。实施例 8 ：结肠癌患者的外周血中 CCAT-1 的存在
     血液样品
     15ml 血液获自参与研究的患者 (n ＝ 20)。 血液样品通过菲可梯度方法分离，并 在 -70℃储存。 提取 RNA 并进行 CCAT-1 的实时 PCR。 将结果与校准曲线进行比较。
     结肠癌患者的外周血中的 CCAT-1 表达
     为了研究 CCAT-1 的 RT-PCR 对检测小数量癌细胞的敏感性，我们生成了校准曲 线。
     将增加的浓度的结肠癌细胞系 (HT29) 细胞与 106 个 PBMC 混合。 癌细胞检测 的最低阈值为在 106 个 PBMC 中 50 个癌细胞的浓度 ( 图 3-5)。
     如图 11 中可见的，在健康个体的外周血样品中不能检测到 CCAT-1 表达。 相 反，可容易地在结肠癌患者的外周血样品中检测到不同程度的 CCAT-1 表达 ( 图 12)。
     实施例 9 ：另外的结肠直肠癌细胞系中的 CCAT-1 表达
     在宽范围的结肠直肠癌 (CRC) 细胞系中检查了 CCAT-1 的表达。 选择了 18 种 CRC 细胞系用于实验。 在这一环境中， HT-29 被设置为 CCAT-1 表达的参考。 从所有 细胞系中提取 RNA，并使用确立的方法生成 cDNA。 使用实时定量 PCR 即 qPCR 测量此 组 CRC 细胞系中的相对 CCAT-1 表达。
     表 3 ：与 HT-29 相比，18 种 CRC 细胞系中的 CCAT-1 表达的实时 ( 定量 )PCR 结果。
    CRC 细胞系 平均 Ct HT29 CaCO2 HCT15 LS 174T SK-CO-1 SW 403 SW 1222 SW 620 SW 802 SW 837 CO 61 SK-C0-11 SK CO 10 25.2 20.49 21.102 20.974 19.739 19.725 19.584 21.282 19.901 18.677 19.613 18.461 20.02523CN 102027128 A CN 102027143 A说SW1083 HT29 LOVO WS1116 SW48 SK-CO-17明书21/24 页21.026 26.229 21.04 21.366 20.244 20.34平均 Ct ＝扩增的 PCR 循环数 ( 循环数越低，样品中的特异性 cDNA 含量越高， CCAT-1 表达越高 )。
     图 13 显示与 HT-29 相比，18 种结肠直肠癌细胞系的相对 CCAT-1 表达。 将任何 给定样品中的相对 CCAT-1 表达与 HT-29( ＝ 1) 中的 CCAT-1 表达进行比较。 相对表达 值根据给定样品、样品中的看家基因 (GPADH) 和 HT-29 样品之间的平均 Ct 差异计算。
    实施例 10 ：代表结肠直肠癌以外的癌症的细胞系中的 CCAT-1 表达
     为了例证其他类型的人类癌症中的 CCAT-1 表达，通过 qPCR 筛选了代表几种常 见的人类癌症的多个细胞系的 CCAT-1 表达。
     非小细胞肺癌
     非小细胞肺癌 (NSCLC) 是人类肺癌的最常见形式。 它还是世界范围内癌症相关 死亡的主要原因。
     对比研究了来自 NSCLC 患者的人类肿瘤组织与相应的正常肺组织中的 CCAT-1 表达。 还研究了代表 NSCLC 的 16 种细胞系。 CCAT-1 表达通过定量 PCR 分析确定。
     表 4 ：16 种肺癌细胞系中的 CCAT-1 表达的实时 ( 定量 )PCR 结果
    
    样品 HT 29 612T 612N 615T 615N 618T平均 Ct 25.5 25.356 0 30.377 36.17 37.5492-ddCt 1 0.3175 结肠校准物 NSCLC 肿瘤组织 相应的肺组织 0.0117 8E-05 6E-05 NSCLC 肿瘤组织 相应的肺组织 NSCLC 肿瘤组织24CN 102027128 A CN 102027143 A说37.407 29.953 32.276 25.769 0 25.355 25.477 26-867 25.091 0 31.842 0 27.729 0 28.378 0 20.259 31.673 36.392明书相应的肺组织 NSCLC 肿瘤组织 相应的肺组织 NSCLC NSCLC22/24 页618N 629T 629N sk-lc-7 sk-lc-29 KNS-6 A549 sk-lc-1 sk-lc-12 SW1271 Luci4 calul sk-luci-8 sk-lc-13 sk-lc-5 sk-lc-19 Luci-13 SHP-77 sk-lc-2
    0.0001 0.0081 0.003 0.04850.0177 0.308 4.5159 0.2512NSCLC NSCLC NSCLC NSCLC NSCLC0.003NSCLC NSCLC0.0273NSCLC NSCLC0.0485NSCLC NSCLC2.9302 0.0003 0.0002NSCLC NSCLC NSCLC平均 Ct ＝扩增的 PCR 循环数 ( 循环数越低，样品中的特异性 cDNA 含量越高， CCAT-1 表达越高 )。 2-ddCt. ＝看家基因 (GPADH)Ct、 HT-29Ct 和感兴趣的样品 Ct 之 间计算的对数差异。 在 2/16 细胞系 (12.5％ ) 中测量到 CCAT-1 的过表达，这 2 个细胞 系是 sk-lc-1 和 Luci-13( 参见表 4)。NSCLC 细胞系中的 CCAT-1 表达 ：相对表达通过看家基因、HT-29( ＝ 1) 和感 兴趣的样品之间的 Ct 差异计算。
     图 14 显示与 HT-29 相比，16 种 NSCLC 癌症细胞系的相对 CCAT-1 表达。 将 任何给定样品中的相对 CCAT-1 表达与 HT-29( ＝ 1) 中的 CCAT-1 表达进行比较。 相对 表达值根据给定样品、看家基因 (GPADH) 和 HT-29 样品之间的平均 Ct 差异计算。
     实施例 11 ：乳腺癌细胞系中的 CCAT-1 表达
     乳腺癌是女性中癌症相关的死亡的主要原因。 尽管诊断和治疗有很大进展，但 是晚期患者的总体结果很差。 用于诊断、分期和治疗的新靶标对于改善两种疾病的结果 都是重要的。 因此，使用 qPCR 筛选了代表乳腺癌的 13 种细胞系的 CCAT-1 表达。
     表 5 ：乳腺癌细胞系中 CCAT-1 表达的实时 ( 定量 )PCR 结果
    平均 Ct ＝扩增的 PCR 循环数 ( 循环数越低，样品中的特异性 cDNA 含量越高， CCAT-1 表达越高 )。
     2-ddCt. ＝看家基因 (GPADH)Ct、 HT-29Ct 和感兴趣的样品 Ct 之间计算的对数 差异。
     所研究的 13 种乳腺癌细胞系中没有显著的 CCAT-1 表达。 此外，还研究了 6 种 黑素瘤细胞系中的 CCAT-1 表达。 没有一种黑素瘤细胞系显示显著的 CCAT-1 表达。
     实施例 12 ：原位杂交分析
     为了验证结肠癌组织中的 CCAT-1 表达和研究表达的形态学模式，进行了原位 杂交。
     来自含有肿瘤组织 (n ＝ 2) 和相邻的正常粘膜 (n ＝ 2) 的石蜡块的载玻片被用于染色。 制备 CCAT-1 的探针 ( 显示于图 16A ；SEQ ID NO.5) 以用于分析 CCAT-1 表达 的形态学模式，该探针具有以下序列 ：
     CCCGGATCCGCCTTAATAGCTAGCTGGATGAATGTTTAACTTCTAGGC
     CAGGCACTACTCTGTCCCAACAATAAGCCCTGTACATTGGGAAAGGT
     GCCGAGACATGAACTTTGGTCTTCTCTGCAATCCATCTGGAGCATTCA
     CTGACAACATCGACTTTGAAGTTGCACTGACGGGTGT
     因 为 该 基 因 不 被 翻 译， 所 以 将 探 针 克 隆 到 两 个 不 同 质 粒 以 生 成 有 义 和 反 义 探 针。 合 成 反 义 RNA 探 针， 插 入 序 列 通 过 T7 RNA 聚 合 酶 被 插 入 到 pBluescript-KS(pBSKS，细菌载体，3Kbp 长 )，并合成有义 RNA 探针，插入序列通过 T7 RNA 聚合酶被插入到 pBluescript-SK(pBSKS，细菌载体，3Kbp 长 )。 插入序列的大小为 165bp( 图 15)。 两个质粒为 ：
     1.pBluescript-SK(+)[pBSSK+]，细菌载体，3Kbp 长。
     2.pBluescript-KS(-)[pBSKS-]，细菌载体，3Kbp 长。
    这些载体是商业可得的，例如通过 Stratagene， CA.。 应理解，在这一点上，可 使用其他载体和相似的载体。
     图 16B 例证了基于筛选的原位杂交，其中显示了结肠腺癌 (a) 和相邻的正常粘膜 (b) 中的 CCAT-1 染色。 更强的 CCAT-1 染色见于肿瘤组织 (a)，相比之下，相邻的正常 粘膜中如果有 CCAT-1 染色的话，也是更低的强度。 这与显示与肿瘤相邻的正常粘膜中 的低 CCAT-1 表达的实时 PCR 结果相互关联。
     实施例 13 ：健康志愿者的外周血中的 CCAT-1 表达
     还研究了健康志愿者 (n ＝ 10) 的血液样品中的 CCAT-1 表达。
     图 17 是显示健康志愿者的外周血样品中的 CCAT-1 表达的图。 在所有血液样品 中未检测到 CCAT-1cDNA 的相对量 ( 表达 )。 如所预期的，作为阳性对照的含有肿瘤组 织的 T-400 样品中有强的 CCAT-1 扩增。
     参考文献
     1.Cancer statistics( 癌 症 统 计 学 )，2000.Greenlee RT-CA Cancer J Clin-2000 Jan-Feb ；50(1) ：7-33.
     2.Midgley R， Kerr D.Colorectal cancer( 结 肠 直 肠 癌 ).Lancet 1999 ；353 ： 391-399.
     3.Cohen Am，Kelsen D，Slatz L，等人 Adjuvant therapy for colorectalcancer( 结肠 直肠癌的佐剂治疗 ).Curr Prob Cancer 1998 ；22 ：5-65.
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