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1、10申请公布号CN102002088A43申请公布日20110406CN102002088ACN102002088A21申请号201010520215822申请日20101026C07J63/00200601C07H15/256200601C07H1/0820060171申请人南京泽朗农业发展有限公司地址211225江苏省南京市溧水县白马镇工业集中区72发明人苏刘花54发明名称两头尖中两种单体化合物的分离纯化方法57摘要本发明涉及天然药物化学技术领域，具体设计一种从两头尖中分离纯化高纯度的单体化合物竹节香附素A和两头尖皂苷D的方法。国内外多采用硅胶柱层析等传统方法来分离纯化，但分离效果均不理想。
2、。本发明先用甲醇水溶液回流或冷浸法得到两头尖粗提液，浓缩至总体积的1/106/10，低温放置，高速离心，将离心所得沉淀物用高速逆流色谱分配溶剂溶解，收集分离物，将不同成分分别收集、浓缩，乙酸乙酯乙醇重结晶，干燥得到98以上的竹节香附素A和两头尖皂苷D。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页CN102002098A1/1页21两头尖中两种单体化合物的分离纯化方法，其特征在于包括以下步骤1取两头尖根茎，粉碎后用甲醇水溶液回流或冷浸提取，合并提取液，浓缩至总体积的1/106/10，低温放置，高速离心；2将离心所得沉淀物采用高速逆流色谱仪，色谱仪分离系统。
3、由二氯甲烷、甲醇、正丙醇和水组成，其体积比为710121505248；3将溶剂系统置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，取上相作为固定相，下相作为流动相，将步骤1所得沉淀物溶于上下相的混合溶剂中，再使色谱柱中充满固定相，使主机转动，泵入流动相，由进样阀进样，根据检测器谱图接收目标成分。4将两个目标成分分别合并，浓缩、用乙酸乙酯乙醇21混合溶液重结晶，干燥即得。2如权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于步骤1中所述甲醇水溶液甲醇的体积百分比为70100，用量为药材质量的312倍，提取12次，每次提取时间为212小时。3如权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于步骤3中所述的高速逆流色谱仪中的分离。
4、柱转速为6001000R/MIN，所述流动相的流速为25ML/MIN。权利要求书CN102002088ACN102002098A1/4页3两头尖中两种单体化合物的分离纯化方法技术领域0001本发明属于天然植物提取技术领域，设计一种从两头尖中用高速逆流色谱法同时分离纯化竹节香附素A和两头尖皂苷D。背景技术0002两头尖系毛茛科RANUNCULACEAE多被银莲花ANEMONERADDEANAREGEL的根茎。产于东北地区及山东等地，以吉林省产量最大。该药首载于明朝刘文泰所著本草品汇精要中，临床上有“祛风除湿，消痈肿”的作用，用于“风寒湿痹、四肢拘挛、骨节疼痛、疮痈溃烂”等症。0003竹节香附素A。
5、ANEMODEANINA和两头尖皂苷DRADDEANOSEDED是两头尖的主要有效成分，均为三萜苷类化合物。具有较强的生理活性。林小钦等将不同质量浓度的竹节香附素A与HEPG2细胞共同培养，采用MTT比色法及细胞集落形成法检测竹节香附素A对HEPG2细胞生长、增殖的影响。结果竹节香附素A各剂量的作用与未处理组相比，在各时间点均有显著差异，从而得到结论竹节香附素A对HEPG2细胞增殖有明显抑制作用，在一定范围内随着试药质量浓度的升高和作用时间的延长而增强。两头尖皂苷D具有较强的抗癌活性。总皂苷能抑制癌的形成。皂苷D、F、H对人体致病的乙型链球菌、绿脓杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、金黄色葡球菌等均呈现。
6、不同程度的抑菌作用，对醋酸所致小鼠痛觉反应，热刺激引起的疼痛均有镇痛作用。皂苷D对角叉菜胶所致肿胀有明显抑制作用，抑制强度高于总皂苷。两头尖总皂苷、皂苷D对正常小鼠自发活动有抑制作用，以皂苷D为最强。王明奎等用水解和溶剂萃取的方法从中药两头尖中提取制备了待测总皂苷银莲花素A占总苷的20，并研究了总皂苷的体外和体内的抑瘤活性，发现制备的两头尖总苷具有较好的抑制肿瘤生长的活性，是一个有潜力的抗癌药物。0004刘大有等已对两头尖进行了分离及结构鉴定，采用的为常压硅胶柱法，但其采用正丁醇萃取再上大孔树脂，正丁醇萃取率较低，保留成分损失较大。中国专利申请号2006101243275采用水煎煮后，以乙醇为。
7、洗液用树脂柱吸附，制得的两头尖皂苷纯度仅为85，但该方法引入碱液，易引起化合物化学性质的变化，使化合物不稳定并增加损失。0005高速逆流色谱HIGHSPEEDCOUNTERCURRENTCHROMATOGRAPHY，HSCCC是国际上世纪80年代以来在液液分配色谱基础上发展起来的新型分离技术，其分离原理是利用螺旋柱在高速行星运动时产生的巨大离心力，使螺旋柱中互不相溶的两相不断混合，达到稳定的流体动力学平衡态。HSCCC的流动相、固定相为互不相溶的液体。利用螺旋管柱方向性及特定的高速流星式旋转所产生的离心场作用，使无载体支持的固定相稳定地保留在聚四氟乙烯管中，利用恒流泵连续输入流动相，随流动相进。
8、入螺旋柱的溶质再两相间持续分配，按分配系数大小依次洗脱。HSCCC具有以下优点无不可逆吸附，聚四氟乙烯管中的固定相不需要载体，可以消除气液和固液色谱中因使用载体而带来的吸附现象，避免样品再分离过程可能存在的变性，适用于分离极性物质和生物活性物质；回收率高，由于液体作为流动相和固定相，滞留在柱中的样品可以通过多种洗脱方式予以完全回收，能够同时完成分说明书CN102002088ACN102002098A2/4页4离纯化与制备，适于制备性分离；操作简单快捷，因固定相为液体，体系更换与平衡方便、快捷；与HPLC相比，HSCCC进样量较大，最多可达数克，是HPLC的数百倍。与常压、低压色谱相比，HSCC。
9、C的分离能力强，有些样品经一次分离即得到1个甚至多个化合物，并且分离时间短，数小时即可完成。发明内容0006本发明针对高含量竹节香附素A和两头尖皂苷D缺乏的问题，在已有研究基础上，采用高速逆流色谱技术从两头尖中分离制备出这两种活性成分。0007本发明的目的在于提供一种两头尖中两种单体化合物的分离纯化方法，利用该方法得到的竹节香附素A和两头尖皂苷D的纯度高达98。0008本发明提供的一种两头尖中两种单体化合物的分离纯化方法包括以下步骤00091取两头尖根茎，粉碎后用甲醇水溶液回流或冷浸提取，合并提取液，浓缩至总体积的1/106/10，低温放置，高速离心；00102将离心所得沉淀物采用高速逆流色谱。
10、仪，色谱仪分离系统由二氯甲烷、甲醇、正丙醇和水组成，其体积比为710121505248；00113将溶剂系统置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，取上相作为固定相，下相作为流动相，将步骤1所得沉淀物溶于上下相的混合溶剂中，再使色谱柱中充满固定相，使主机转动，泵入流动相，由进样阀进样，根据检测器谱图接收目标成分。00124将两个目标成分分别合并，浓缩、用乙酸乙酯乙醇21混合溶液重结晶，干燥即得。0013步骤1中所述甲醇水溶液甲醇的体积百分比为70100，用量为药材质量的312倍，提取12次，每次提取时间为212小时。0014步骤3中所述的高速逆流色谱仪中的分离柱转速为6001000R/MIN，所述。
11、流动相的流速为25ML/MIN。0015本发明具有的积极效果是本发明采用高速逆流色谱进行竹节香附素A和两头尖皂苷D的分离纯化，分离条件温和，分离时间短，不引入酸碱，减少了化合物的损失，保持了化合物的稳定性。具体实施方式0016实施例10017两头尖200G用800ML甲醇冷浸提取，提取2次，每次浸泡时间为10小时，合并提取液，减压回收甲醇，浓缩至原体积的1/10，低温放置2小时，然后在3000RPM转速下离心10分钟，得离心沉淀物677G。0018精确称取离心沉淀物1G，用二氯甲烷甲醇正丙醇水91416混合溶剂系统溶解样品，开启恒温循环器，以该溶剂系统的上相为流动相，下相为固定相，泵入流动相和。
12、固定相，当溶剂从管路出口流出时，停止泵入固定相，设定流动相流速为3ML/MIN，同时启动主机，调节转速为850RPM，待管柱内溶剂达成动态平衡，管柱出口只有流动相流出。设定波长为207NM，根据谱峰分别收集保留成分。浓缩后分别用乙酸乙酯乙醇21重结晶，干燥得到得到竹节香附素A53MG含量988和两头尖皂苷D47MG含量说明书CN102002088ACN102002098A3/4页5986。0019实施例20020两头尖200G用600ML甲醇回流提取，提取1次，每次提取时间为2小时，合并提取液，减压回收甲醇，浓缩至原体积的4/10，低温放置5小时，然后在4000RPM转速下离心15分钟，得离心。
13、沉淀物704G。0021精确称取离心沉淀物14G，用二氯甲烷甲醇正丙醇水81327混合溶剂系统溶解样品，开启恒温循环器，以该溶剂系统的上相为流动相，下相为固定相，泵入流动相和固定相，当溶剂从管路出口流出时，停止泵入固定相，设定流动相流速为5ML/MIN，同时启动主机，调节转速为600RPM，待管柱内溶剂达成动态平衡，管柱出口只有流动相流出。设定波长为207NM，根据谱峰分别收集保留成分。浓缩后分别用乙酸乙酯乙醇21重结晶，干燥得到得到竹节香附素A70MG含量983和两头尖皂苷D56MG含量990。0022实施例30023两头尖2KG用24L甲醇冷浸提取，提取1次，每次浸泡时间为12小时，合并提。
14、取液，减压回收甲醇，浓缩至原体积的1/10，低温放置4小时，然后在5000RPM转速下离心10分钟，得离心沉淀物716G。0024精确称取离心沉淀物15G，用二氯甲烷甲醇正丙醇水71518混合溶剂系统溶解样品，开启恒温循环器，以该溶剂系统的上相为流动相，下相为固定相，泵入流动相和固定相，当溶剂从管路出口流出时，停止泵入固定相，设定流动相流速为4ML/MIN，同时启动主机，调节转速为900RPM，待管柱内溶剂达成动态平衡，管柱出口只有流动相流出。设定波长为207NM，根据谱峰分别收集保留成分。浓缩后分别用乙酸乙酯乙醇21重结晶，干燥得到得到竹节香附素A76MG含量986和两头尖皂苷D71MG含量。
15、989。0025实施例40026两头尖5KG用30L甲醇回流提取，提取2次，每次提取时间为3小时，合并提取液，减压回收甲醇，浓缩至原体积的3/10，低温放置3小时，然后在4500RPM转速下离心15分钟，得离心沉淀物1780G。0027精确称取离心沉淀物12G，用二氯甲烷甲醇正丙醇水1012059混合溶剂系统溶解样品，开启恒温循环器，以该溶剂系统的上相为流动相，下相为固定相，泵入流动相和固定相，当溶剂从管路出口流出时，停止泵入固定相，设定流动相流速为3ML/MIN，同时启动主机，调节转速为750RPM，待管柱内溶剂达成动态平衡，管柱出口只有流动相流出。设定波长为207NM，根据谱峰分别收集保留。
16、成分。浓缩后分别用乙酸乙酯乙醇21重结晶，干燥得到得到竹节香附素A61MG含量988和两头尖皂苷D57MG含量985。0028实施例50029两头尖10KG用70L甲醇冷浸提取，提取2次，每次浸泡时间为8小时，合并提取液，减压回收甲醇，浓缩至原体积的2/10，低温放置5小时，然后在3500RPM转速下离心10分钟，得离心沉淀物3518G。0030精确称取离心沉淀物13G，用二氯甲烷甲醇正丙醇水91128说明书CN102002088ACN102002098A4/4页6混合溶剂系统溶解样品，开启恒温循环器，以该溶剂系统的上相为流动相，下相为固定相，泵入流动相和固定相，当溶剂从管路出口流出时，停止泵入固定相，设定流动相流速为5ML/MIN，同时启动主机，调节转速为950RPM，待管柱内溶剂达成动态平衡，管柱出口只有流动相流出。设定波长为207NM，根据谱峰分别收集保留成分。浓缩后分别用乙酸乙酯乙醇21重结晶，干燥得到竹节香附素A66MG含量992和两头尖皂苷D61MG含量987。说明书CN102002088A。