一种应用原生动物纤毛虫降解石油的方法.pdf

本发明涉及一种应用原生动物纤毛虫降解石油的方法，其特征包括如下步骤：A.从环境中分离纯化纤毛虫种群；B.纤毛虫种群的驯化；C.驯化后纤毛虫种群对原油的降解；D.绘制纤毛虫种群生长曲线；F.培养7天后测定对照组和实验组原油含量的变化，计算原油降解率。本发明首次发现原生动物四膜虫(Tetrahymena)属、肾形虫(Colpoda)属，对于石油具有很强的降解能力，降解率最高分别可达68.08％和83.06％。并且纤毛虫可以通过光学显微镜观察鉴定种类，分离、纯化步骤简单方便，易于培养，作为石油降解生物，可大大促进石油污染的治理和原油的微生物开采，对生物法石油污染修复极具实用价值。

1、  一种应用原生动物纤毛虫降解石油的方法，其特征包括如下步骤：
A、从环境中分离纯化纤毛虫种群：从油污染的水域或土壤中采集原生动物群落，实验室内用麦粒培养液扩群，操作步骤为：显微镜下吸取一只纤毛虫，用麦粒培养液扩大培养，获得纤毛虫的单一种群；
B、纤毛虫种群的驯化：上述分离纯化的纤毛虫种群培养液中加如重量比例为0.5％原油，恒温摇床振荡培养，驯化3-5天；
C、驯化后纤毛虫种群对原油的降解：
实验组在无机盐培养基中加入石油，将石油在培养基中的浓度设置成高、中、低三个梯度，重量体积比分别为0.25％(a)、0.50％(b)、1.00％(c)，每一梯度设三到四个平行，然后加入等量400-600个虫体/ml的处于对数生长期的四膜虫Tetrahymena sp.以及等量麦粒培养液，以麦粒培养液中自然繁殖的细菌和培养液中溶解的营养成分作为四膜虫的食物；
对照组中加入等量麦粒培养液作为对照，每组设三个平行；
D、绘制纤毛虫种群生长曲线：每隔12小时进行取样观察，并对四膜虫Tetrahymena sp.进行计数，观察四膜虫Tetrahymena sp.的生长状况，绘制其种群生长曲线；
F、培养7天后测定对照组和实验组原油含量的变化，计算原油降解率。

2、  根据权利要求1所述的应用原生动物纤毛虫降解石油的方法，其特征在于：步骤A所述的麦粒培养液是：用5克麦粒加水1000毫升，煮到麦粒裂开，放24小时后，取其液汁。

3、  根据权利要求1所述的应用原生动物纤毛虫降解石油的方法，其特征在于：步骤B所述的恒温摇床振荡培养条件是：转速200转，培养温度30℃。

4、  根据权利要求1所述的应用原生动物纤毛虫降解石油的方法，其特征在于：步骤C所述的无机盐培养基组成是：
MgSO₄·7H₂O       0.20g
CaCl2             2.00g
FeSO₄·7H₂O       0.01g
KH₂PO₄            0.40g
Na₂HPO₄           0.02g
MnSO₄·7H₂O       0.02g
NH₄NO₃            1.00g
加水至            1000mL。

5、  根据权利要求1所述的应用原生动物纤毛虫降解石油的方法，其特征在于：步骤F所述的原油含量的测定包括：
培养7天后用5mL正己烷冲洗锥形瓶，倒入分液漏斗中，反复冲洗两遍，充分振荡后静止5min，将下层液体放出，上层倒入25mL容量瓶中，将下层再萃取一遍，也导入容量瓶中，定容，待测；
标准曲线的绘制：称取5瓶每瓶0.1500g原油，分别溶于15mL正己烷中，倒入25mL容量瓶中，定容；
分别取2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5、20.0、22.5mL定容至25mL，待测；
在波长252nm用紫外分光光度计测吸光值，绘制标准曲线。

6、  根据权利要求1所述的应用原生动物纤毛虫降解石油的方法，其特征在于：步骤F所述的原油降解率的计算包括：
原油降解率＝(原油加入重量-原油降解后剩余重量)/原油重量×100％其中：原油加入重量是在加入时称量，为已知；
原油降解后剩余重量由分光光度计测定吸光值后求出。

一种应用原生动物纤毛虫降解石油的方法
技术领域
本发明涉及一种应用原生动物纤毛虫降解石油的方法，属于生物技术和环境科学领域技术领域。
背景技术
石油主要是由多种烃类(烷烃、环烷烃、芳香烃、多环芳烃)及少量其他有机物(硫化物、氮化物、烷烃酸类)所组成的混合物，随着社会和经济的飞速发展，石油及其制品被广泛地应用于社会的各个领域。但是在此同时，石油对环境产生的污染也成为目前全球普遍关注的焦点问题。石油严重污染了人类赖以生存的环境，污染对土壤、大气、地下水、海洋和人类、动物、植物造成了严重的危害。尤其是海上石油勘探、开发和炼制业的发展，交通运输与油船事故的发生，对环境造成了严重的影响。
目前石油污染的治理方法主要有物理法、化学法及生物修复技术。生物修复方法具有成本相对较低、操作简单以及无二次污染等优点。近年来，微生物对石油烃降解的深入研究国内外已有很多报道，生物法也取得了很大的成就。国内外研究发现，在土壤和水体环境中存在着大量能够降解石油烃的微生物，主要是细菌和真菌；细菌在海洋生态系统的石油烃类降解中占主导地位，而真菌则是淡水和陆地生态系统中更为重要的修复因子。据报道，能够降解石油的微生物有200多种，分属于70多个属。
长期以来，人们关注于石油降解细菌、真菌的筛选。筛选步骤繁琐，一些菌种容易退化，而原生动物是单细胞真核生物，在水体、土壤生态系统中占据重要地位，数量丰富，是基础食物链的重要环节，在物质循环和能量流动中占据重要地位，目前关于原生动物纤毛虫对于石油降解的研究国内外均无报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以原生动物纤毛虫降解石油的技术方案，研究从油污染的水域或土壤中分离、纯化纤毛虫种群及驯化过程，给出纤毛虫降解石油的应用方向。
本发明的目的是这样实现的：这种应用原生动物纤毛虫降解石油的方法，其特征包括如下步骤：
A、从环境中分离纯化纤毛虫种群：从油污染的水域或土壤中采集原生动物群落，实验室内用麦粒培养液扩群，操作步骤为：显微镜下吸取一只纤毛虫，用麦粒培养液扩大培养，获得纤毛虫的单一种群；
B、纤毛虫种群的驯化：上述分离纯化的纤毛虫种群培养液中加如重量比例为0.5％原油，恒温摇床振荡培养，驯化3-5天；
C、驯化后纤毛虫种群对原油的降解：
实验组在无机盐培养基中加入石油，将石油在培养基中的浓度设置成高、中、低三个梯度，重量体积比分别为0.25％(a)、0.50％(b)、1.00％(c)，每一梯度设三到四个平行，然后加入等量400-600个虫体/ml的处于对数生长期的四膜虫Tetrahymena sp.以及等量麦粒培养液，以麦粒培养液中自然繁殖的细菌和培养液中溶解的营养成分作为四膜虫的食物；
对照组中加入等量麦粒培养液作为对照，每组设三个平行；
D、绘制纤毛虫种群生长曲线：每隔12小时进行取样观察，并对四膜虫Tetrahymena sp.进行计数，观察四膜虫Tetrahymena sp.的生长状况，绘制其种群生长曲线；
F、培养7天后测定对照组和实验组原油含量的变化，计算原油降解率。
所述的应用原生动物纤毛虫降解石油的方法，步骤A所述的麦粒培养液是：用5克麦粒加水1000毫升，煮到麦粒裂开，放24小时后，取其液汁。
所述的应用原生动物纤毛虫降解石油的方法，步骤B所述的恒温摇床振荡培养条件是：转速200转，培养温度30℃。
所述的应用原生动物纤毛虫降解石油的方法，步骤C所述的无机盐培养基组成是：
MgSO₄·7H₂O     0.20g
CaCl2           2.00g
FeSO₄·7H₂O     0.01g
KH₂PO₄          0.40g
Na₂HPO₄         0.02g
MnSO₄·7H₂O     0.02g
NH₄NO₃          1.00g
加水至          1000mL。
所述的应用原生动物纤毛虫降解石油的方法，步骤F所述的原油含量的测定包括：
培养7天后用5mL正己烷冲洗锥形瓶，倒入分液漏斗中，反复冲洗两遍，充分振荡后静止5min，将下层液体放出，上层倒入25mL容量瓶中，将下层再萃取一遍，也导入容量瓶中，定容，待测；
标准曲线的绘制：称取5瓶每瓶0.1500g原油，分别溶于15mL正己烷中，倒入25mL容量瓶中，定容；
分别取2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5、20.0、22.5mL定容至25mL，待测；
在波长252nm用紫外分光光度计测吸光值，绘制标准曲线。
所述的应用原生动物纤毛虫降解石油的方法，步骤F所述的原油降解率的计算包括：
原油降解率＝(原油加入重量-原油降解后剩余重量)/原油重量×100％其中：原油加入重量是在加入时称量，为已知；
原油降解后剩余重量由分光光度计测定吸光值后求出。
本发明研究了原生动物纤毛虫对石油的降解能力，首次发现原生动物四膜虫(Tetrahymena)属，肾形虫(Colpoda)属，对于石油具有很强的降解能力。并且纤毛虫可以通过光学显微镜观察鉴定种类，分离、纯化步骤简单方便，易于培养，作为石油降解生物，可大大促进石油污染的治理和原油的微生物开采，对生物法石油污染修复极具实用价值。
附图说明
图1是不同浓度下四膜虫Tetrahymena sp.的生长曲线，说明四膜虫在石油降解过程中能够存活和发挥降解作用。
图2是原油重量和吸光度关系的标准曲线
具体实施方式
实施例1、应用四膜虫Tetrahymena sp.降解石油：
A、从环境中分离纯化纤毛虫种群：从油污染的水域或土壤中采集原生动物群落，实验室内用麦粒培养液扩群，操作步骤为：显微镜下吸取一只四膜虫Tetrahymena sp.，用麦粒培养液扩大培养，获得纤毛虫的单一种群；
其中：麦粒培养液是用5克麦粒加水1000毫升，煮到麦粒裂开，放24小时后，取其液汁。
B、纤毛虫种群的驯化：上述分离纯化的纤毛虫种群培养液中加如重量比例为0.5％原油，恒温摇床振荡培养，驯化3-5天；
其中：恒温摇床振荡培养条件是转速200转，培养温度30℃。
C、驯化后纤毛虫种群对原油的降解：
实验组在无机盐培养基中加入石油，将石油在培养基中的浓度设置成高、中、低三个梯度，重量体积比分别为0.25％(a)、0.50％(b)、1.00％(c)，每一梯度设三到四个平行，然后加入等量400-600个虫体/ml的处于对数生长期的四膜虫Tetrahymena sp.以及等量麦粒培养液，以麦粒培养液中自然繁殖的细菌和培养液中溶解的营养成分作为四膜虫的食物；
其中所述的无机盐培养基组成是：
MgSO₄·7H₂O    0.20g
CaCl2          2.00g
FeSO₄·7H₂O    0.01g
KH₂PO₄         0.40g
Na₂HPO₄        0.02g
MnSO₄·7H₂O    0.02g
NH₄NO₃         1.00g
加水至         1000mL。
对照组中加入等量麦粒培养液作为对照，每组设三个平行。
D、绘制纤毛虫种群生长曲线：每隔12小时进行取样观察，并对四膜虫Tetrahymena sp.进行计数，观察四膜虫Tetrahymena sp.的生长状况，绘制其种群生长曲线，如图1所示。
F、培养7天后测定对照组和实验组原油含量的变化，计算原油降解率：
原油含量的测定包括：
培养7天后用5mL正己烷冲洗锥形瓶，倒入分液漏斗中，反复冲洗两遍，充分振荡后静止5min，将下层液体放出，上层倒入25mL容量瓶中，将下层再萃取一遍，也导入容量瓶中，定容，待测；
标准曲线的绘制：称取5瓶每瓶0.1500g原油，分别溶于15mL正己烷中，倒入25mL容量瓶中，定容；
分别取2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5、20.0、22.5mL定容至25mL，待测；
在波长252nm用紫外分光光度计测吸光值，绘制标准曲线，如图2所示。
原油降解率的计算：
原油降解率＝(原油加入重量-原油降解后剩余重量)/原油重量×100％
其中：原油加入重量是在加入时称量，为已知；
原油降解后剩余重量由分光光度计测定吸光值后求出。
在原油浓度分别为0.25％、0.5％和1％的条件下，四膜虫Tetrahymena sp.对原油的降解率分别为68.08％、60.92％和37.40％。
实施例2、按上述四膜虫的方法测定肾形虫Colpoda sp.)原油降解率，在原油浓度分别为0.25％、0.5％和1％的条件下，肾形虫(Colpoda sp.)对原油的降解率分别为83.06％、80.12％和62.13％。
表1.
四膜虫(Tetrahymena sp.)和肾形虫(Colpoda sp.)对原油的降解率

本发明列举的实施例旨在更进一步地阐明这种原生动物纤毛虫降解石油的方法和应用方向，而不对本发明的保护范围构成任何限制。