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用于产生感染性流感病毒的DNA转染系统
本申请要求2000年4月28日申请的美国临时申请号60/200,679的利益，这里以其完整形式引入作为参考。
导致本发明的研究受到国立变态反应和传染性疾病研究院的公众健康研究基金AI95357，AI29680，AI08831，AI29559和AI29680的支持。因此，美国政府可以享有本发明的某些权力。
发明领域
本发明涉及从克隆DNA中产生感染性RNA病毒，优选流感病毒的基于最少质粒的系统的发展。特别是这个多质粒pol I-pol II系统利于重组和重配病毒的产生。在优选实施方案中，本发明包括八质粒polI-pol II系统以产生流感病毒。它在完全从克隆cDNA回收其它RNA病毒中也具有适用性。
发明背景
RNA病毒生活史
RNA病毒基因组有不同的构型，包括单分子的或节段的；(+)或(-)极性单链的或双链的。然而，病毒间享有的两个基本的共同的必要条件是：(1)基因组RNA应该可被高效复制为可有效用于装配成后代病毒颗粒的形式和(2)必须合成可高效翻译为病毒蛋白的mRNA。通常，RNA病毒(除了逆转录病毒)编码和/或携带RNA依赖性RNA聚合酶催化新的基因组RNA(装配给后代)和mRNA(翻译为病毒蛋白)的合成。由于真核宿主细胞典型地不含复制RNA模板或由负链或双链RNA模板翻译多肽的装置，所以在其基因组中含这些核酸的病毒在病毒颗粒中应该携带RNA聚合酶蛋白。由于这个原因，负链和双链RNA病毒的去蛋白质的RNA分子(缺乏相关的RNA聚合酶)是非感染性的。相比之下，来自正链RNA病毒基因组的去蛋白质RNA典型地是感染性的，因为编码的病毒蛋白可被宿主细胞装置翻译。
为了病毒的传递，基因组病毒RNA应该被包装到病毒颗粒中。一些RNA病毒壳体被来自感染的宿主细胞的脂类膜包裹，而其它具有外部病毒蛋白壳不含脂质双层的膜。不管病毒壳体间的差异，后代病毒颗粒装配方法和装配过程中发生的蛋白/蛋白间的相互作用是相似的。病毒蛋白通常分为结构和非结构蛋白。通常，非结构蛋白参与基因组复制、转录和包装的调节。结构蛋白通常执行三种类型的功能，包括：(1)结合基因组RNA(即甲型流感病毒的核壳蛋白)，(2)包装RNA和外部蛋白之间搭桥(即基质蛋白)和(3)建立病毒外层(即表面蛋白如血凝素)。装配到病毒颗粒中确保RNA基因组从单个宿主内或不同的宿主生物体中的一个宿主细胞传递给另一个。
流感病毒
甲型流感病毒，正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，是基因组节段化的负义RNA病毒。基因组RNA含有与5’和3’末端非编码序列相连接的一个或多个开放阅读框架(Desselberger等，Gene 1980，8：315)。病毒RNA与病毒粒体和感染细胞中的病毒核蛋白(NP)和聚合酶蛋白(PB1，PB2和PA)结合形成核糖核蛋白(RNP)复合体(Hsu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1987，84：8140)。其遗传成分允许这个病毒通过来自不同菌株的基因节段的重配而进化；该重配产生新的变异体，新转染的生物体不具有记忆免疫反应。在水生鸟中传播的15个血凝素(HA)和9个神经氨酸酶(NA)亚型流感中，已知H1N1，H2N2和H3N2三个亚型可引起人类大流行(Webster等，Microbiol.Rev.1992，56：152)。有证据表明猪可以作为中间宿主(“混合载体”)产生对人类致病性的新菌株(Scholtissek等，Virology 1985，147：287)。1997年香港H5N1甲型流感爆发表明高度致病性的甲型流感病毒也可以从鸟种直接传播给人(Claas等，Lancet 1998，351：472；Suarez等，J.Virol.1998，72：6678；Subbarao等，Science 1998，279：393；Shortridge，Vaccine 1999，17(Suppl.1)：S26-S29)。甲型流感病毒从自然储畜宿主的大量传播菌株产生新的致病性菌株，表明疾病控制需要监测这些病毒和发展改良的抗病毒治疗和疫苗。新菌株发展的速度要求警戒此监测效果，并扩大当前技术能力以产生足够量的对抗新鉴定的致病性菌株的疫苗来预防流行或大流行。
对于甲型流感病毒，反向遗传学系统允许病毒基因组的操作(Palese等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996，93：11354；Neumann和Kawaoka；Adv.Virus Res.1999，53：265)。与正链病毒(即脊髓灰质炎病毒)，甲型流感病毒的负义病毒RNA(vRNAs)是非感染性的。只有四个病毒聚合酶复合体蛋白(PB1，PB2，PA，NP)包壳的vRNA分子能够启动病毒复制和转录循环。核糖核蛋白(RNPs)穿透细胞核后，有关蛋白开始将(-)vRNA转录为mRNAs和正义互补RNAs(+)cRNAs。这些cRNAs作为vRNAs合成的模板。流高病毒A发展的第一个反向遗传系统是RNA转染方法(Luytjes等，Cell 1989，59：1107；Enami等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1990，87：3802)。T7RNA聚合酶体外转录病毒样vRNA和病毒核糖核蛋白(vRNP)分子重构后，遗传改变的RNP节段通过转染被导入真核细胞中。流感辅助病毒的感染导致具有来自克隆cDNA的基因的病毒产生。然而，RNA和DNA转染方法中辅助病毒的存在严格限制了这些方法的实际价值，因为需要强大的选择系统去除辅助病毒。
RNA聚合酶I(pol I)驱动的vRNA分子的体内合成的建立允许细胞内产生RNA复合体(Neumann和Hobom，Virology 1994，202：477)。在这个系统中，病毒样cDNA插入在pol I启动子和终止序列之间(Zobel等.，Nucl.Acids Res.1993，21：3607)。与RNA聚合酶II(pol II)合成的mRNA转录物不同，pol I产生的RNAs缺乏5’帽和3’聚(A)尾巴。用辅助病毒感染或编码PB1，PB2，PA或NP的蛋白表达质粒共转染可以产生功能性vRNP蛋白(Neumann和Hobom，见上；Flick等，RNA 1996，2：1046；Pleschka等，J.Virol.1996，70：4188；Zhou等，Virology 1998，246：83)。
近来的研究证明质粒驱动的由pol I启动子的全部八个vRNAs的表达和聚合酶复合体蛋白的共表达导致感染性甲型流感病毒形成(Neumann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999，96：9345；Fodor等，J.Virol.1999，73：9679)。因为完全由质粒驱动的甲型流感病毒的产生不需要辅助病毒感染，所以不需要选择系统；因此，可没有技术限制地操作所有基因节段。在Neumann等(前述)发展的系统中，八个cDNAs插入在人pol I启动子序列(407bp)和小鼠终止序列(174bp)之间。人巨细胞病毒启动子驱动四个RNP-复合体蛋白的表达。12个质粒转染10⁶293T细胞产生10³pfu以上的病毒回收率；17个质粒转染后，这个效率可以增加到5×10⁷pfu。Fodor等(前述)发展的系统，其中八个cDNAs插入在人pol I启动子序列(250bp)和δ肝炎病毒的基因组核酶序列之间，确保vRNA的精确3’末端。对于聚合酶复合体基因的表达，使用含腺病毒2型主要晚期启动子的质粒。12个表达质粒转染给Vero细胞后，从10⁶个转染细胞中仅回收到一个或两个感染性病毒颗粒。
然而，Neumann等(前述)描述的无辅助病毒的系统，它在不同的质粒上含有带流感病毒cDNAs的pol I和pol I I启动子，需要构建和共转染至少12个质粒用于回收病毒，和17个质粒用于高效回收病毒。用这种许多数量的质粒转染细胞可能将这个系统的应用限制于具有高转染效率的细胞系。为能够从不同的细胞类型中回收病毒，可以通过增强甲型流感病毒在这些细胞中的复制而增加病毒产量，和增加适合制备疫苗的细胞范围(Govorkova等，J.Virol.1996，70：5519)。
因此，本领域需要更有效地产生重组流感病毒。而且，本领域进一步需要有效产生重配病毒用于对新鉴定病毒株发生反应的疫苗的制备。通过提供从一个模板合成病毒基因组负链RNA节段(vRNA)和病毒mRNA的系统，由此使病毒产生所需的质粒数量降至最少并允许高效和可预知的重配，本发明满足了本领域的这些和其它需要。
呼肠孤病毒
来自呼肠弧病毒科(Reoviridae)的病毒，包括轮状病毒属的病毒，包含双链的和节段化的RNA基因组。人轮状病毒是美国儿童严重腹泻的最常见病毒物，每年引起大约50,000人住院治疗和20至50人死亡，估计每年费用是10亿美元。在发展中国家，估计轮状病毒引起腹泻相关的全部住院治疗的三分之一并引起每年大约850,000人死亡。
存在报道轮状病毒血清型的双系统是由于两种病毒蛋白(VP)，VP7和VP4激发的中和反应。VP7血清型指定为G型，来自VP4的血清型描述为P型。迄今为止，在人类中发现了至少10种G血清型和至少7种P血清型。由于VP4和VP7基因分别分离，所以新的轮状病毒是重配产生的。在美国，血清型P1至P4和G1至G4是最常见的；在如印度和埃及的国家报道了其它组合。第一个许可的人轮状病毒疫苗-恒河猴轮状病毒疫苗，配制产生了对抗四种普通血清型G1至G4的血清型特异性保护。然而，这个疫苗由于疫苗接种和疫苗接受者套叠率增加之间的关联而被撤回。因此，需要产生不具有不需要的副作用的表现所有G和P亚型的轮状病毒疫苗。本发明提供了可用于完全从克隆cDNA产生轮状病毒的载体，(优选质粒)，方法和宿主细胞。
已经确定了十三种初级基因产物。为使混乱降至最少和利于与来自呼肠弧病毒科其它属的功能相似的蛋白的比较，采用下列命名法：根据它们在SDS-PAGE分析中的迁移，从最大的蛋白开始，结构蛋白给予前缀“VP”，非结构蛋白给予前缀“NSP”，在括号中给出每个蛋白的功能。例如，缩写VP1(Pol)表示在病毒颗粒中最大的蛋白是RNA依赖性RNA聚合酶。七个结构蛋白装配到病毒颗粒，病毒颗粒包含三层结构：(1)含dsRNA基因组的内病毒核具有三个与之结合的蛋白，其中两个(VP1(pol)和VP3(Cap))与基因组直接结合，而第三个(VP2(T2))构成核壳，(2)病毒粒体的中间蛋白壳是由260个三聚体单位排列成的780个VP6(T13)分子组成的，和(3)VP4和VP7组成外壳。峰蛋白VP4含有对切割成VP5和VP8重要的胰蛋白酶切割位点，这个切割可增强感染性。发现来自不同框内阅读框架的两种形式的VP7，VP7(1)和VP7(2)掺入在病毒粒体中。
关于六种非结构蛋白的功能知之甚少。与其它RNA病毒类似，预期非结构蛋白在病毒复制、转录、病毒RNAs的翻译和包装中起着重要作用。实质上，基于温度敏感性病毒节段8的分析，假定NSP2(ViP)在病毒复制中有直接作用。认为NSP3结合病毒mRNAs3’末端的保守序列和细胞帽结合蛋白eIF4G，由此特异性上调具有5’帽结构但不含3’聚A尾巴的轮状病毒mRNA翻译。NSP1看来不重要，但它可能在细胞培养中轮状病毒的复制中起活跃作用。认为NSP4参与病毒形态形成。两种非结构蛋白，NSP5和NSP6由来自节段11的两个不同的阅读框架编码，但不知道它们在病毒生活史中的功能。
复制循环在37℃下10-12小时内完成。当前资料表明病毒可通过受体介导的胞吞进入细胞，但可能有进入细胞的可替换机制。进入宿主细胞后，病毒外壳将转录活性双壳颗粒释放到感染细胞的细胞质。病毒粒体关联酶产生5’带帽无聚腺苷酸的mRNAs，该mRNAs是每个病毒粒体基因组节段负链的全长转录物。来自每个节段的病毒mRNAs执行两个功能：第一，它们被翻译产生该节段编码的病毒蛋白，和第二，病毒mRNAs也是基因组复制的模板。基因组节段装配由选择形成precore RI的不同病毒mRNAs而发生。11个mRNAs装配之后是负链合成，它发生在“core-RI”和VP6(T13)-RI，它们存在于感染细胞的细胞质中发现的“病毒胞浆”中。后代病毒粒体形态形成中的后续步骤是轮状病毒独特的并包括在涉及NSP4的过程中双层颗粒出芽到内质网中。这导致颗粒暂时需要被膜，当加入VP4和VP7的病毒粒体外壳时，该被膜在最后成熟步骤中失去。
节段化的基因组，非常有序的基因组结构和复杂的复制循环构成开发反向遗传系统产生轮状病毒的挑战。然而，本发明可用于简单和方便地产生轮状病毒。
流感疫苗
公共卫生部门当前许可用在美国和欧洲的流感疫苗是灭活流感疫苗。代表流行病学上重要的甲型流感和乙型流感株的病毒在含胚鸡卵中生长且病毒颗粒用化学方法随后纯化和灭活。每年WHO选择最可能会传播的亚型：当前为甲型流感的两株(H1N1)和(H3N2)，和乙型株。
对于安全和有效的疫苗制备，所选疫苗株与传播株密切相关是很重要的，由此确保疫苗接种人群中的抗体能够中和抗原类似的病毒。然而，不是所有发现密切相关的病毒都适合制备疫苗，因为它们在卵中很少生长。因此，最好试图产生高度生长的重配病毒将实验株(A/PR/8/34)的病毒产量高(H1N1)与预期致病株的抗原特性结合。不幸的是，用含八个节段的两个流感病毒共转染理论上产生2⁸＝256个不同的后代病毒。为了获得具有所需糖蛋白抗原的高生长病毒，需要选择方法从亲本高生长实验株中去除相应的基因节段。获得具有适当糖蛋白的病毒的选择步骤和基因构象(Constellation)的证实是麻烦和耗时的工作。尽管RNP转染系统(Luytjes等，Cell 1989，59：1107)降低了后代病毒的可能数量，仍需要一个好的选择方法。
鼻内给予减毒活流感病毒疫苗诱导局部、粘膜、细胞介导和体液免疫反应。看来含减毒活流感甲型/Ann Arbor/6/60(H2N2)或乙型/Ann Arbor/1/66的六个内部基因，和同期野生型流感病毒的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的冷适应(ca)重配(CR)病毒被可靠减毒。该疫苗看来对儿童和年轻成人有效。然而，它可能过度减毒而不能刺激过中年的人引起理想的免疫反应，在美国每年有20,000-40,000个个体的大群体由于流感感染而死亡。尽管已经报道了ca病毒内部基因的序列，仍未很好确定每个节段对减毒表型的贡献。只有通过将特定的确定的减毒突变循序导入病毒中才可获得这个信息。尽管RNP转染方法允许将突变导入流感的基因组中，但需要选择系统和体外重建病毒RNPs的技术困难限制了使用内部基因操作。
因此，本领域需要发展重组流感疫苗，它避免使用辅助病毒，在培养物(卵或细胞培养物)中生长良好，可靠地允许发展可增殖用于新疫苗开发的重配病毒，并提供系统突变来发展减毒活病毒株用于鼻内疫苗接种。本发明满足了本领域的这些和其它需要。
发明概述
本发明有利地提供了含RNA聚合酶I(pol I)启动子和pol I终止子序列的表达质粒，所述序列插在RNA聚合酶II(pol II)启动子和多腺苷酸化信号之间。表达质粒这里称作pol I-pol II系统，双启动子表达系统或双启动子表达质粒。这种质粒最好含有插在pol I启动子和终止信号之间的RNA病毒基因节段。优选，RNA病毒是流感病毒(如甲型流感或乙型流感病毒)。
本发明包括用于从克隆基因或cDNA产生感染性RNA病毒的基于质粒的两个系统。在一个系统(双向系统)中，基因或cDNA位于上游pol II启动子和下游pol I启动子之间。从pol II启动子转录基因或cDNA产生带帽的正义病毒mRNA，从pol I启动子转录产生负义不带帽的vRNA。在另一系统(单向系统)中，基因或cDNA位于pol I和pol II启动子的下游。pol II启动子产生带帽的正义病毒mRNA，polI启动子产生不带帽正义病毒cRNA。
本发明基于最少质粒的系统允许从克隆的病毒cDNA产生感染性RNA病毒。这种系统包括一组质粒，其中每个质粒包含一个RNA病毒的自主(autonomous)病毒基因组节段。在每个质粒中，病毒cDNA，相当于自主病毒基因组节段，被插在RNA聚合酶I(pol I)启动子和终止子序列之间，由此导致vRNA表达，它反过来又插在RNA聚合酶II(pol II)启动子和多腺苷酸化信号之间，由此导致病毒mRNA表达。因此，这个系统采用双向质粒技术，并允许有效重配产生在很好地适应于细胞培养中生长的背景株中或来自减毒株的对应于当前传播的致病株的RNA病毒(如就流感NA和HA基因而言)，优选病毒是甲型流感病毒或乙型流感病毒。
本发明提供了包含该基于质粒的系统的宿主细胞用于产生感染性病毒粒体，和产生RNA病毒病毒粒体的方法，该方法包括在允许产生病毒蛋白和vRNA的条件下培养该宿主细胞。
该基于质粒的系统，宿主细胞和产生病毒粒体的方法特别适合制备RNA病毒特异性疫苗。这种方法包括纯化病毒粒体。纯化的病毒粒体能被灭活或可被减毒。本发明的疫苗可用于接种对抗RNA病毒感染。例如，可肌肉内注射给予保护剂量的含灭活病毒粒体的疫苗。可供选择地，可将保护剂量的含减毒病毒粒体的疫苗鼻内给予受试者。
本发明进一步提供了重配病毒病毒粒体，和含这种病毒粒体(包括灭活和减毒病毒粒体)的疫苗组合物。
在另一个有利实施方案中，本发明提供了产生减毒RNA病毒的方法。这个方法包括使基于质粒的系统中一个或多个病毒基因突变，然后确定该系统制备的感染性RNA病毒是否被减毒。这种减毒可用于开发鼻内疫苗，包括效能增强可在对当前减毒疫苗无反应性的老年人或其它人群中引起保护性免疫的鼻内疫苗。

附图简述

BGH)相连接。八个表达质粒转染后，合成两种类型的分子。从人pol I启动子，细胞内pol I合成了负义vRNA。合成的vRNA在5’和3’末端含有非编码区。由pol II的转录物产生含5’帽结构和3’聚A尾巴的mRNAs；这些mRNAs翻译为病毒蛋白。病毒cDNA的ATG是pol II转录起始位点下游的第一个ATG。
图2：产生甲型流感病毒的八个质粒pol I-pol II系统。含插在人pol I启动子和pol II启动子之间的八个病毒cDNAs的八个表达质粒(见图1)转染真核细胞。因为每个质粒含有两种不同的启动子，细胞的pol I和pol II都会转录质粒模板，推测在不同的核隔室内，导致病毒mRNAs和vRNAs合成。合成病毒聚合酶符合蛋白(PB1，PB2，PA，NP)后，病毒复制循环启动。最终，直接(pol II转录)或间接(pol I转录和病毒复制)源自细胞转录和翻译装置的所有病毒分子的装配导致所有合成的分子(vRNPs和结构蛋白HA，NA，M1，M2，NS2/NEP)间的相互作用而产生感染性甲型流感病毒。
图3A至3D：开发用于构建和转染八个表达质粒以回收A/Teal/HK/W312/97(H6N1)的方法的略图表示。A.从病毒颗粒中提取病毒RNA。用含节段特异性核苷酸和IIs型限制性核酸内切酶BsmBI或BsaI的序列的引物进行RT-PCR。B.用BsmBI或BsaI消化八个病毒PCR节段并插入pHW2000(用BsmBI线性化)。这个插入产生八个表达构建体，其中病毒cDNAs与pol I启动子和终止子(空矩形中的病毒末端序列AGC...ACT表示PB2节段)精确融合。C.含pol I启动子和pol II启动子的八个表达质粒含有每个八个节段的病毒cDNAs的一个拷贝。10个病毒蛋白的开放阅读框架侧翼与节段特异性非编码区(灰框)相连接。D.因为使用的人pol I启动子仅在源自人或相关物种的细胞系中表现出高活性，所以人293T细胞与用于甲型流感病毒的标准细胞系(MDCK-细胞)一起共同培养。转染后293T细胞中产生的病毒可接着感染MDCK细胞和复制。
图4A和图4B：RT-PCR描述回收病毒的特性。A.MDCK细胞上转染细胞上清传代两次(见表1和2)后，从病毒颗粒中提取RNA。用NS基因节段特异性引物和从病毒粒体中提取的vRNA进行RT-PCR。使用的NS引物不是株特异性的；因此，允许扩增任何甲型流感病毒NS节段。反应产物在2％琼脂糖凝胶上电泳。为了确保扩增的DNA片段源自vRNA，不是来自从转染细胞中带出的质粒DNA，执行一个不加入反转录酶(RT)(-)的反应。泳道1和2，重组A/Teal/HK/W312/97(表1)；泳道3和4，M重配(表2)；泳道5和6，NS重配(表2)；泳道7和8，重组A/WSN/33病毒(表1)；泳道9和10，四倍重配(表2)。B.A中所示片段的NcoI消化。也用扩增产物的序列分析证实NS节段的同一(未显示)。
图5：单向RNA pol I-pol II转录系统。在单向pol I-pol II转录系统中，病毒cDNA以正义方向插在人pol I启动子(p_Ih)和终止子序列(t_I)之间。这个完整pol I转录单位侧翼与pol II启动子(pIICMV：人巨细胞病毒的立早启动子)和编码牛生长激素的基因的聚腺苷酸位点(aIIbgh)连接。转染后，期望合成两种类型的RNA转录物。pol I合成了在其5’末端带三磷酸基的正义cRNA，pol II合成了带5’帽结构和在其3’末端带聚(A)尾巴的正义mRNA。mRNA的两个元件是有效翻译所需的。
图6：含串联排列的pol I和pol II启动子的克隆载体pHW11。该质粒含有225bp的人RNA pol I启动子(pIh)和33bp的小鼠终止子(tI)。pol I启动子和终止子序列侧翼与人巨细胞病毒的RNA聚合酶II启动子和编码牛生长激素的多腺苷酸化信号(aIIBGH)连接。为了病毒cDNA插入在pol I启动子和终止子之间，引入两个BsmBI限制性位点(下划线表示)。用BsmBI消化载体产生带有粘性但不是互补突出末端的载体片段。这个载体的设计允许病毒cDNA与pol I启动子和终止子序列以正义方向精确融合。对于大肠杆菌中的繁殖，质粒具有复制起点(ori)，为了在含氨苄西林的培养基中的选择，质粒含有β内酰胺酶基因(bla)。
图7A和7B：用于产生感染性RNA病毒的双启动子系统。由于RNA病毒功能如同细胞寄生虫，它们必须优化用宿主细胞表达其遗传信息的策略。所有RNA病毒必须合成能够被翻译为蛋白的mRNAs。通常，复制，转录和产生新的后代病毒颗粒需要合成的蛋白。对于基因组RNAs的有效复制，应该制备带精确5’和3’末端的RNA转录物。
本系统包括外部和内部转录单位。内部转录单位包括启动子(p(+RNA)或p(-RNA))，优选pol I启动子。RNA病毒的cDNAs由侧翼与非编码区(NCR)相连的一个或多个开放阅读框架(ORF)组成。优选，没有序列插在病毒cDNA和启动子之间。缺乏插入序列很重要，因为基因组vRNA的5’和3’末端通常含有转录和复制所需病毒蛋白识别的序列；额外的非病毒序列典型地防碍病毒蛋白对vRNA的有效识别和复制。缺乏插入序列允许转录的(-)链RNA(A)或(+)链RNA(B)可被病毒聚合酶蛋白有效使用。外部转录单位具有启动子(p(mRNA))，优选指导从cDNA转录mRNA的pol II启动子；mRNA包括翻译起始和病毒蛋白产生所需的5’序列(如甲基G帽)和3’序列(如聚A尾巴)。由于翻译过程可以忍受外部转录单位的启动子和病毒cDNA间的额外序列，因此内部转录单位的插入序列的存在不显著妨碍mRNA翻译。
这个系统可以修改和改善用于除了流感病毒之外的RNA病毒，方式是通过在内部转录单位中使用不同的启动子(如pol II，pol m，T3，SP6，T7或用于DNA依赖性RNA聚合酶的任何其它启动子)和细胞内合成带正确5’和3’末端的病毒RNA的终止元件或核酶(在下讨论)。可使用锤头核酶或δ肝炎病毒(HDV)核酶产生带精确末端的病毒RNA(Schnell等，EMBO J.1994，13：4195；Pleschka等，J.Virol.1996，70：4188；Herold，J.等，J.Virol 2000，74(14)：6394-400)。
外部转录单位可以包含pol I或I I启动子，T7 RNA聚合酶启动子，T3 RNA聚合酶启动子，SP6 RNA聚合酶启动子，或任何其它DNA依赖性RNA聚合酶的启动子。如果外部转录单位中的启动子指导缺乏甲基G帽的转录物的合成，那么内部核糖体进入位点(IRES)可位于cDNA编码序列的5’末端以利于翻译起始(在下讨论)。
值得注意的是载体pHW2000在CMV启动子和终止位点之间具有T7启动子。pol II转录物在核内合成，而T7转录物在表达T7 RNA聚合酶的细胞的细胞质中合成。因此，由外部转录单位的一个以上启动子起始的转录物可产生得到不同的mRNAs。因此，源自pHW2000的表达质粒允许快速估计pol II或T7启动子或二者组合是否是具有内部核糖体进入位点(IRES)的正链病毒mRNA合成最佳的。
图8：产生(+)链RNA病毒的双启动子系统。本发明也可以调整以产生含正链、单分子基因组的病毒，如丙型肝炎病毒。在这个实施方案中，含丙型肝炎病毒基因组的cDNA插入允许cDNA在细胞内有效转录为mRNA和全长负RNA(双向方法)或mRNA和全长正RNA(单向方法)的构建体中。cDNA由侧翼与非编码区(NCR)相连的一个开放阅读框架(ORF)组成。在图中，显示了含双向系统的表达质粒。全长cDNA插在pol I(pI)启动子和终止序列(tI)之间，转染后引起全长(-)链RNA合成。
内部转录单位侧翼与具有驱动mRNA合成的启动子(p(mRNA))的外部转录单位连接。优选，这个启动子是pol II启动子。然而，如果合成的RNA具有内部核糖体进入位点(IRES)，那么可以用pol I，pol III，SP6，T7或T3启动子(使用T3或T7启动子需要T3或T7聚合酶蛋白通过编码该聚合酶的质粒共转染或使用表达该聚合酶的稳定细胞系而表达)替换pol II启动子。在外部转录单位的3’末端，多聚A信号或插入的多聚A序列用于提供合成的mRNA的多聚A尾巴。
所得mRNA翻译为大的多蛋白前体，它被在翻译同时和翻译后切割产生各个结构和非结构病毒蛋白。
非结构蛋白NS5a和NS5b，是RNA依赖性RNA聚合酶蛋白，它们使用内部转录单位合成的(-)RNA作为模板启动病毒复制/转录循环。因此，产生了用于翻译为蛋白的(+)RNA/mRNA。最终产生了含(+)RNA和病毒结构蛋白的感染性病毒。
图9：产生人副流感病毒III的pol I-pol II系统。本发明也可用于产生含负链单分子RNA基因组的副流感病毒III。病毒cDNA可以按正义或反义方向插入pol I-polII系统中。图中显示了单向系统。polI启动子指导cRNA合成，pol II启动子指导mRNA合成。在这个实施方案中，pol II启动子产生多顺反子mRNA，第一个开放阅读框架由它有效翻译为核壳(NP)蛋白。这个蛋白是复制所需的。在分开的表达质粒中制备编码L和P蛋白的质粒并共转染，该蛋白也是复制和转录中重要的(但不能从多顺反子mRNA有效翻译)。与Durbin，A.P.等，Virology 1997，235(2)：323-332开发的反向遗传学系统相比，polI-pol II系统具有几个优点。通过从同一cDNA表达NP，这个最小的质粒系统仅需要构建和转染三个而不是四个质粒来完全从克隆cDNA中产生人副流感病毒III。不象反向遗传系统基于从T7启动子进行体内转录，pol I-pol II系统完全由每个细胞中发现的真核DNA依赖性RNA聚合酶驱动。而且，驱动T7 RNA聚合酶表达的痘苗病毒感染需要使用痘苗病毒许可的而不是对人副流感病毒生长最佳的细胞，因此限制了这个方法产生感染性病毒的实用性。痘苗病毒严重的细胞病变作用和使用感染性物质所需的安全预防措施是这个系统不期望的特征。使用pol I-pol II系统消除了病毒感染的必要并允许使用LLC-MK2细胞进行人副流感病毒III的转染和生长，因此提供了更简单更安全方法产生减毒病毒的技术。
图10：从克隆cDNA产生轮状病毒的基于质粒的系统。这个系统可用于产生含节段化的双链RNA基因组的病毒(如轮状病毒)。它可应用于，例如呼肠孤病毒科(Reoviridae)(10，11，12dsRNA节段)或双RNA病毒科(Birnaviridae)(2dsRNA节段)成员的病毒。迄今为止，对于呼肠孤病毒科的病毒，得不到反向遗传系统。这幅图阐明了使用本发明的方法可如何产生具有11个dsRNA节段的轮状病毒，但对环状病毒(10dsRNA节段)或正呼肠孤病毒(Orthoreoviruses)(12dsRNA节段)属成员可采用相似的系统。
下列讨论阐明了完全从克隆cDNA产生轮状病毒A/SA11。已经确定了猿轮状病毒双链RNA基因组的全部11个节段。基因组中dsRNAs长度从3302bp至663bp，完整基因组的大小是18,550bp。依照PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析的迁移率增加的顺序，将基因组节段编号为1-11。节段完全碱基配对，正义链含有5’末端帽结构(m7GpppGmGPy)但在其3’末端附近不含有聚腺苷酸化信号。所有基因组节段共有短的保守性5’和3’末端，在5’末端10个核苷酸一致和在3’末端8个核苷酸一致。紧接在这些末端区内部，在每个基因中，具有节段特异性的至少30-40个核苷酸的第二个保守区。5’非翻译区(NTRs)长度变化但都少于50个核苷酸，且在所有节段中，NTRs在第一个AUG后都跟着至少一个长的开放阅读框架。节段9和11编码两个蛋白。3’-NTRs长度从17nts(节段1)至182nts(节段10)变化。
将轮状病毒cDNA克隆至双启动子系统，优选pol I-pol II系统。所得质粒转染到合适的宿主细胞后，产生了病毒RNAs和蛋白，它导致感染性轮状病毒形成。优选，单向转录系统用于产生轮状病毒。使用这个方法使得细胞内合成在它们的5’末端具有三磷酸的轮状病毒基因组的11个(+)RNA分子。病毒样mRNA的表达导致病毒蛋白表达。病毒蛋白VP3(帽)，具有鸟苷酸转移酶和甲基转移酶活性，催化5’帽结构添加到全部11个轮状病毒(+)RNA(Chen D.，等，Virology1999，265：120-130)中。事实上，以前已经证明了纯化的VP4(帽)，蓝舌病毒(BTV)的轮状病毒VP3(帽)类似物，可在体外将帽结构加到病毒样(+)RNA中(Ramadevi N.，等Proc Natl Acad Sci U S A.1998，95(23)：13537-42)。期望体内cDNA转录和细胞内表达VP3(帽)蛋白，导致全部11个轮状病毒基因组节段的带帽RNA产生。那些mRNAs翻译为病毒蛋白或被包装成precore-RI。VP6(T13)-RI颗粒形成后，正义mRNA用作合成(-)RNA的模板。最终，在形态形成过程中添加VP4和VP7产生感染性后代病毒粒体。
由于复制和形态形成有效起始可能依赖于每个病毒蛋白的最佳浓度，故产生分开的质粒进行RNA合成和蛋白表达可能是有利的。然而，改变宿主细胞中质粒的数量或对mRNA合成使用不同的启动子可优化蛋白表达水平，所以对于一个节段使用两个质粒可能对大多数基因不是必需的。由于(+)RNA是从(-)RNA合成的，(-)RNA和蛋白的细胞内表达可能导致复制有效单位产生，它产生病毒mRNA。因此，双启动子系统允许建立含质粒数量比当RNA和蛋白表达质粒在分开的质粒上时所需的22个显著减少的最少质粒系统。可以用用于产生甲型流感病毒的相似方式产生轮状病毒。
图11A-D：RNA病毒基因组的复制和mRNA合成。
(A)在(-)链病毒感染过程中，病毒聚合酶蛋白合成mRNAs：
节段化RNA病毒的一个和两个mRNAs或含单分子基因组的病毒的多个mRNAs。抗终止机制导致全长(+)链合成，它可复制成(-)基因RNA中。
(B)复制双义RNA病毒的节段化基因组形成一个mRNA；从互补物合成第二个RNA。
(C)在双链RNA病毒感染的细胞中，首次合成的mRNAs可翻译为蛋白或用作合成(-)链合成的模板，产生双链基因组RNA。
(D)对于(+)链病毒，基因组RNA也是mRNA并复制成可拷贝成(+)基因组RNA的(-)链RNA。一些(+)RNA病毒的mRNAs不含有多聚A尾巴。在有些家族，产生一个或多个亚基因组RNAs。
发明详述
所有RNA病毒的生活史包括RNA合成和在蛋白合成后病毒颗粒的装配；这些功能提供了可用于从克隆cDNA产生RNA病毒的本发明反向遗传学系统的概念框架。本发明通过建立产生负链节段化病毒(如甲型流感病毒、乙型流感病毒，Bunyaviridae)、非节段化负链RNA病毒(如副粘病毒科(Paramyxoviridae)，Mononegavirales)、双链RNA病毒(如呼肠孤病毒科，双RNA病毒科(Birnaviridae))和正链RNA病毒(如黄病毒科(Flaviviridae)，小RNA病毒科(Picornaviridae)，冠形病毒科(Coronaviridae)，披膜病毒科(Togaviridae))的双启动子系统简化和改善了当前已有反向遗传学系统。因为本发明的系统使用单一病毒cDNA进行蛋白合成和基因组RNA合成，所以这个系统降低了病毒生产所需质粒的数量并允许快速和廉价地开发疫苗。
如果要使用本发明生产含节段化RNA基因组的病毒，那么将相当于靶基因组中每个基因的病毒cDNA插入本发明的表达质粒中。本发明包括基于双向质粒的表达系统和基于单向质粒的表达系统，其中病毒cDNA插在RNA聚合酶I(pol I)启动子和终止子序列(内部转录单位)之间。这个完整的pol I转录单位侧翼与RNA聚合酶II(pol II)启动子和聚腺苷酸位点(外部转录单位)相连。在单向系统中，pol I和pol II启动子在cDNA上游并产生正义不带帽cRNA(由pol I启动子)和正义带帽mRNA(由pol II启动子)。单向系统中的pol I启动子，pol I终止序列，pol II启动子和多腺苷酸化信号可以称作含有“上游至下游方向”。在双向系统中，pol I和pol II启动子在cDNA的相反两侧，其中上游pol II启动子产生正义带帽mRNA，下游pol I启动子产生负义不带帽病毒RNA(vRNA)。这些pol I-pol II系统以两个细胞RNA聚合酶由它们自己的启动子启动转录而开始，推测在核的不同隔室。双向系统中的pol I启动子和pol I终止序列可以称作包含“下游至上游方向”，双向系统中的pol II启动子和多腺苷酸化信号可以称作包含“上游至下游方向”。
如果靶病毒包含正链、节段化RNA基因组，pol I启动子优选在内部转录单位中位于cDNA的上游(单向系统)。在这个实施方案中，产生正链RNA直接掺入新的病毒中。然而，其中使用单向系统产生含负链、节段化RNA基因组的靶病毒的实施方案在本发明的范围内。
如果靶病毒包含负链、节段化RNA基因组，pol I启动子优选在内部转录单位中位于cDNA的下游(双向系统)。在这个实施方案中，产生负链RNA直接掺入新的病毒中。其中用双向系统产生含正链、节段化RNA基因组的靶病毒在本发明的范围内。
本发明也可以用于产生含感染性或非感染性非节段化的RNA基因组(单链或双链)的病毒。通常，感染性病毒基因组RNA简单导入宿主细胞足以引起病毒生活史在细胞内启动和完整病毒的最终产生。例如，微小RNA病毒基因组RNA简单导入宿主细胞足以引起完整微小RNA病毒产生。含非感染性基因组RNA的病毒生活史的启动，典型地，需要另外导入通常在病毒颗粒中与基因组一起携带的其它病毒蛋白。例如，副流感病毒III携带RNA依赖性RNA聚合酶，它的存在是新感染细胞内启动病毒基因组RNA复制和病毒mRNAs转录所需的；在聚合酶缺乏时，副流感病毒III基因组RNA是没有感染性的。在本发明的其中产生含感染性、非节段化基因组RNAs的病毒的实施方案中，携带包括病毒基因组的核酸的本发明的双表达质粒简单导入合适的宿主细胞足以引起完整病毒产生。在其中产生含非感染性的非节段化基因组RNA的病毒的实施方案中，可能也不得不将另外的表达质粒与携带病毒基因组的双表达质粒一起导入宿主细胞。另外的质粒应该表达启动病毒生活史所需的蛋白，它们常常在感染时导入宿主细胞(如RNA依赖性RNA聚合酶)。
在其中产生含感染性、非节段化RNA基因组的微小RNA病毒的实施方案中，含完整病毒基因组的cDNA插入到本发明双启动子表达质粒中。外部转录单位中的上游启动子，优选pol II启动子，指导含完整病毒基因组的正链mRNA产生-从mRNA翻译多蛋白并从多蛋白切割和释放各个蛋白(如在多蛋白内用蛋白酶)。由于病毒基因组包含正链RNA，内部转录单位(单向系统)中第二个上游启动子，优选pol I，指导基因组正链拷贝产生。如果病毒基因组包含负链RNA，在内部转录单位中(双向系统)的第二个下游启动子，优选pol I，将指导基因组的负链拷贝的产生。其中使用单向系统产生负链、非节段RNA病毒的实施方案在本发明的范围内。类似地，其中使用双向系统产生了正链、非节段化RNA病毒的实施方案在本发明的范围内。
用本发明也可产生含非感染性、其中不产生多蛋白的非节段化RNA基因组的病毒。例如，本发明可以用于产生弹状病毒科(rhabdoviridae)病毒或副粘病毒科(paramyxoviridae)病毒，优选副流感病毒III，它的生活史正常包括用病毒来源的RNA依赖性RNA聚合酶从基因组负链RNA产生多个单顺反子mRNAs；各个蛋白从单顺反子mRNAs表达。在这些实施方案中，含启动子(优选pol II启动子)的外部转录单位指导病毒基因组正链、多顺反子拷贝产生，通常仅仅第一个基因(NP)从中翻译。另外，含启动子优选pol I启动子的内部转录单位指导基因组RNA拷贝表达，以引入新的病毒中。由于副流感病毒III病毒基因组包含负链RNA，内部转录单位的启动子优选位于cDNA下游(双向系统)。如果病毒基因组包含正链RNA，那么内部转录单位的启动子优选位于cDNA上游(单向系统)。其中使用双向系统产生含正链RNA基因组的病毒的实施方案和其中使用单向系统产生含负链RNA基因组的病毒的实施方案在本发明的范围内。另外的病毒蛋白(除了从多顺反子mRNA表达的蛋白)是病毒转录和复制所需的(L和P)，这些蛋白在分开的表达质粒中分别提供。
本发明也包括其中产生含双链、节段化RNA基因组的病毒的实施方案。在这些实施方案中，含靶病毒基因组中每个基因的质粒插入本发明的双启动子表达质粒中。质粒可以是单向质粒或双向质粒。在外部转录单位中的启动子，优选pol II启动子，指导被翻译为所编码蛋白的每个基因的mRNA转录物的表达。在内部转录单位中的启动子，优选pol I启动子，指导正链(单向系统)或负链(双向系统)的转录。之后，产生的第一条链可以作为用病毒RNA聚合酶产生互补链的模板。所得双链RNA产物引入新的病毒中。
从基于最少质粒的系统中回收两个甲型流感病毒-A/WSN/33(H1N1)和A/Teal/HK/W312/97(H6N1)确证了这个系统的实用性。表型不能区分的A/PR/8/34(H1N1)株的回收，它是制备灭活甲型流感病毒疫苗的标准，确证了这个系统用于疫苗开发的有用性。八个表达质粒转染给共培养的293T和MDCK细胞72小时后，转染细胞上清中病毒产率在每毫升2×10⁵和2×10⁷个感染性病毒之间。这个八质粒系统也用于产生A/Teal/HK/W312/97(H6N1)和A/WSN/33(H1N1)之间单一和四倍重配病毒，和从串联定向系统(产生cRNA和mRNA)产生A/WSN/33病毒。
因为pol I-pol II系统利于重组和重配甲型流感病毒的设计和回收，所以它也可适用于完全以克隆cDNA回收其它RNA病毒。尽管优选cDNA用于本发明，如果本发明的主要元件保留，也可以使用编码待表达的病毒基因的其它类型核酸。例如，可以使用含病毒基因的PCR扩增产物或限制性片段。此外，本发明基于质粒的系统中表达的基因可以与其它基因融合或用其它基因标记，如纯化/检测标记(如谷胱苷肽-S-转移酶，聚组氨酸，绿色荧光蛋白，myc标记和FLAG标记)。本发明也预期其中部分基因序列用于本系统质粒的实施方案。
下表包括使用本发明可产生的负链RNA病毒的非限制性列表。

  目  科  亚科  属  模式种  Mononegavirales  Bornaviridae  Bornavirus  博纳病病毒  Mononegavirales  Filoviridae  Ebola样病毒  埃博拉病毒  Mononegavirales  Filoviridae  Marburg样病毒  马尔堡病毒  Mononegavirales  副粘病毒科  Paramyxovirinae  呼吸道病毒  人副流感病毒1  Mononegavirales  副粘病毒科  Paramyxovirinae  Morbillivirus  麻疹病毒  Mononegavirales  副粘病毒科  Paramyxovirinae  Rubulavirus  流行性腮腺炎病毒  Mononegavirales  副粘病毒科  Pneumovirinae  Pneumovirus  人呼吸道合胞病毒  Mononegavirales  副粘病毒科  Pneumovirinae  Metapneumo-Virus  火鸡鼻气管炎病毒  Mononegavirales  Rhabdoviridae  Vesiculovirus  印第安纳水泡性口炎  病毒  Mononegavirales  Rhabdoviridae  Lyssavirus  狂犬病病毒  Mononegavirales  Rhabdoviridae  Ephemerovirus  牛短暂热病毒  Mononegavirales  Rhabdoviridae  Novirhabdovirus  传染性造血组织坏死  病毒  Mononegavirales  Rhabdoviridae  Cytorhabdovirus  莴苣坏死黄化病毒  Mononegavirales  Rhabdoviridae  Nucleorhabdo-Virus  马铃薯黄矮病毒  Mononegavirales  Orthomyxoviridae  (正粘病毒科)  Influenzavirus A  甲型流感病毒  Mononegavirales  Orthomyxoviridae  Influenzavirus B  乙型流感病毒  Mononegavirales  Orthomyxoviridae  Influenzavirus C  丙型流感病毒  Mononegavirales  Orthomyxoviridae  Thogotovirus  Thogoto病毒  Mononegavirales  Bunyaviridae(布  尼亚病毒科)  Bunyavirus  布尼雅病毒  Mononegavirales  Bunyaviridae  Hantavirus  汉坦病毒  Mononegavirales  Bunyaviridae  Nairovirus  内罗毕羊病病毒  Mononegavirales  Bunyaviridae  Phlebovirus  白蛉热病毒属西西里  血清群  Mononegavirales  Bunyaviridae  Tospovirus  番茄斑萎病病毒  Mononegavirales  Bunyaviridae  Tenuivirus  水稻条叶枯病毒  Mononegavirales  Bunyaviridae  Ophiovirus  柑橘鳞皮病病毒  Mononegavirales  Arenaviridae  Arenavirus(沙粒病毒  属)  淋巴细胞性脉络丛脑  膜炎病毒  Mononegavirales  Arenaviridae  Deltavirus  δ肝炎病毒
本发明进一步部分基于双向转录构建体的开发，该构建体含有侧翼为用于vRNA合成的RNA聚合酶I(pol I)启动子和用于病毒mRNA合成的RNA聚合酶II(pol II)启动子的编码PB2，PB1，PA，HA，NP，NA，M或NS的病毒cDNA。pol I/pol II启动子-PB1构建体与剩余七个节段的vRNA-和蛋白-表达构建体一起转染后产生病毒证实这个方法的实用性。因为这个方法降低病毒产生所需的质粒数量，因此它也降低克隆所需工作，增强病毒产生的效率和将反向遗传系统的应用扩大到17个质粒不能实现有效共转染的细胞系。还包括的是含位于病毒cDNA编码序列上游的pol I和pol II启动子的单向转录构建体。两个启动子相对于基因采用共同的上游至下游定位。尽管双向系统产生甲型流感病毒的效价较高，但单向系统在其它应用中有效(如产生其它负链病毒株)。
如果启动子、终止子或多腺苷酸化信号位于基因起始部位(如第一个密码子)的近侧和基因末端(如终止密码子)的远侧，则它是该基因的“上游”。如果启动子、终止子或多腺苷酸化信号位于基因末端的近侧和基因起始部位的远侧，则它是该基因的“下游”。本发明质粒中的启动子，与基因功能关联的，被定位使得促进基因正义或反义链的转录。
这里使用的“表达质粒”是含“内部转录单位”和“外部转录单位”的DNA载体。如上讨论，表达质粒可用于产生任何类型的RNA病毒，优选正或负链RNA病毒、节段化或非节段化基因组RNA病毒或双链RNA病毒。外部转录单位包括启动子，优选pol II启动子，它指导从病毒cDNA转录可翻译的mRNA。外部转录单位可以包括T7 RNA聚合酶启动子，T3 RNA聚合酶启动子，SP6 RNA聚合酶启动子或能够驱动可翻译RNA产物表达的任何启动子或基因元件的组合。例如，如果待从质粒表达的病毒cDNA被基因工程改造在转录RNA的3’末端包括多腺苷酸化信号，外部转录单位可以包括pol I或pol II启动子。这可以通过在cDNA编码序列3’末端就在终止密码子之前，插入A核苷酸串来完成。此外，可基因工程改造使病毒cDNA在cDNA 5’末端包括内部核糖体进入位点(IRES)，利于从转录RNA启动翻译。本发明表达质粒中的“内部转录单位”位于外部转录单位之内且包括启动子，优选pol I启动子，它可指导可被病毒装置复制并引入新病毒中的病毒cDNA转录。优选内部转录单位中的启动子转录在5’和3’末端不含过多非病毒的外来序列的RNA，优选通过病毒cDNA与pol I启动子和终止序列精确融合来实现。然而，本发明包括这样的实施方案，其中内部转录单位包括指导含5’和3’另外非病毒序列的RNA转录物产生的启动子(如pol II启动子、pol III启动子、T7 RNA聚合酶启动子、T3 RNA聚合酶启动子或SP6 RNA聚合酶启动子)。在这些实施方案中，在表达质粒中可以包括确保由内部转录单位产生的RNA不包括过多非病毒序列的另外序列。例如，可以基因工程改造表达质粒使其在由内部转录单位产生的转录物末端包括核酶序列，其中转录RNA的核酶部分以这样的方式切割转录物，即产生RNAs 5’和3’末端序列如同在病毒RNA中发现的。此外，可以基因工程改造表达质粒使其在病毒cDNA编码序列末端包括引起转录终止的终止子序列，因此防止转录RNA的3’末端引入过多不可翻译序列。优选，“表达质粒”是使用pol I-pol II系统的DNA载体。因此，这种质粒包含RNA聚合酶I(pol I)启动子和pol I终止子序列，它们插在RNA聚合酶II(pol II)启动子和多腺苷酸化信号之间。在双向系统中，RNA聚合酶I启动子调控插在启动子和终止子之间“反义”方向的cDNA的基因组负义不带帽RNA(这里称作“v RNA”)的表达。RNA聚合酶II启动子调控信使RNA的表达；“正义”方向插在pol II启动子和多腺苷酸化信号之间的病毒基因cDNA节段引起正义带帽病毒mRNA的表达。在单向系统中，病毒cDNA以正义方向插在pol I和pol II启动子的下游。pol II启动子驱动正义带帽病毒mRNA的表达，pol I启动子驱动正义不带帽病毒cRNA的表达。
如果存在另一个基本质粒的所有基因和功能性非编码区，质粒可以包括基本质粒的“基本上全部”。例如，仅仅去除了一部分聚接头和插入外来基因而构建的质粒包含基本质粒的基本上全部。
“负链RNA病毒”是其中病毒基因组包括负链RNA的病毒。负链RNA与mRNA互补，且通常，应该拷贝为待翻译蛋白的互补正链m RNA。典型地，这些病毒包装一个RNA依赖性RNA聚合酶用于在宿主细胞转染时产生mRNA。负链RNA病毒科包括但不限于，正粘病毒科，Arenaviridae和Bunyaviridae。优选，病毒基因组来自正粘病毒科的一个成员的病毒，最好具有节段化基因组。正粘病毒科的成员包括但不限于甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、Thogotovirus、麻疹和流行性腮腺炎病毒(Paramyxovirus)或狂犬病病毒(Rhabdovirus)。
“正链RNA病毒”是含正链RNA基因组的病毒。正链RNA病毒的例子包括脊髓灰质炎病毒(微小RNA病毒)、披膜病毒和黄病毒。这些病毒的基因组RNA与mRNA的意义相同并可充当mRNA。这些病毒可以包括节段化或非节段化的基因组。
“双链RNA病毒”包括双链RNA基因组。呼肠孤病毒是双链RNA病毒。
病毒基因组也可以节段化或非节段化(单分子)。节段化基因组包括每个编码一个或多个病毒基因的两个或更多核酸。优选，节段化基因组包括每个病毒基因的分离的核酸。正粘病毒(甲、乙或丙型流感病毒)，Bunyaviruses和沙粒病毒包含节段化RNA基因组。非节段化基因组包括含每个病毒基因的单个核酸。Mononegavirales病毒，弹状病毒，Flaviviridae(黄病毒科)病毒，小RNA病毒科(Picornaviridae)病毒，Coronaviridea病毒，披膜病毒科(Togaviridae)病毒和副粘病毒包含非节段化的RNA基因组。
双链RNA可以缩写为“dsRNA”。单链RNA可以缩写为“ssRnA”。单一负链RNA可以缩写为“-ssRNA”。单一正链RNA可以缩写为“+ssRNA”。
“病毒基因节段“优选是相当于来自RNA病毒基因组的基因组RNA分子的克隆cDNA。这个术语也可以包括含源自RNA病毒的基因的任何基因或基因节段(如PCR产物或限制性片段)。
“基于最少质粒的系统”是这样一个系统，其中具有如上所述的含来自RNA病毒的每个自主病毒基因组节段的表达质粒。因此，含病毒基因组序列的质粒总数量不会超过来自来源RNA病毒的基因节段的总数量。本发明包括这样的实施方案，其中不含病毒序列的其它质粒也可任选地共转染宿主细胞。这提供了显著的优点，限制在宿主细胞中建立系统所需的质粒总数量，消除了辅助病毒的需要，消除了选择方法的需要，和允许重配病毒的有效产生。
在本发明的基于最少质粒的系统中的某些病毒基因可以来自能很好适应在细胞培养中生长的病毒株，如PR/8/34(H1N1)或WSN/33(H1N1)株，或来自减毒株，如A/Ann Arbor/6/60(H2N2)，或乙型流感病毒/Ann Arbor/1/66。优选，减毒株也能很好适应在细胞培养中生长。特别是，对于甲型流感病毒，在基于质粒的系统中的优选的病毒基因节段编码病毒聚合酶复合体蛋白，M蛋白，和/或NS蛋白，它们来自能很好适应在细胞培养中生长的病毒株或来自减毒株，或二者皆有。这些蛋白这里术语称作“病毒内部蛋白”或病毒“非糖蛋白”。
甲型流感病毒基因组典型地编码10个不同的蛋白：PB2，据信是转录酶；PB1，据信是转录酶；据信是转录酶的PA；据信是血凝素的HA；NP，据信是RNA结合核蛋白；据信是神经氨酸酶的NA；据信分别是基质蛋白和整合膜蛋白的M1/M2，和据信是可影响RNA加工和转运的非结构蛋白的NS1/NS2。据信PB1、PB2、NP和PA是流感病毒转录聚合酶复合体的一部分。
这里使用的术语“细胞培养”优选是指商业上可接受的增殖用于制备疫苗的病毒的方法，如含胚鸡卵，以及体外在宿主细胞中培养(见Furminger，在：Nicholson，Webster和May(编)，Textbook ofInfluenza，24章，324-332页，特别是328-329页)。
类似地，基于质粒的系统将引入产生保护性免疫反应所需的抗原基因节段。“保护性免疫反应”包括有效清除免疫过的(接种过的)受试者中的病毒粒体和感染细胞的体液(抗体)或细胞成分，或二者皆有。因此，保护性免疫反应可防止或溶解RNA病毒感染，如流感病毒。优选，抗原是“表面抗原”，即在病毒粒体表面或感染细胞的表面表达的。更优选，表面抗原是糖蛋白。对于流感病毒，主要的糖蛋白抗原是血凝素(HA或H)和神经氨酸酶(NA或N)。
这里使用的术语“免疫原性的”是指能够引起体液或细胞免疫反应，优选二者皆能的多肽。免疫原性实体也是抗原性的。免疫原性组合物是当给予动物时引起免疫或体液反应或二者皆有的组合物。当分子能够特异性与免疫系统的抗原识别分子如免疫球蛋白(抗体)或T细胞抗原受体相互作用时，分子是“抗原性的”。抗原性多肽含有至少大约五个，和优选至少大约10个氨基酸的表位。多肽的抗原性部位，这里也叫做表位，可以是对抗体或T细胞受体识别的优势免疫的那部分，或可以是通过将抗原性部分与载体多肽结合进行免疫用于产生针对该分子的抗体的部分。抗原性的分子不需要其本身是免疫原性的，即无载体时能够引起免疫反应。
这里使用的术语“致病性病毒株”是指能够引起疾病的任何病毒株；优选该病毒在当前世界卫生组织(WHO)，疾病控制和预防中心(CDC)或其它公共卫生当局的可能传播病毒列表中。这种病毒可以包括肝炎病毒科、呼肠孤病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、线状病毒科、bornaviridae科、bunyaviridae科、沙粒病毒科、冠形病毒科(coronaviridae)、脊髓灰质炎病毒科或狂犬病病毒科的成员。本发明有利地便于将来自这种株的主要抗原基因插入基于质粒的系统，其中剩余病毒基因具有期望的培养和/和减毒特性，因此可以制备大量用于制备疫苗的合适抗原背景的病毒。例如，副粘病毒人副流感病毒3基因(核壳基因、磷蛋白基因、基质基因、融合基因、血凝素-神经氨酸酶蛋白基因和大基因)，可方便地位于本发明的质粒中用于副流感病毒3病毒粒体的制备。
因此，本发明优选的“重配病毒”是编码来自致病性病毒株的抗原蛋白的基因节段与来自适合在培养中生长的病毒(或减毒病毒)的编码病毒聚合酶复合体的基因节段或其它相似基因(如非糖蛋白基因，包括M基因和NS基因)结合的病毒。重配病毒因此在允许在宿主细胞中有效生产的背景中携带期望的抗原特性，如上所述。这种重配病毒是期望的制备病毒粒体生产疫苗的“病毒种子”(见Furminger，前述)。
术语“宿主细胞”是指以任何方式被选择、修饰、转化、生长或使用或操作，用于由该细胞产生重组RNA病毒粒体，优选负链节段化RNA病毒粒体的任何生物体的任何细胞。示例的宿主细胞包括但不限于，Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞，VERO细胞，CV1细胞，COS-1和COS-7细胞，和BHK-1细胞，举例且不以限制的方式。在具体的实施方案中，优选短暂共培养生产病毒粒体。共培养允许接受细胞如293T细胞的有效转染以及病毒生长许可的细胞如MDCK细胞随后感染。
术语“RNA病毒粒体”是指病毒颗粒，从用本发明基于质粒的系统转染或共转染的宿主细胞产生，其初次产生时是完全感染性的。这种系统产生vRNA和病毒蛋白(由病毒mRNA翻译而来)，导致感染性病毒颗粒(病毒粒体)装配。
这里使用的“RNA病毒特异性疫苗”是当给予受试者时，可引起对RNA病毒的保护性免疫的组合物。术语“疫苗”是指含病毒、灭活病毒、减毒病毒、断裂病毒(split virus)或病毒蛋白即表面抗原的组合物，可用于引起受体保护性免疫(见Furninger，前述)。应该指出作为有效疫苗，本发明的疫苗可引起部分人群的免疫，因为一些个体可能不能引发强烈或保护性免疫反应，或一些情况下，没有任何免疫反应。这种无能可能源自个体的遗传背景或由于免疫缺陷疾病(获得性或先天性)或免疫抑制(如用免疫抑制药物治疗以预防器官排斥或抑制自身免疫情况)。在动物模型中可确立功效。
疫苗的“保护性剂量”是单独或与佐剂联合，有效引起接纳受试者的保护性免疫反应的量。保护也可依赖于给药途径，如肌肉内(优选对于灭活的疫苗)或鼻内(优选对于减毒疫苗)。
这里使用的术语“受试者”是指支持RNA病毒感染的动物，包括但不限于，水鸟、鸡、猪和人。特别是，该术语指人。
“佐剂”是加强对免疫原的免疫反应的分子或组合物。当佐剂是药物可接受时，它是“可接受用于人的”，如下定义。佐剂的例子下面提供。
这里使用的术语“分离的”是指引用的材料是从其天然环境如细胞中移出的。因此，分离的生物材料可不含一些或全部细胞成分，即天然材料自然存在的细胞的成分(如细胞质或膜成分)。如果材料存在于细胞提取物或上清中，应该认为是分离的。在核酸分子的情况下，分离的核酸包括PCR产物，分离的mRNA，cDNA，或限制性片段。在另一个实施方案中，优选分离的核酸是从可发现它的染色体上切割下来的，更优选不再结合或接近当在染色体中发现时位于分离的核酸分子所含基因的上游或下游的非编码区(但可能与其天然调控区或其一部分结合)，或其它基因。在另一个实施方案中，分离的核酸缺乏一个或多个内含子。分离的核酸分子包括插入到质粒、粘粒、人工染色体等等中的序列，即，当它形成嵌合重组核酸构建体的一部分时。因此，在具体的实施方案中，重组核酸是分离的核酸。分离的蛋白可以与其在细胞内结合的其它蛋白或核酸，或二者结合，或与细胞膜结合，如果它是膜关联蛋白。分离的细胞器、细胞或组织是从其在生物体中发现的解剖学部位中移出的。分离的材料可以但不必需是纯化的。
这里使用的术语“纯化”是指在减少或清除无关材料，即污染物，包括从中获得该材料的天然材料，存在的条件下已经分离的材料。例如，优选纯化的病毒粒体基本不含宿主细胞或培养成分，包括组织培养或卵蛋白，非特异性病原体等等。这里使用的术语“基本不含”在该材料的分析测试中可操作使用。优选，基本不含污染物的纯化材料是至少50％纯度；更优选，至少90％纯度，和仍更优选至少99％纯度。可用层析、凝胶电泳、免疫试验、组成分析、生物试验和其它本领域已知的方法估计纯度。
纯化方法是本领域熟知的。病毒颗粒可用超滤或超速离心，优选连续离心(见Furminger，前述)来纯化。其它纯化方法在这里是可能的和包含的。纯化材料可以含有小于大约50％，优选小于大约75％，和最优选小于大约90％的与其最初结合的细胞成分、基质、蛋白或其它不期望的成分或杂质(如上下文所需)。术语“基本纯”指使用本领域已知的传统纯化技术可达到的最高纯度。
在具体实施方案中，术语“大约”或“近似”是指在给定值或范围的20％之内，优选10％之内，和更优选5％之内。可供选择地，对于生物学中使用的对数术语，术语“大约”可指在给定值的数量级之内，和优选在该值的数量级的一半之内。
基于质粒的系统的基因工程
根据本发明，可以使用本领域技术范围内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这种技术在文献中有充分解释。见如Sambrook，Fritsch和Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第2版(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(这里称″Sambrook等，1989″)；DNA Cloning：A Practical Approach，第I和II卷(D.N.Glover编1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编1984)；Nucleic Acid Hybridization[B.D.Hames和S.J.Higgins编(1985)]；Transcription And Translation[B.D.Hames和S.J.Higgins，编(1984)]；Animal Cell Culture[R.I.Freshney，编(1986)]；Immobilized Cells And Enzymes[IPL Press，(1986)]；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；F.M.Ausubel等(编)，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons，Inc.(1994)。
这些常规技术用于pol I-pol II质粒系统的制备，病毒基因节段cDNA克隆的分离，将这种DNAs插入质粒，和用本发明的质粒或基于质粒的系统转染细胞。特别是，定点诱变或基因修饰的常规技术允许修饰RNA病毒，优选负链节段化RNA病毒的基因来发展减毒病毒，如下所述；或掺入了新表位的病毒蛋白，如在神经氨酸酶茎中；或来产生缺陷型病毒。
这里使用的DNA“扩增”表示使用聚合酶链式反应(PCR)增加DNA序列混合物内特定DNA序列的量。PCR的描述见Saiki等，Science1988，239：487。
“核酸分子”是指磷酸酯聚合形式的核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、或脱氧胞苷；“DNA分子”)，或其任何磷酸酯类似物，如硫代磷酸酯或硫酯，以单链形式，或双链螺旋。“重组DNA分子”是经历了分子生物学操作的DNA分子。
“多核苷酸”或“核苷酸序列”是DNA和RNA中一系列核苷酸碱基(也叫做“核苷酸”)，是指两条或更多核苷酸的任何链。核苷酸序列典型地携带遗传信息，包括细胞装置制备蛋白使用的信息。
这里，多核苷酸可以侧翼与异源序列相连，包括启动子、内部核糖体进入位点(IRES；Ghattas，等，Mol.Cell.Biol.11：5848-5859，1991)和其它核供体结合位点序列、增强子、反应元件、抑制子、信号序列、聚腺苷酸序列、内含子、5’和3’非编码区等等。也可以用本领域已知的许多方法修饰该核酸。这种修饰的非限制性例子包括甲基化，“帽”如5’-7-甲基-G(5’)ppp(5’)N帽，用类似物置换一个或多个天然产生的核苷酸，和核苷酸间的修饰。多核苷酸可以含有一个或多个另外的共价连接部分，例如，蛋白(如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)、嵌入剂(如丫啶、补骨脂素等)、螯合剂(如金属、放射性金属、铁、氧化性金属等)，和烷化剂。多核苷酸可以通过形成磷酸三甲基或乙基酯或氨基磷酸烷基酯键而衍生化。此外，这里，也可以用能够直接或间接提供可检测信号的标记修饰多核苷酸。示范的标记包括放射性同位素、荧光分子、生物素等等。
“编码序列”或“编码”表达产物如多肽的序列，是当被表达，引起那个多肽产生的核苷酸序列，即该核苷酸序列编码那个多肽的氨基酸序列。蛋白的编码序列可以包括起始密码子(通常是ATG)和终止密码子。
术语“基因”，也称作“结构基因”，是指DNA序列，其编码或相当于包含一个或多个多肽的全部或部分的特定氨基酸序列，且可以包括或不包括调控DNA序列，如决定例如基因表达的条件的启动子序列。
此外，本发明允许使用RNA病毒基因节段，优选负链RNA病毒基因节段的各种突变体，序列保守变异体，和功能性保守变异体，只要所有这种变异体保留所需的免疫保护性作用。事实上，本发明有利地允许诱变来以系统模式开发减毒病毒株。
术语“突变体”和“突变”是指遗传材料，如DNA，的任何可检测改变，或这种改变的任何过程、机制或结果。这包括基因突变(其中基因的结构(如DNA序列)改变)，任何突变方法产生的任何基因或DNA，和任何修饰的基因或DNA序列表达的表达产物(如蛋白)。术语“变异体”也可以用于代表修饰或改变的基因、DNA序列、酶、细胞等，即任何类型的突变。可用随机诱变技术，或用定点诱变，包括基于PCR的序列修饰，引入突变。如上指出，和下面详细讨论的，RNA病毒的一个或多个单个基因节段(如负链节段化RNA病毒)的诱变允许开发减毒疫苗，以及阐明减毒机制。此外，本发明的基于质粒的系统克服了以前通过诱变开发减毒病毒工作的缺陷，如有效选择系统的限制(见Bilsel和Kawaoka，在：Nicholson，Webster和May(编)，Textbook of Influenza，32章，422-434页，特别是423-425页)。
多核苷酸序列的“序列保守变异体”是给定密码子位置中的一个或多个核苷酸改变不引起在这个位置编码的氨基酸改变的那些变异体。等位变异体可以是序列保守变异体。
“功能保守变异体”是蛋白或酶中的给定氨基酸残基已经改变，但整体构象和多肽的功能不改变的变异体，包括但不限于，用具有相似性质(例如，极性、氢键势能、酸性、碱性、疏水性、芳香性等等)的氨基酸取代氨基酸。一些等位变异产生功能保守变异体，使得氨基酸置换不大大影响蛋白功能。类似地，同源蛋白可以是功能保守变异体。本领域熟知具有相似性质的氨基酸。例如，精氨酸、组氨酸和赖氨酸是亲水碱性氨基酸并可以互换使用。类似地，异亮氨酸，一种疏水性氨基酸，可以被亮氨酸、甲硫氨酸或缬氨酸取代。期望这种改变对该蛋白或多肽的表观分子量或等电点影响很小或没有影响。那些指为保守的之外的氨基酸在蛋白或酶中可以不同，使得功能相似的任何两个蛋白间的蛋白或氨基酸序列相似度百分比可以变化，且可以是例如，从70％至99％，如根据比对方案如Cluster方法确定，其中相似度基于MEGALIGN算法。“功能保守变异体”也包括BLAST或FASTA算法确定在参照序列的完整长度上具有至少60％氨基酸同一性的多肽或酶，其中BLAST或FASTA算法选择参数给出被测序列间的最大匹配，所述同一性优选至少75％，最优选至少85％，甚至更优选至少90％，并且其与它所比较的天然或亲本蛋白或酶具有相同或基本相似的性质或功能。
这里使用的所有语法形式和拼写变异的术语“同源”是指具有“共同进化起源”的蛋白间的关系，包括来自超家族(如免疫球蛋白超家族)的蛋白和来自不同物种的同源蛋白(如肌球蛋白轻链等)(Reeck，等，Cell 50：667，1987)。这种蛋白(及其编码基因)具有序列同源性，这反映在它们的序列相似度(就相似百分比或存在特定残基或基元而言)。
相应地，所有语法形式的术语“序列相似度”是指可能具有或不具有共同进化起源的核酸或蛋白的氨基酸序列之间同一或对应的程度(见Reeck等，前述)。然而，在普通用法和本申请中，当用副词如“高度”修饰时，术语“同源”可指序列相似度且可以或可以不与共同进化起源有关。
在具体实施方案中，当足够数量的核苷酸在确定长度的DNA序列上匹配，使这些序列和其它序列相区别时，这两个DNA序列“基本同源”或“基本相似”，如序列比较算法确定的，如BLAST，FASTA，DNAStrider等，其中选择参数给出所测序列间在完整长度的参照序列上的最大匹配。通过使用标准软件比较序列数据库中可获得的序列，或通过在例如对于特定系统定义的严格条件下的Southern杂交试验，可鉴定基本同源的序列。这种严格条件是本领域技术人员已知的且可在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中找到。严格杂交条件的非限制性例子是在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)大约45℃杂交，随后用0.2X SSC，0.1％SDS洗涤一次或多次，温度为50℃，优选55℃，和更优选60℃或65℃。
类似地，在特定实施方案中，当在确定的长度上有足够多同一或相似(功能等同)的氨基酸以区别这些序列和其它序列时，两个氨基酸序列“基本同源”或“基本相似”。优选，通过例如使用GCG(GeneticsComputer Group，Program Manual for the GCG Package，第7版，Madison，Wisconsin)pileup程序或任何上述程序(BLAST，FASTA等)进行比对鉴定相似或同源的序列。这里引入下列有关BLAST算法的文献作为参考：BLAST算法：Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.和Lipman，D.J.，J.Mol.Biol.215：403-410，1990；Gish，W.和States，D.J.，Nature Genet.3：266-272，1993；Madden，T.L.，Tatusov，R.L.和Zhang，J.，Meth.Enzymol.266：131-141，1996；Altschul，S.F.，Madden，T.L.，Schaffer，A.A.，Zhang，J.，Zhang，Z.，Miller，W.和Lipman，D.J.，Nucleic AcidsRes.(核酸研究)25：3389-3402，1997；Zhang，J.和Madden，T.L.，Genome Res.(基因组研究)7：649-656，1997；Wootton，J.C.和Federhen，S.，Comput.Chem.17：149-163，1993；Hancock，J.M.和Armstrong，J.S.，Comput.Appl.Biosci.10：67-70，1994；比对计分系统：Dayhoff，M.O.，Schwartz，R.M.和Orcutt，B.C.(1978)″A model of evolutionary change in proteins.″见″Atlasof Proteih Sequence ayad Structure″，5卷，suppl.3.M.O.Dayhoff(编)，345-352页，Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，DC；Schwartz，R.M.和Dayhoff，M.O.(1978)″Matrices fordetecting distant relationships.″见″Atlas of Protein Sequenceand Structure″，5卷，suppl.3.M.O.Dayhoff(编)，353-358页，Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，DC；Altschul，S.F.，J.Mol.Biol.219：555-565，1991；States，D.J.，Gish，W.，Altschul，S.F.，Methods(方法)3：66-70，1991；Henikoff，S.和Henikoff，J.G.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919，1992；Altschul，S.F.，J.Mol.Evol.36：290-300，1993；比对统计学：Karlin，S.和Altschul，S.F.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268，1990；Karlin，S.和Altschul，S.F.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877，1993；Dembo，A.，Karlin，S.和Zeitouni，O.，Ann.Prob.22：2022-2039，1994及Altschul，S.F.(1997)″Evaluating the statisticalsignificance of multiple distinct local alignments.″见″Theoretical and Computational Methods in Genome Research.(基因组研究中的理论和计算方法)″(S.Suhai，编)，1-14页，Plenum，New York。
“启动子序列”是能够结合细胞内RNA聚合酶并启动序列转录的DNA调控区。为了限定本发明，位于cDNA上游的启动子序列在其3’末端以转录启动位点为界并向上游延伸(5’方向)而包括启动超过背景的可检测水平的转录所需的最少数量的碱基或元件。位于cDNA下游的启动子序列(为了表达(-)RNA)在其5’末端以转录起始位点为界并向下游(3’方向)延伸而包括启动超过背景的可检测水平的转录所需的最少数量的碱基或元件。本发明的双向系统包括上游和下游启动子；单向系统仅包括上游启动子。在启动子序列内将发现转录起始位点(例如用核酸酶S1制图方便地确定)，以及负责结合RNA聚合酶的蛋白结合域(共有序列)。
任何已知的启动子可以用于本发明，只要保留本发明的主要元件。例如，可以用于调控基因表达的pol II 启动子，包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子(美国专利号5,385,839和5,168,062)，SV40早期启动子区(Benoist和Chambon，Nature(自然)290：304-310，1981)，鲁斯氏肉瘤病毒的3’长末端重复中含的启动子(Yamamoto，等，Cell 22：787-797，1980)，疱疹胸腺嘧啶核苷激酶启动子(Wagner，等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：1441-1445，1981)，金属硫蛋白基因的调控序列(Brinster，等，Nature 296：39-42，1982)；T7 RNA聚合酶启动子；T3 RNA聚合酶启动子；SP6 RNA聚合酶启动子和其它在感兴趣宿主细胞中有效的启动子。用于表达不带帽RNA的Pol I启动子是所有真核细胞广泛存在的且包括人RNA聚合酶I(见Molecular Cell Biology，Darnell等编1986，第311，365-6页)。RNA聚合酶III也可以用于本发明。
当RNA聚合酶将编码序列转录为RNA，如mRNA或vRNA时，细胞中该编码序列处在转录和翻译调控序列(如pol I或pol II启动子)的调控之下”、与其“功能性连接”或可操作地连接”。
术语“表达”是指允许或引起基因或DNA序列中的信息被显现，例如通过活化参与相应基因或DNA序列转录和翻译的细胞功能而产生RNA(包括cRNA，vRNA和病毒mRNA)或蛋白。DNA序列在细胞中或被细胞表达形成“表达产物”如蛋白。表达产物本身，如所得蛋白也可以描述为被细胞表达”。
术语“转染”是指将外来核酸导入细胞，使得宿主细胞会表达被导入的基因或序列而产生期望的由导入的基因或序列编码的多肽。导入的基因或序列也可以称作“克隆”或“外来”的基因或序列，可包括调控或控制序列，如起始、终止、启动子、信号、分泌，或细胞遗传机构使用的其它序列。该基因或序列也可以包括无功能序列或功能未知的序列。接受和表达导入的DNA或RNA的宿主细胞已经成为“转化的”和是“转化体”或“克隆”。导入宿主细胞的DNA或RNA可来自任何来源，包括与宿主细胞相同的属或种的细胞，或不同属或种的细胞。
术语“载体”、“克隆载体”和“表达载体”是指通过它DNA或RNA序列(如外来基因)可导入宿主细胞的工具，使得转化宿主和促进导入序列的表达(如转录和翻译)。质粒是本发明优选的载体。
载体典型地包含可传递物质的DNA，其中插入了外来DNA。将一个DNA片段插入另一个DNA片段中的普通方法包括使用在称作限制性酶切位点的特殊位点(特殊的核苷酸组)切割DNA的称作限制性酶的酶。“盒”是指编码可在确定的限制性酶切位点插入载体的编码表达产物的DNA序列或片段的DNA。该盒限制性酶切位点被设计为确保盒插入正确的阅读框架。通常，外来DNA插在载体DNA的一个或多个限制性酶切位点，然后与可传递载体DNA一起被载体携带到宿主细胞。具有插入或添加DNA的DNA片段或序列，如表达载体，也可以称作“DNA构建体”。普通类型的载体是“质粒”，它通常是双链DNA的自主分子，常常起源于细菌，可容易接受另外(外来)DNA并可容易导入合适的宿主细胞。质粒载体常常含有编码DNA和启动子DNA且具有适合插入外来DNA的一个或多个限制性酶切位点。编码DNA是编码特定蛋白或酶的特定氨基酸序列的DNA序列。启动子DNA是启动、调节或否则介导或控制编码DNA的表达的DNA序列。启动子DNA和编码DNA可以来自相同基因或不同的基因，可以来自相同或不同的生物体。重组编码载体通常将包括一个或多个用于克隆或表达的复制系统，一个或多个在宿主中选择的标记，如抗生素抗性，和一个或多个表达盒。
术语“表达系统”是指宿主细胞和在合适条件下相容的载体，如用于该载体携带并导入宿主细胞的外来DNA所编码蛋白的表达。
术语“异源”是指非自然产生的元件的组合。例如，异源DNA是指自然情况下不存在于细胞或细胞中染色体部位的DNA。优选，异源DNA包括对细胞是外来的基因。异源表达调控元件是与它在自然情况下可操作连接基因所不同的基因可操作连接的元件。在本发明的上下文中，编码多肽的含来自序列文库的序列的基因与其中插入它进行克隆或表达的载体DNA是异源的，与含这种载体的宿主细胞是异源的，其中它被表达。
如上指出，本发明允许使用异源病毒基因产生重配病毒。除了将病毒抗原的基因引入很好适应在培养中生长的遗传背景病毒株，本发明还允许产生交叉物种重配，如乙型流感病毒抗原于甲型流感病毒背景中重配。
疫苗
如上指出，本发明提供了制备治疗或预防RNA病毒感染，优选负链RNA病毒感染的疫苗的有效和经济的策略。本发明基于最少质粒的系统消除了选择的需要，并提供了重配病毒的紧密控制。为了制备灭活流感疫苗，含来自高产量株(如PR/8/34(H1N1))的非糖蛋白节段(如PB1，PB2，PA，NP，M和NS)的六个质粒可以与含推荐疫苗亚型的HA和NA cDNA的两个表达质粒共转染。由于不需要辅助病毒，所产生的病毒是含期望基因构象(constellation)的流感病毒。类似方法可用于产生用在疫苗中的任何类型的灭活重配RNA病毒。含靶病毒的病毒基因节段(如非糖蛋白节段)的表达质粒可以与其它编码相应于给定感染性病毒亚型(如当前在人群中传播的病毒亚型)的蛋白的表达质粒共转染。按照本发明产生的病毒可用于常规或新的疫苗接种方法(见Bilsel和Kawaoka，在：Nicholson，Webster和May(编)，Textbook of Influenza，32章，422-434页)，特别是减毒活疫苗的发展中(在下更详细讨论)。特别是，就开发具有有限的宿主范围或不可预知的减毒(同上)的重配病毒而言，本发明克服了当前技术的缺陷。
已经在开发流感疫苗中做了很多努力(见Wood和Williams，在：Nicholson，Webstern和May(编)，Textbook of Influenza，23章，317-323页)。尽管这部分大多涉及流感疫苗，本发明的范围延伸到所有RNA病毒疫苗，优选负链节段化RNA病毒疫苗，尤其是正粘病毒科疫苗。
当前可得到三种类型的灭活流感疫苗：完整病毒，节段产物和表面抗原疫苗(见Wood，在：Nicholson，Webster和May(编)，Textbookof Influenza，25章，333-345页)。因为本发明允许快速开发具有可接受的培养生长特性的期望重配病毒，它将使疫苗制造商制备足量的疫苗来满足公共健康需要和确保标准化，这是当前被制备临床量疫苗的需要减轻的重要需求，常常是8至9个月的时期(Wood，前述，333页)。
疫苗安全性也是一个考虑的方面(见Wiselka，于：Nicholson，Webster和May(编)，Textbook of Influenza，26章，346-357页)。因为本发明的疫苗允许在规定的细胞培养系统中制备，它们避免了在含胚卵中制备的商业疫苗中可能存在的非特异性病原体、细菌和变应原蛋白。
佐剂已经用于疫苗(如流感病毒疫苗)(Wood和Williams，前述)。术语“佐剂”是指增强对抗原的免疫反应的化合物或混合物。佐剂可起缓慢释放抗原的组织贮库的作用，也起着非特异性增强免疫反应的淋巴系统激活剂的作用(Hood，等，Immunology，第2版，1984，Benjamin/Cummings：Menlo Park，California，384页)。通常，在缺乏佐剂时，单独用抗原初次攻击，将不能引起体液或细胞免疫反应。佐剂包括但不限于完全弗氏佐剂，不完全弗氏佐剂，皂甙，矿物凝胶如氢氧化铝，表面活性物质如溶血卵磷脂，多聚醇，聚阴离子，肽，油或碳氢化合物乳剂，和可能有用的人佐剂如BCG(卡介苗)和小棒杆菌。优选的合成佐剂的例子是QS-21。可供选择地，或此外，免疫刺激性蛋白，如下所述，可提供作为佐剂或增加对疫苗的免疫反应。优选，佐剂是药物可接受的。
短语“药物可接受”是指当给予人后，生理学上可容忍的且不典型地产生过敏或类似的不期望的反应，如胃不适、头晕等等的分子实体和组合物。优选，这里使用的术语“药物可接受”是指联邦或州政府的管理机构许可的或美国药典中列出的或其它药典通常认可的用于动物，和更特别是用于人的。术语“载体”是指与化合物一起给药的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。优选使用无菌水或含水盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油水溶液作为载体，特别是可注射液。E.W.Martin在“Remington’s Pharmaceutical Sciences”中描述了合适的药物载体。
免疫刺激分子与疫苗，特别是载体疫苗共同给予可增强疫苗接种的有效性(Salgaller和Lodge，J.Surg.Oncol.1998，68：122)，例如免疫刺激剂、免疫强化剂或促炎细胞因子、淋巴因子或趋化剂。例如，可以使用细胞因子或细胞因子基因如白介素IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-12，IL-13，粒细胞巨噬细胞(GM)集落刺激因子(CSF)和其它集落刺激因子，巨噬细胞炎性因子，Flt3配体(Lyman，Curr.Opin.Hematol.，5：192，1998)，以及一些关键共刺激分子或其基因(如B7.1，B7.2)。这些免疫刺激分子可以以蛋白或通过编码该分子表达的载体的表达而全身或局部递送。
树突细胞寻靶.疫苗接种可以通过树突细胞寻靶而完成(Steinman，J.Lab.Clin.Med.，128：531，1996；Steinman，Exp.Hematol.，24：859，1996；Taite等，Leukemia(白血病)，13：653，1999；Avigan，Blood Rev.，13：51，1999；DiNicola等，Cytokines Cell.Mol.Ther.，4：265，1998)。树突细胞在活化T细胞依赖性免疫中起着决定性作用。增殖的树突细胞可以用于捕获原位免疫原性形式的蛋白抗原，接着将这些抗原以可被T细胞识别和刺激T细胞的形式呈递(如见，Steinman，Exper.Hematol.24：859-862，1996；Inaba，等，J.Exp.Med.，188：2163-73，1998和美国专利号5，851，756)。对于离体刺激，将树突细胞铺在培养皿中并接触(脉冲给予)足量病毒粒体足够的一段时间以允许病毒抗原结合树突细胞。然后脉冲的细胞可返回移植给接受治疗的受试者，如通过静脉内注射。优选使用自体的树突细胞，即从接受治疗的受试者得到的树突细胞，尽管可能可以使用MHC II类匹配树突细胞，它可以得自类型匹配供体或通过将树突细胞基因工程改造以表达期望的MHC分子(并优选抑制不期望的MHC分子的表达)而得到。
优选，树突细胞在体内特异性打靶以摄取病毒或病毒亚单位。通过利用介导抗原呈递的受体，如DEC-205(Swiggard等，Cell.Immunol.，165：302-11，1995；Steinman，Exp.Hematol.，24：859，1996)和Fc受体，可利用各种策略进行体内树突细胞打靶。
灭活疫苗
已很好建立了灭活病毒疫苗用于接种对抗RNA病毒感染(如流感病毒)(见Nichol，In：Nicholson，Webster和May(编)，Textbookof Influenza，27章，358-372页)。为了制备灭活病毒，转染的病毒在细胞培养中或在含胚卵中生长。可用甲醛、β-丙酸内酯、醚、含洗涤剂(如Tween-80)的醚、溴化十六烷基三甲铵(CTAB)、和TritonN101，脱氧胆酸钠和磷酸三(正丁基)酯灭活处理病毒(Funninger，同上；Wood和Williams，前述)。灭活可在尿囊液净化(卵中生产的病毒)后或前进行；离心分离和纯化病毒粒体(Furminger，前述，见326页)。为了估计疫苗的效能，可使用单一径向免疫扩散(SRD)测试(Schild等，Bull.World Health Organ.1975，52：43-50和223-31；Mostow等，J.Clin.Microbiol.1975，2：531)。满意的免疫反应所需的剂量已经被标准化，是15μg/HA/株/剂。灭活疫苗可肌肉注射给予。
减毒活流感疫苗
已经开发了减毒冷适应活RNA病毒疫苗(流感病毒疫苗)(见Keitel和Piedra，In：Nicholson，Webster和May(编)，Textbookof Influenza，28章，373-390页；Ghendon，In：Nicholson，Webster和May(编)，Textbook of Influenza，29章，391-399页)。完全从八个质粒产生流感病毒的能力允许调整疫苗株的减毒且能够开发最佳地适合任何靶人群的疫苗株(见Bilsel和Kawaoka，前述)。因为流感病毒株A/Ann Arbor/6/60(H2N2)或流感病毒B/Ann Arbor/1/66当前用于制备减毒活疫苗，人们会将流感病毒内部基因的六个cDNAs中(PB2，PB1，PA，NP，M，NS)每一个插入到质粒如pHW2000中。构建含相关流感病毒株的糖蛋白HA和NA的两个质粒并与编码非糖基化流感病毒蛋白的六个主要质粒共转染。
预期内部基因的编码或非编码区的基因修饰除了允许开发减毒病毒外，可提高疫苗的安全性、感染性、免疫原性和保护性功效。
HA基因的操作也可增加疫苗株的安全性。例如，去除在高度致病性鸟甲型流感病毒的H5或H7糖蛋白的连接肽中发现的碱性氨基酸可增加疫苗的安全性。
粘膜接种.粘膜接种对许多致病性病毒特别有效，因为感染常常通过粘膜发生。粘膜停驻着树突细胞，它是EBNA-1疫苗和免疫治疗的重要靶标。因此，灭活和减毒病毒疫苗的粘膜接种策略是预想的。由于局部传递的疫苗可对准粘膜，已经使用各种策略将免疫原性蛋白传递给粘膜。
在具体的实施方案中，疫苗可在与霍乱毒素，如霍乱毒素B或霍乱毒素A/B嵌合体的混合物中，或作为与它们的缀合物或嵌合融合蛋白而给予(Hajishengallis，J Immunol.，154：4322-32，1995；Jobling和Hohles，Infect Immun.，60：4915-24，1992)。已描述了基于使用霍乱毒素B亚单位的粘膜疫苗(Lebens和Holmgren，DevBiol Stand 82：215-27，1994)。在另一个实施方案中，可制备与热不稳定肠毒素(LT)的混合物用于粘膜接种。
其它粘膜接着策略包括将病毒囊包在微囊中(美国专利号5,075,109，5,820,883，和5,853,763)和使用免疫强化膜载体(WO98/0558)。使用红细胞(rbc)或rbc血影(美国专利号5,643,577)，或使用蓝舌抗原(美国专利号5,690,938)可增强口腔给予免疫原的免疫原性。
实施例
参考下列实施例将更好理解本发明，实施例说明本发明而不限制它。
实施例1：“双义”方法产生甲型流感病毒：从一个模板合成vRNA和mRNA
作为减少质粒数量的第一步，这个实施例报道了在同一质粒上含pol I和pol II启动子的质粒的构建和转染并提供了这个系统允许从一个模板表达vRNA和病毒的证据。这个实施例已经公开了(Hoffmann等，Virology(病毒学)2000，267：310)。
材料和方法
质粒的克隆.根据标准方案实施所有克隆和PCR反应。简言之，A/WSN/33聚合酶复合体基因的表达质粒源自含人巨细胞病毒(CMV)的立早启动子和编码牛生长激素(BGH)的基因的多聚A位点的pcDNA3(Invitrogen)。病毒cDNAs源自质粒pWNP143，pWSNPA3，pWSNPB2-14，pGW-PB1，产生表达构建体pHW25-NP，pHW23-PA，pHW21-PB2，pHW22-PB1。 pHW12由将人pol I启动子和终止序列插在pol II启动子和多聚A位点之间而产生。质粒pHW52源自pHW12，方式是通过首先插入延伸了位点HindIII和XhoI的含PB1非编码区的寡核苷酸，然后将pHW22-PB1的PB1编码区插入这些位点。质粒pHW82-PB1通过删除CMV启动子序列源自pHW52-PB1。使用pEGFP-Nl(Clontech)作为模板PCR扩增并在SacII/XhoI消化后将cDNA插入含人pol I启动子和鼠终止子和SacII/XhoI分离的M节段的非编码区的载体pHW72，然后得到报道构建体pHW72-EGFP中增强绿荧光蛋白(EGFP)的编码区。用含节段特异性序列和用于插入到BsmBI消化的载体pHH21中的BsmBI位点的引物进行RT-PCR扩增病毒RNA而构建pHW127-M和pHW128-NS(E.Hoffmann，Ph.D.Thesis 1997，Justus LiebigUniversity，Giessen，德国；Neumann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999，96：9345)。质粒pPolI-WSN-PB1；pPolI-WSN-PB2，pPolI-WSN-PA，pPolI-WSN-NP，pPolI-WSN-HA，pPolI-WSN-NA，pEWSN-HA，和pCAGGS-WNA15的构建已经在别处描述(Neumann等，前述)。
细胞培养和转染.Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞保持在含10％胎牛血清(FBS)的改良Eagle培养基(MEM)中，293T人胚肾细胞在含10％FEB的Dulbecco’s改良Eagle培养基(DMEM)中培养。根据制造商的说明使用TransIT LT-1(Panvera，Madison，Wisconsin)转染1×10⁶个293T细胞。不同量质粒(表1)与TransIT LT-1(每1μg DNA 2μlTransIT LT-1)混合，在室温培养45分钟并加入细胞中。六个小时后，用含0.3％牛血清白蛋白(BSA)和0.01％FBS的Opti-MEM(Gibco/BRL，Gaithersburg，Maryland)替换DNA转染混合物。转染后四十八小时，滴定MDCK细胞中含病毒的上清。
RNA分离和RT-PCR.使用RNeasy-Kit(Qiagen，Valencia，California)根据制造商的说明，从病毒颗粒中分离病毒RNA。对于重组流感病毒的特性描述，根据提供的方案使用Access RT-PCR kit(Promega，Madison，Wisconsin)。在RT-PCR实验中使用下列引物：Seq-PB1#1：5’-AGG ATG GGA TTC CTC AAG G-3’(SEQ ID NO：1)；Seq-PB1#2：5’-GCT ATG GTT TCC AGA GCC CG-3’(SEQ ID NO：2)；Bm-PB1-1：5’-TAT TCG TCT CAG GGA GCG AAA GCA GGC A-3’(SEQ IDNO：3)；Bm-PB1-2341R：5’-ATA TCG TCT CGT ATT AGT AGA AAC AAGGCA TTT-3’(SEQ ID NO：4)。使用PTC-200 DNA engine(MJ Research，Watertown，Massachusetts)进行RT-PCR实验。扩增程序始于48℃45分钟1个循环(第一条cDNA链合成)，和94℃2分钟1个循环(灭活AMV逆转录酶和cDNA变性)。这些循环后跟40个循环的94℃20秒，52℃30秒和72℃30秒(PCR扩增)；以72℃5分钟的1个循环结束程序。琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物并用引物Seq-PB1#1或Seq-PB1#2测序。
流式细胞计数.转染后四十八小时，用磷酸平衡盐水(PBS)洗涤293T细胞，沉淀并重悬于加了5％FBS的PBS中。用FACS Calibur流式细胞计数仪(Becton Dickinson)进行流式细胞计数分析，用CellQuest软件包分析数据。对于EGFP表达分析，我们使用发射波长530nm(FL1)获得高敏感性的EGFP介导的荧光检测。
结果和讨论
含两个真核启动子的克隆载体pHW12的设计和特征.甲型流感病毒是含负义极性RNA分子的节段化病毒。在复制循环过程中，核糖核蛋白复合体蛋白(PB2，PB1，PA，NP)识别八个vRNA节段的5’和3’结构导致流感病毒基因的复制和转录。终止序列元件高度保守的事实表明转录的人工RNA应该具有与5’和3’末端相同的序列(Luo等，J.Virol.1991，65：2861；Flick等，RNA 1996，2：1046)。构建了克隆载体pHW12，使用限制性内切酶BsmBI允许感兴趣序列插在pol I启动子和终止子之间。pol I转录单位侧翼与来自巨细胞病毒(CMV)的pol II启动子和编码牛生长激素的基因的多腺苷酸化信号相连。CMV启动子、多聚A位点和质粒的主干源自克隆载体pcDNA3.
PB1蛋白在pol I/pol II双向转录系统中表达.为了检测polI/pol II一个质粒转录系统，将A/WSN/33病毒的PB1基因的cDNA插入克隆载体pHW12产生质粒pHW52-PB1。HindIII和XhoI限制性位点插入到这个基因的5’和3’非编码区。包含这些基因标记是确保产生的重组病毒能够用RT-PCR鉴定。我们期望用这个质粒转染的人细胞会产生两种类型的RNA：细胞pol I合成的PB1-vRNA和pol II合成的带5’帽结构的mRNA。mRNA翻译应导致PB1蛋白的合成。
为了检测PB1蛋白是否从这个构建体产生，我们通过构建表达质粒pHW21-PB2，pHW23-PA和pHW25-NP，它们含有在CMV启动子控制下的编码A/WSN/33的PB2、PA和NP蛋白的cDNAs，检测了人工vRNA的复制和转录。对于体内合成人工vRNA，我们构建了报道质粒pHW72-EGFP，它含侧翼与M节段的非编码区和人pol I启动子和小鼠终止序列相连的EGFP cDNA。五个质粒(2μg pHW21-PB2，2μg pHW52-PB1(pol I/pol II启动子构建体)，2μg pHW23-PA，2μg pHW25-NP，和1μg pHW72-EGFP)转染293T细胞。转染后24和48小时，用荧光显微镜分析细胞。24小时后观察到荧光细胞。这个结果表明在24小时内，聚合酶蛋白合成到足以允许流感病毒EGFP-vRNA特异性末端识别的浓度。这些蛋白合成翻译为EGFP的mRNA。
为了估计这个系统的效率，我们进行流式细胞计数分析来计算荧光细胞的数量。五个质粒转染后四十八小时，18.72％的细胞群显示出荧光。当没有加入pHW52-PB1时，仅观察到背景水平的荧光细胞(0.06％)；这个发现与报道所有四个RNP复合体蛋白是vRNA扩增必需的早期研究相一致(Huang等，J.Virol.1990，64：5669)。该结果表明PB1-cDNA转录和PB1蛋白连同其它RNP复合体蛋白的所得浓度足以启动病毒转录/复制过程。
重组甲型流感病毒的产生.对于感染性甲型流感病毒的产生，需要质粒pHW52-PB1不但提供PB1 mRNA和蛋白，还要提供足够量的PB1-vRNA，它可被包装到后代病毒中。对于剩余的七个vRNAs，我们使用含有侧翼与人pol I启动子和小鼠终止子相连的A/WSN/33病毒全长RNAs的cDNAs的质粒。这些质粒转染应该引起全部八个病毒RNAs合成，该RNA是由形成新vRNPs的聚合酶蛋白复制和转录的。结构蛋白合成后，RNPs会包装到新病毒颗粒中。
我们用不同量pHW52-PB1质粒(0，2，4μg)连同质粒pPolI-WSN-PB2，pPolI-WSN-PA，pPolI-WSN-HA，pPolI-WSN-NP，pPolI-WSN-NA，pHW127-M，pHW128-NS(每种1μg)转染293T细胞。蛋白表达质粒pHW21-PB2(1μg)，pHW23-PA(0.1μg)，pHW25-NP(1μg)，pEWSN-HA(1μg)和pCAGGS-WNA15(1μg)共转染。血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的表达质粒包括在内来增加转染病毒的产量。
转染后四十八小时，最初转染的293T细胞上清转移给MDCK细胞。在所有加入pHW52-PB1质粒的转染试验中，传代后24小时，我们观察到病毒诱导的细胞病变作用。如果在转染反应中没有包括表达PB1的质粒，见不到细胞病变作用。在MDCK细胞上滴定感染细胞的上清来确定病毒滴度；发现上清含有2×10⁴-2×10⁵pfu/ml。这个发现表明PB1-pol I/pol II启动子质粒转染(与表达质粒一起)后，在人细胞系293T中合成了足以产生感染性甲型流感病毒的水平的PB1 vRNA和PB1蛋白。在用含分开在两个质粒的PB1-cDNA的质粒(pHW82-PB1和pHW22-PB1)共转染的实验中，发现2×10⁴pfu/ml的病毒滴度；使用含野生型PB1序列的质粒(pPol I-WSN-PB1和pHW22-PB1)的类似实验产生3×10⁶pfu/ml的病毒滴度。
与以前研究使用的带pol II启动子的表达构建体(Neumann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999，96：9345)不同，我们使用含来自插入在CMV启动子和聚腺苷酸位点之间的pol I转录单位的序列的质粒pHW52-PB1。EGFP报道基因表达证明这个系统中PB1蛋白的整体表达足以形成EGFP-RNP复合体。尽管pol I启动子/终止区含有pol I特异性转录和终止因子的识别序列(Beckmann等，Science 1995，270：1506；Bell等，Science 1988，241：1192；Kuhn等，EMBO J.1994，13：416)，这些DNA结合蛋白看来不能抑制pol II介导的转录。这些发现与pol I特异性DNA结合蛋白在细胞rDNA转录发生的隔室-核仁中更丰富的发现相一致(Evers等，EMBO J.1995，14：1248)。这些结果表明pol I/pol II启动子构建体转染细胞后，一些质粒传递到核仁，在那里发生pol I介导的转录，而一些保留在核中，在那里它们被RNA聚合酶II转录。
因为报道构建体pHW52-PB1在起始密码子前和终止密码子后的非编码区中含有另外的非流感病毒序列(限制性位点)，我们感兴趣这些序列是否被稳定保留在病毒PB1 RNA节段中。因此，在转染病毒二次传代给MDCK细胞后，我们分离了vRNA并进行逆转录PCR分析。用PB1特异性引物扩增vRNA导致期望大小的cDNA节段产生。用相同的病毒RNA和引物，但不加入逆转录酶，没有得到扩增产物，表明cDNA起源于病毒RNA不是来自从转染细胞上清携带的质粒DNA。
PCR产物测序揭示RNA分子中存在两个限制性位点序列。结果表明pol I/pol II转录系统允许回收感染性重组病毒且PB1基因非编码区中含外来基因的病毒是有活力的。该修饰的PB1节段仍可被复制、转录和包装到病毒颗粒中。以前，通过使用RNP转染系统，改变了甲型流感病毒节段的非编码区。通过用乙型流感病毒的NS节段的相应序列置换NA基因的非编码区，得到了转染流感病毒(Muster等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1991，88：5177；Bergmann和Muster，J.Gen.Virol.1995，76：3211)。含嵌合NA节段的这个类型病毒在小鼠和用非致死剂量接种的抗野生型流感病毒感染的保护性小鼠中显示出减毒表型。这些结果表明RNA节段的非编码区的基因改变可改变转染病毒的生物特性。在这里，我们首次报道了甚至非流感病毒序列也可以插入PB 1节段的非编码区中。
用pol I/pol II转录系统，现在可能在PB1节段的非编码区系统地修饰这些基因元件并估计这些基因操作是否引起重组病毒的生物性质改变。事实上，带突变PB1节段的病毒与野生型病毒相比的产量低表明插入的序列消极影响病毒生长。
尽管近来发展的基于质粒的系统(Neumann等，前述)在产生流感病毒中非常有效，但它包括克隆14-17个质粒。在这个研究中，我们将有效回收流感病毒A/WSN/33株所需的质粒数量降低到13。这个方法达到的质粒数量降低预示可增加除了293T细胞的细胞系的转染效率，因此允许将基因递送给有效递送14个质粒很难达到的细胞系。Fodor等(J.Virol.1999，73：9679)能够在转染12个质粒后回收流感病毒，但是在那个实验中，病毒产量仅为每10⁶个转染Vero细胞产生1-2个感染性病毒颗粒。
实施例2：从基于最少质粒的系统构建重组甲型流感病毒
这个实施例描述了使用基于质粒的转染系统完全从克隆cDNA中回收甲型流感病毒。与已建立的基于质粒的系统不同，这个产生甲型流感病毒的系统利用仅八个表达质粒的构建和转染，每个含有一个拷贝的相应病毒基因节段的不同病毒cDNA。这个反向遗传系统减少了回收甲型流感病毒所需的质粒数量且允许可预知地和有效地产生重配病毒。
材料和方法
质粒的克隆.质粒pHW2000(图3A)源自pHW12(实施例1)。pHW2000克隆载体含有被两个BsmBI位点隔开的225bp的人pol I启动子和33bp鼠终止子序列。pol I启动子和终止子元件侧翼与截短的人巨细胞病毒的立早启动子(开始于pcDNA3中发现的转录起始位点上游大约350bp，Invitrogen，Carlsband，California)和编码牛生长激素的基因的多腺苷酸化信号相连。将质粒pPolI-WSN-PB2，pPolI-WSN-PB1，pPolI-WSN-PA，pPolI-WSN-NP，pPolI-WSN-HA，pPolI-WSN-NA(Neumann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999，96：9345)，pHW127M和pHW128-NS(实施例1)的ApaI-SalI片段(含病毒cDNA和pol I启动子和终止子序列插入pHW2000的ApaI-SalI载体片段中来构建含病毒A/WSN/33(H1N1)的cDNA的八个质粒(pHW181-PB2，pHW182-PB1，pHW183-PA，pHW184-HA，pHW185-NP，pHW186-NA，pHW187-M和pHW188-NS)。逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增病毒RNA构建含A/Teal/HK/W312/97(H6N1)的cDNA的八个质粒(pHW241-PB2，pHW242-PB1，pHW243-PA，pHW244-HA，pHW245-NP，pHW246-NA，pHW247-M和pHW248-NS)。PCR反应中使用的引物在其3’末端含有节段特异性序列，在其5’末端含有BsmBI或BsaI限制性位点序列。用BsmBI或BsaI消化PCR产物后，该片段克隆到载体pHW2000(图3A)中。用于扩增A/teal/HK/W312/97(H6N1)基因组的引物序列如下。从左至右相当于5’和3’末端显示引物。甲型流感病毒特异性核苷酸被下划线。
·NS：
Bm-NS#1：TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTG(SEQ ID NO：5)
Bm-NS#2：ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTT(SEQ ID NO：6)
·M：
Bm-M#1：TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTAG(SEQ ID NO：7)
Bm-M#2：ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTTT(SEQ ID NO：8)
·NA：
Bm-NA1-1：TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGAGTTTAACATG(SEQ ID NO：9)
Bm-NA-1413R：ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTT(SEQ ID NO：10)
·HA：
Bm-H6-1：TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGGAAAATG(SEQ ID NO：11)
Bm-NS#2：ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTT(SEQ ID NO：12)
(注：HA和NS节段在非编码区的这部分具有等同序列)
·NP：
Ba-NP-1：TATTGGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGGTA(SEQ ID NO：13)
Ba-NP1565R：ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTATT(SEQ ID NO：14)
·PA：
Bm-PA1-1：TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGTACTGATCC(SEQ ID NO：15)
Bm-PA1-2231R：ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTACTTTTT(SEQ IDNO：16)
·PB1：
Bm-PB1a-1：TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGCAAACC(SEQ ID NO：17)
Bm-PB1-2341R：ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGCATTT(SEQ ID NO：18)
·PB2：
Ba-PB2-1：TATTGGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGTCAATTATATTC(SEQ IDNO：19)
Ba-PB2-2341R：ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTCGTTTTT(SEQ IDNO：20)
用引物5’-AGCAAAAGCAGG-3’(SEQ ID NO：21)进行RT反应。为确保表达质粒中源自RT-PCR扩增的病毒cDNAs不具有不想要的突变，测序被插入的cDNAs。
病毒和细胞培养.流感病毒A/WSN/33(H1N1)和A/Teal/HK/W312/97(H6N1)在10日龄的卵中增殖。Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞保持在含10％FBS的改良Eagle培养基(MEM)中。293T人胚肾细胞在含5％FBS的Opti-MEM I(Life Technologies，Gaithersburg，Maryland)中培养。对于转染实验，使用六孔组织培养板。转染前的那天，胰蛋白酶消化在75cm²的细颈瓶中汇合293T和MDCK细胞并将每个细胞系的10％混合于18ml OptiMEM I；这种细胞悬液3ml接种在六孔板的一个孔中。培养的MDCK和293T细胞(每孔0.2-1×10⁶个每种细胞)用于转染实验。根据制造商指南使用TransIT LT-1(Panvera，Madison，Wisconsin)转染细胞。简言之，每1μg DNA 2μl TransIT LT-1混合，室温培养45分钟，并加入到细胞中。六个小时后，用Opti-MEM I替换DNA转染混合物。转染后三十小时，含TPCK-胰蛋白酶的1mlOpti-MEM I加入细胞中；添加使得细胞上清中TPCK-胰蛋白酶的终浓度是0.5μg/ml。在MDCK细胞上滴定上清确定细胞上清的病毒滴度。
RNA分离和RT-PCR.根据制造商的说明，用Rneasy-Kit(Qiagen，valencia，California)从病毒颗粒中分离病毒RNA。对于重组流感病毒的特性描述，根据提供的方案使用Access RT-PCR kit(Promega，Madison，Wisconsin)。RT-PCR实验中使用下列引物：Bm-NS#1(5’-TAT TCG TCT CAG GGA GCA AAA GCA GGG TG-3；SEQ ID NO：5)和Bm-NS#2(5’-ATA TCG TCT CGT ATT AGT AGA AAC AAG GGT GTT TT-3；SEQ ID NO：12)。使用PTC-200 DNA engine(MJ Research，Watertown，Massachusetts)进行RT-PCR实验。扩增程序开始于48℃45分钟1个循环和94℃2分钟1个循环。这些循环后跟40个循环的94℃20秒，52℃30秒和72℃40秒；以72℃5分钟1个循环结束程序。用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物并用引物Bm-NS#1测序。St.Jude儿童研究医院的生物技术中心使用含AmpliTaq DNA polymerase FS(Perkin-Elmer，Applied Biosystems，Inc.[PE/ABI]，Foster City，CA)和合成寡核苷酸的碱性蕊香红或d碱性蕊香红染色的终止循环测序预备反应试剂盒确定模板DNA的序列。样品接受电泳，检测和在PE/ABI 373型，373型Stretch或377型DNA测序仪上分析。
结果
产生A/VSN/33(H1N1)的pol I-pol II系统的建立.因为甲型流感病毒的基因组含有八个节段，所以在pol I启动子和pol II启动子之间插入全部八个甲型流感病毒cDNAs应该导致八个vRNAs，所有病毒mRNA的转录和全部10个病毒蛋白合成(图1)。含结构蛋白的全部病毒核糖核蛋白装配后，感染性甲型流感病毒应该形成(图2)。
为了检测用这个cDNA双向转录系统是否能回收感染性甲型流感病毒，构建了含A/WSN/33(H1N1)的八个cDNAs的八个表达质粒(pHW181-PB2，pHW182-PB1，pHW183-PA，pHW184-HA，pHW185-NP，pHW186-NA，pHW187-M和pHW188-NS)。八个质粒(每个质粒1μg)(表1)共转染给短暂共培养的293T-MDCK细胞。转染前的那天两个细胞系在一个细胞培养孔中共培养，确保甲型流感病毒高效率DNA转染(293T细胞)和复制效率(MDCK细胞)的条件。48和72小时后，MDCK细胞显示出病毒诱导的细胞病变作用，但无PB1表达构建体的七个质粒(表1)转染后，没有观察到细胞病变作用。在转染后的不同时间在MDCK细胞中滴定确定上清的病毒滴度。转染后二十四小时细胞上清每毫升含1×10³个病毒；转染后72小时每毫升产生了2×10⁷个感染性病毒(表1)。回收的病毒在MDCK细胞中传代两次。为了证实产生的病毒是设计的A/WSN病毒，RT-PCR产生NS基因的cDNA(图4A，泳道8)。用限制性核酸内切酶NcoI消化后，产生两个片段(图4B，泳道8)，扩增片段的序列分析证实回收的病毒确实是设计的A/WSN病毒。这些发现表明pol I和pol II驱动的从八个模板合成vRNA和mRNA导致感染性甲型流感病毒产生。
表1.回收A/WSN/33(H1N1)和A/Teal/HK/W312/97(H6N1)病毒使用的质粒组

§数字代表转染后24h(小时)，48h和72h测定的转染细胞上清每毫升中的感染性病毒颗粒
*观察到共培养MDCK细胞中的细胞病变作用
通过共转染八个质粒回收A/Teal/HK/W312/97(H6N1).甲型流感病毒/WSN/33(H1N1)，最初源自1918年人流感大流行株(Goto和Kawaoka，Proc.Acad.Sci.USA 1998，95：10224；Reid等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999，96：1651)，已在小鼠脑中传代并很好适应在细胞培养中生长。为了估计八个质粒系统从克隆cDNA产生已经不适应在细胞培养中生长的病毒的效率，尝试单独从克隆cDNA中产生病毒A/Teal/HK/W312/97(H6N1)。这个H6N1病毒是在1997年香港爆发H5N1期间从死水鸭(teal)中分离的。这个病毒的基因分析揭示它具有与致病性H5N1病毒株有97％以上核苷酸同源性的七个节段。从感染的尿囊液中提取RNA，RT-PCR扩增的cDNAs插入pHW2000；这个插入产生八个表达质粒(图3)。pHW241-PB2，pHW242-PB1，pHW243-PA，pHW244-HA，pHW245-NP，pHW246-NA，pHW247-M和pHW248-NS(每个1μg)转染共培养的293T-MDCK细胞后七十二小时，在MDCK细胞中观察到病毒诱导的细胞病变作用(表1)。转染细胞上清的病毒产量是每毫升2×10⁵个感染性病毒。如图4(A和B，泳道2)所示，NS节段的表征证实了回收病毒的同一性。这些结果说明这个质粒系统仅需要克隆八个cDNA到一个质粒载体中，八个表达质粒转染允许回收具有已不适应在哺乳动物细胞中生长的病毒的抗原性的甲型流感病毒。
重配甲型流感病毒的回收。检测八个质粒系统产生重配病毒的效用。因为这个DNA转染系统不需要任何选择系统，所以重配病毒的回收应该可通过转染反应中适当组合表达质粒而完成。含A/Teal/HK/W312/97(H6N1)cDNA的七个表达质粒与含A/WSN/33(H1N1)cDNA的一个表达质粒共转染(表2)。含teal病毒的七个节段和WSN病毒的M节段或NS节段的重配病毒得到了高病毒产量。NA和HA重配病毒得到的病毒产量低(表2)。因为用八个质粒系统拯救单一重配病毒，所以下一步是确定用来自一个病毒的多个节段是否能够拯救病毒。因此，含H6N1病毒的RNP复合体基因cDNA的四个表达质粒(pHW241-PB2，pHW242-PB1，pHW243-PA和pHW245-NP)与含WSN病毒cDNA的质粒pHW184-HA，pHW186-NA，pHW187-M和pHW188-NS一起转染(表2)。每毫升细胞上清回收4×10⁶个病毒。如图4所示(泳道10)，扩增的四重重配病毒的NS节段被NcoI切割；因此，NS节段源自WSN病毒。这些结果表明八个质粒转染系统允许回收单一和四重重配病毒。
表2.八个质粒共转染产生A/Teal/HK/W312(H6N1)和A/WSN/33(H1N1)之间的重配甲型流感病毒

*含A/WSN/33(H1N1)cDNA的质粒用粗体显示
§数字代表转染后72h测定的每毫升转染细胞上清中感染性病毒颗粒
讨论
含A/Teal/HK/W312/97(H6N1)或A/WSN/33(H1N1)的八个表达质粒转染后拯救甲型流感病毒的能力证明pol I-pol II转录系统提供了形成感染性甲型流感病毒的足够量的vRNA和病毒蛋白。合成了非编码区不同的两种类型mRNAs(图1)。编码所有病毒蛋白的mRNA类型被pol II直接转录。除了含非编码区(NCR)的流感病毒序列，这些mRNAs还含有来自pol I启动子和鼠终止子区的序列。重要的是，开发的polI-pol II表达系统仅含33bp的鼠终止子序列。使用报道基因氯霉素乙酰转移酶(CAT)和绿色荧光蛋白(GFP)的以前的研究表明174bp的终止子区的序列降低pol II介导的蛋白表达(Hoffmann，E.，Ph.D.Thesis 1997，Justus Liebig University，Giessen，德国)。第二种mRNA类型产生于病毒复制和转录过程启动后(图2)。这种mRNA是由病毒聚合酶蛋白合成的且在流感病毒非编码序列前含有通过帽攫取(cap snatching)来自细胞RNAs的5帽结构。从这两种mRNAs翻译的结构蛋白与RNP复合体结合形成新的病毒颗粒。转染病毒出芽之后，产生的病毒颗粒接着可在293T细胞和共培养的MDCK细胞中复制。
与在前述“发明背景”中讨论的方法不同，本发明的方法在八个质粒中使用了八个cDNAs，含有225bp的pol I启动子序列和33bp终止子序列。在pol I-pol II系统中，所有10个病毒蛋白从截短的人巨细胞病毒的立早启动子表达。17个质粒系统(Neumann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999，96：9345)和8个质粒系统(本研究)的所有结构蛋白表达结果比表达RNP复合蛋白的质粒共转染(Neumann等，前述；Fodor等，J.Virol.1999，73：9679)的病毒回收效率高的事实支持转染后提供HA，NA，M1，M2，和NS2蛋白可增加感染性甲型流感病毒的产生的想法。
病毒复制循环包括病毒蛋白彼此之间和与细胞因子之间复杂的相互作用(Ludwig等，Virol.Immunol.1999，12：175)。因此，对于感染性病毒的产生，质粒驱动的病毒分子合成应该提供启动复制循环和形成病毒样颗粒的最佳浓度的病毒蛋白。尽管八个质粒系统证明是有效的，还可能进一步增加病毒的产生。已经表明表达RNP复合蛋白的转染质粒与M1蛋白的表达之间的比率影响转录酶的活性(Pleschka等，J.Virol.1996，70：4188；Perez和Donis，Virology 1998，249：52)。形成病毒样颗粒的效率也依赖于结构病毒蛋白的浓度(Mena等，J.Virol.1996，70：5016；Gomez-Puertas等，J.Gen.Virol.，1999，80：1635；Neumann等，J.Virol.2000，74：547)。改变转染反应中使用的质粒浓度或使用含不同pol II启动子的表达质粒可能因此进一步增加用polI-pol II系统产生感染性病毒的效率。因为细胞因子介导的剪接效率影响流感病毒复制的能力(Lau和Scholtissek，Virology 1995，212：225)，所以使用293T以外的细胞系可能增加某些甲型流感病毒株的病毒产量。四重重配的病毒产量高(表2)与HA，NA和M节段介导培养细胞中A/WSN/33(H1N1)快速复制的发现相一致(Goto和Kawaoka，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1998，95：10224；Schulman和Palese，J.Virol.1977，24：170；Yesuda等，J.Virol.1994，68：8141)。
鸟H6N1病毒和人H1N1病毒间的有活力重配体的产生表明这个H6N1病毒可从远缘病毒中获取基因节段。基因分析表明致病性H5N1病毒是由重配产生的(Xu等，Virology 1999，261：15)。在H6N1和H9N2亚型中发现了H5N1样基因节段(Guan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999，96：9363)，表明这些病毒可能是致病性H5N1病毒前体。可产生新致病性流感病毒的重配事件可能在将来发生。然而，本研究开发的简化方法产生和操作这些病毒的能力将帮助研究者们更好地理解这些新病毒的生物性能和开发有效的疫苗保护人群对抗它们。新致病性株的出现和制备疫苗之间的时间段的长度在疫苗接种程序的有效性中是决定性的变量。仅克隆八个质粒产生病毒的能力减少了产生有效疫苗候选者所需的时间并通过简化病毒产生和降低制备疫苗的整体费用而改进了现有的反向遗传系统。
在pol I启动子和pol II启动子之间将病毒cDNA导入真核细胞回收病毒的想法也适用于产生正粘病毒科的其它成员。对于乙型流感病毒疫苗，这个策略将需要构建和共转染八个病毒；对于丙型流感，七个；对于Thogotovirus，六个。5’带帽mRNA以及来自相同cDNA模板的vRNA的体内转录也可以简化其它RNA病毒的基于质粒的系统或甚至利于其它科病毒的pol I-pol II系统的建立(如Arenaviridae，Bunyaviridae)。
实施例3：完全从克隆cDNA产生乙型流感病毒的RNA pol I/pol II系统
甲型和乙型流感病毒均含有负极性单链RNA的八个节段(见综述Lamb和Krug，″Orthomyxoviridae：The viruses and theirreplication″；Fields(编)，Virology；1353-1395页)。与甲型流感病毒不同，乙型流感病毒的八个节段编码11个蛋白。三个最大的基因编码RNA聚合酶的成分，PB1，PB2和PA；节段4编码血凝素。节段5编码核蛋白，与病毒RNA有关的主要结构成分；节段6编码神经氨酸酶(NA)和NP蛋白。两种蛋白NB和NA，是从双顺反子mRNA的重叠阅读框架翻译的。乙型流感病毒的节段7也编码两种蛋白：BM1和BM2。最小的节段编码两个产物：NS1从全长RNA翻译而来，而NS2从剪接的mRNA翻译。
含乙型流感病毒cDNA的表达质粒构建包括产生甲型流感病毒A/teal/HK/W312/97(H6N1)所述的相同策略。第一个RNA从感染的尿囊液得到的病毒颗粒如B/Lee/40中分离。基于该非编码区的保守序列，制备RT-PCR的引物并用于合成cDNA。在那些引物的5’末端含有BsmBI或BsaI限制性内切酶的序列。用BsmBI或BsaI消化PCR产物允许插入用BsmBI线性化的克隆载体pHW2000(或pHW11)中。为了确保质粒中cDNAs不含由于PCR过程中聚合酶造成错误的不期望的突变，必须对构建体进行测序。
共培养293T-MDCK细胞(或COS-1-MDCK)细胞的共转染和添加胰蛋白酶导致感染性乙型流感病毒产生。转染细胞的上清接着传代到新的MDCK细胞上。用标准方法可测定所得病毒滴度，如HA试验和空斑实验。用每个基因节段的特异性引物进行RT-PCR允许从重组乙型流感病毒扩增RNA。产物测序证实产生的病毒确实是期望的流感病毒。
实施例4：甲型流感病毒原株的八个质粒拯救系统
为了确定这个基于质粒的系统产生疫苗的商业实用性，我们如实施例2所述完全从克隆cDNAs中产生了原株A/PR/8/34(H1N1)-现在用于制备灭活疫苗。重组病毒传代给卵后用HA实验测定的病毒产量与亲本野生型病毒的病毒产量一样高。这些结果证明产生的重组病毒与亲本卵生长病毒具有相同的生长性能，表明八个质粒转染方法具有改善当前使用的制备疫苗病毒的方法的潜力。
材料和方法
病毒和转染.从St.Jude儿童研究医院的贮藏库得到流感病毒A/PR/8/34(H1N1)并在10日龄含胚鸡卵中增殖。Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞在含10％FBS的MEM中维持。293T人胚肾细胞和Vero细胞在含5％胎牛血清(FBS)的Opti-MEMI(Life Technologies，Gaithersburg，MD)中培养。对于转染实验，使用六孔组织培养板。共培养MDCK和293T细胞(每孔0.21×10⁶个每种细胞)用于转染实验。根据制造商的说明使用TransIT LT-1(Panvera，Madison，WI)用于转染细胞。简言之，每1μg DNA 2μl TransIT LT-1混合，室温培养45分钟，并加入到细胞中。六个小时后，用Opti-MEM I替换DNA转染混合物。转染后二十四小时，含TPCK-胰蛋白酶的1ml Opti-MEM I加入细胞中；添加使得细胞上清中TPCK-胰蛋白酶的终浓度是0.5μg/ml。通过空斑实验于MDCK细胞上传代上清确定病毒滴度。
RT-PCR和质粒的构建.用Qiagen Rneasy试剂盒从20μl含病毒的受孕卵尿囊液中提取病毒RNA。利用两步RT-PCR扩增病毒基因的每个节段。简言之，根据提供的方案使用AMV逆转录酶(RocheDiagnostics，Germany)将RNA转录为cDNA，然后使用Expand高保真PCR系统(Roche Diagnostics，Gennany)扩增cDNA。扩增程序开始于94℃2分钟1个循环；随后94℃20秒、54℃30秒、72℃3分钟的30个循环；以72℃5分钟1个循环结束程序。使用的引物含有BsaI或BsmBI的序列以允许将消化的PCR片段精确插入到克隆载体pHW2000中(见实施例2)。
对于HA，NP，NA，M，NS基因的克隆，用BsmBI或BsaI消化PCR片段并连接到克隆载体pHW2000中。对于P基因的克隆，分离、消化两个(PB2，PA)或三个(PB1)节段并连接到pHW2000-BsmBI中。为了确保基因不含不期望的突变，测序PCR得到的片段。含A/PR/8/34(H1N1)全长cDNA的八个质粒记做pHW191-PB2，pHW192-PB1，pHW193-PA，pHW194-HA，pHW195-NP，pHW196-NA，pHW197-M和pHW198-NS。St.Jude儿童研究医院的生物技术中心使用含AmpliTaqDNA聚合酶FS(Perkin-Elmer，Applied Biosystems，Inc.[PE/ABI]，Foster City，CA)和合成寡核苷酸的碱性蕊香红或d碱性蕊香红染色的终止循环测序预备反应试剂盒测定模板DNA的序列。样品接受电泳，检测和在PE/ABI 373型，373型Stretch或377型DNA测序仪上分析。
结果
为了允许细胞内合成病毒样vRNAs和mRNAs，我们已建立了RNA polI-pol II表达系统(见实施例2)。在这个系统中，病毒cDNA插在人RNA聚合酶I(pol I)启动子和终止子序列之间。这个完整的pol I转录单位侧翼与RNA聚合酶II(pol II)启动子和多聚(A)位点相连。两个转录单位的定位允许从一个病毒cDNA模板合成负义病毒RNA和正义mRNA。这个pol I-pol II系统开始于从其自己的启动子转录两个细胞RNA聚合酶的启动，推测在核内不同的隔室(见图1)。八个质粒转染到293T细胞导致源自细胞和病毒转录核翻译装置的所有分子的相互作用，最终产生感染性甲型流感病毒。这个系统证明对于形成A/WSN/33(H1N1)和A/Teal/HK/W312/97(H6N1)流感病毒很有效(实施例2)。
由于当前制备灭活流感病毒疫苗的原株是A/PR/8/34(H1N1)，我们试图完全从克隆cDNA产生这个病毒。具有八个RNA节段的cDNAs插入载体pHW2000。所得质粒(pHW 191-PB2，pHW 192-PB1，pHW 193-PA，pHW 194-HA，pHW 195-NP，pHW196-NA，pHW197-M和pHW198-NS)转染到共培养的293T-MDCK或Vero-MDCK细胞。转染后72小时在MDCK细胞中滴定来测定病毒滴度。每毫升共培养Vero-MDCK细胞上清含有1×10⁴pfu，每毫升共培养293T-MDCK细胞上清含有2×10⁶pfu。293T-MDCK细胞的产量高很可能是由293T细胞与Vero细胞相比，转染效率高引起的。这些结果表明八个质粒细胞允许从克隆cDNA产生A/PR/8/34(H1N1)。
为了比较野生型病毒和产生的重组病毒的生长，将鸡含胚卵接种野生型病毒或重组病毒。感染后48小时收获尿囊液。HA实验确定病毒产量。尽管HA滴度在各个卵间不同，我们发现两种病毒都具有5120和10240血细胞凝集单位间的HA滴度，表明两种病毒都是高产量分离株。因此，DNA转染产生的重组病毒具有与亲本分离株相同的健康培养表型。
讨论
本发明的八个质粒系统避免了使用蛋白表达的分开的质粒(见发明背景)，因此简化了完全从克隆cDNA产生甲型流感病毒的方法。疫苗的制备包括产生用作病毒种子在卵中或细胞培养中制备疫苗的病毒。疫苗接种程序的有效性依赖于选择与传播致病株紧密匹配的亚型来刺激接种人群产生高特异性抗体效价，引起有效保护。编码内部甲型流感病毒基因的六个A/PR/8/34原质粒(pHW191-PB2，pHW192-PB1，pHW193-PA，pHW195-NP，pHW197-M和pHW198-NS)现在可用于与编码当前传播株的糖蛋白HA和NA的质粒共转染。操作每个基因节段的能力也允许我们估计哪个基因节段对卵中或细胞培养中重配病毒的高产生长是重要的。
我们能够仅用八个质粒共转染产生两个实验室流感病毒株(A/WSN/33(H1N1)和A/PR/8/34(H1N1))和一个野生分离株(A/Teal/HK/W312/97(H6N1))的事实表明这个系统适用于开发减毒活流感疫苗。鼻内给予减毒活流感病毒疫苗诱导局部、粘膜的细胞介导的免疫和体液免疫。含有减毒活流感A/Ann Arbor/6/60(H2N2)的六个内部基因和同期野生型流感病毒的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的冷适应(ca)重配(CR)病毒看来被可靠减毒。已经表明这个疫苗对儿童和年轻成人有效(Keitel和Piedra，Textbook of Influenza，Nicholson等编，1998，373-390)。然而，它可能过度减毒而不能刺激过中年的人引起理想的免疫反应，在美国每年有20,000-40,000个个体的大群体由于流感感染而死亡。仍未很好确定每个节段对减毒表型的贡献(Keitel和Piedra，前述)。只有通过将特定的确定的减毒突变顺序导入病毒中才可获得这个信息。由于详细的分析需要测试大量的操作病毒，仅八个质粒的构建和转染简化了这个工作并减少了达到这个目的的时间和费用。
实施例5：用于从八个质粒产生甲型流感病毒的单向RNA聚合酶I-聚合酶II转录系统
前面的实施例描述了通过共转染仅八个质粒产生甲型流感病毒的系统，由它表达了负义vRNA和正义mRNA(这个工作随后发表了；见Hoffmann等，2000，Proceedings of the National Academy ofSciences，USA 97，6108-6113)。这个实施例描述了表达病毒样RNAs的不同的转录系统的建立，允许从一条模板细胞内合成不带帽正义cRNA和5’带帽mRNA。含A/WSN/33(H1N1)cDNA的八个RNA pol I-pol II串联启动子质粒共转染导致感染性甲型流感病毒产生，尽管比双向系统的病毒产量低。我们的由最少质粒组细胞内产生vRNA和mRNA或cRNA和mRNA的方法可用于建立或优化其它RNA病毒的反向遗传系统。
这个实施例中报道的结果发表了(见Hoffmann和Webster，J.Gen.Virol.2000，81：2843)。
对于负义RNA病毒的产生，负义vRNA或正义cRNA可作为模板。为了减少病毒回收所需的质粒数量，我们思考或许可能用细胞RNA polI和pol II从一条模板合成cRNA和mRNA。因此，我们尝试开发单向pol I-pol II转录系统(图5)。病毒cDNA以正义方向插在RNA polI启动子和终止子序列之间。整个pol I转录单位以正义方向插在RNApol II启动子和聚腺苷酸位点之间(图5)。不象在我们的双向转录系统产生的负义vRNA和正义mRNA(图1)，这里期望合成两种类型的正义RNAs。从pol II启动子，带5’帽结构的mRNA应该在核质中转录。这种转录应该翻译为蛋白。在核仁中，期望细胞pol I合成在5’末端具有三磷酸基的全长正义流感病毒cRNA(图5)。构建了克隆载体pHW11，它可用于插入任意cDNA节段(图6)。这个质粒含有位于pol I终止子序列和多聚(A)位点上游的pol II启动子(人巨细胞病毒的立早启动子)和人pol I启动子。
为了检测从单一模板合成cRNA和mRNA是否可产生感染性甲型流感病毒，我们构建了八个质粒。质粒pHW171-PB2，pHW172-PB1，pHW173-PA，pHW174-HA，pHW175-NP，pHW176-NA，pHW177-M和pHW178-NS含有具有甲型流感病毒株A/WSN/33(H1N1)的八个基因节段的cDNAs。所有这些cDNAs相对于pol I和POL II启动子为正义反向。八个质粒(每个质粒1μg)如实施例2所述转染给有或没有MDCK细胞共培养的293T或COS-1细胞。
MDCK细胞上传代后，用空斑试验在不同的时间确定转染细胞上清中的病毒产量。转染后四十八小时产生了2-5×10³个感染性病毒粒体(表3)。转染后七十二小时，转染293T后上清含4×10⁴pfu/ml或转染COS-1细胞后含2×10⁴pfu/ml。293T细胞或COS-1细胞与MDCK细胞共培养，72h后病毒产量可增加(表3)。
病毒的产生证明八个质粒转染后，RNA pol I合成了八个不带帽正义cRNAs。与裸露病毒样cRNAs结合形成cRNPs的细胞RNA pol II合成的转录物翻译为四个病毒聚合酶蛋白。聚合酶单位PB1对识别末端结构和结合病毒样cRNAs很重要(Gonzalez和Ortin，EMBO J.1999，18：3767；Gonzalez和Ortin，J.Virol.1999，73：631；和1999b；Li等，EMBO J.1998，17：5844)。与其它聚合酶蛋白的相互作用开始了复制-转录循环，导致vRNPs和病毒mRNAs合成(Toyoda等，J.Gen.Virol.1996，77：2149；Gonzalez等，Nucl.Acids Res.1996，29：4456)。在pol I-pol II转录系统中，合成了两种不同类型的mRNA。一种由RNA pol II直接从质粒DNA转录且在5’末端含有225nt pol I启动子序列和在3’末端含有pol I终止序列。另一种mRNA由用vRNA作为模板的病毒聚合酶复合蛋白合成。这个mRNA的5’帽结构是帽攫取机制所需的，其中聚合酶亚单位PB2从细胞RNAs取走帽(Ulmanen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1981，21：3607)。尽管两种mRNA类型在其5’和3’非编码区不同，但它们对所有病毒蛋白含有相同的开放阅读框架。翻译的结构蛋白连同vRNPs装配产生感染性甲型流感病毒。

*含单向转录单位的质粒和含双向转录单位的质粒(图1)含代表A/WSN/33(H1N1)的八个基因节段的cDNAs。
#转染没有或有MDCK细胞共培养的293T或COS-1细胞。
由polI或polI合成的RNA转录物。
§在转染后指出的时间(24h，48h，72h)在MDCK细胞上用空斑试验测定上清的病毒滴度。
尽管证明从八个串联启动子质粒转染的细胞中产生WSN病毒是十分可靠的，但是这个cRNA-mRNA方法的病毒产量低于产生vRNA和mRNA转录物的双向系统(表3)。用含双向pol I-pol II转录系统的八个质粒(图1；实施例2；见Hoffmann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2000，97：6108；pHW181-PB2，pHW182-PB1，pHW183-PA，pHW184-HA，pHW185-NP，pHW186-NA，pHW187-M和pHW188-NS)转染293T或COS-1细胞后七十二小时，病毒滴度是1×10⁷pfu/ml(表3)。COS-1或293T细胞转染后二十四小时，上清中发现0.4-1×10³pfu/ml。这些数据表明八个质粒双向系统与需要12或17质粒共转染的更复杂和麻烦的多质粒系统具有动力学类似的相同病毒产生效率(Neumann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1999，96：9345)。
八个串联启动子质粒转染后24小时没有发现感染性病毒(表3)。这些结果表明vRNA-mRNA和cRNA-mRNA方法间病毒产量的不同是由于原始pol I转录物的极性不同。双向系统从细胞内合成vRNA开始，是类似自然甲型流感病毒感染的情况，其中vRNPs运输到核中且vRNAs最初作为mRNA和cRNA合成的模板。在单向系统中，cRNPs是产生的第一个能够复制的单位。为了产生mRNAs，cRNAs不得不复制为vRNAs，vRNPs最终包装到后代病毒颗粒中(Hsu等，J.Gen.Virol.1987，77：2575)。由于从cRNPs产生vRNPs需要另外的反应，单向系统中病毒形成发生的时间晚于双向系统病毒形成的时间。
两个系统病毒产量不同的其它可能的原因是cDNA中的序列元件通过终止转录降低了转录效率，或RNA转录物中的序列降低了稳定状态的pol I或pol II转录物的水平。八个病毒样cRNAs或mRNAs中仅一个的浓度低降低了这个系统的整体效率，因为所有vRNPs和结构蛋白必须在病毒复制和病毒装配最佳的浓度下合成。
八个质粒系统产生流感病毒A的高效率表明这个系统可应用于其它正粘病毒，如乙型流感病毒、丙型流感病毒和Thogotovirus。本研究的结果表明vRNA-mRNA系统将是从质粒产生这些病毒的最有效的方法。本发明允许建立基于pol I的系统产生正粘病毒科成员以外的RNA病毒，如副粘病毒科，Arenaviridae或Bunyaviridae的成员(Roberts，A.和Rose，J.K.，Virology 1998，247：1-6；Bridgen和Elliot，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996，93：15400；Lee等，J.Virol.2000，74：3470)。与正粘病毒不同，多数RNA病毒在感染细胞的细胞质中复制。在其进化过程中，这些病毒的RNAs没有经历在核中发现的选择压力，如剪接。通常，非节段化负链RNA病毒的反向遗传系统是基于从T7启动子进行细胞内转录，如Conzelmann和同事开拓的狂犬病病毒的回收(Schnell等，EMBO J.1994，13：4195)。病毒样RNAs的表达是由T7 RNA聚合酶驱动的，通过用重组痘苗病毒感染或使用组成表达T7 RNA聚合酶的细胞系。与在核内发生的pol I转录不同，由T7 RNA聚合酶的转录发生在细胞质中。使用细胞质RNA病毒的pol I转录系统将需要RNA转录物必须转运到核外。含内部核糖体进入位点插在其5’非编码区的pol I转录物的细胞中蛋白产生的检测支持pol I转录物确实被转运到核外(Palmer等，Nucl.Acids.Res.1993，21：3451)。由于对输出或保留pol I转录物起决定性的序列的信息有限，负义或正义RNAs的合成可能导致核输出的效率不同。此外，pol II产生的大冠形病毒样转录物(大于30,000nts)从核中输出(Almazan等，Proc.Natl.Acad Sci.USA 2000，97：5516)表明特异性RNA序列而不是转录物的长度可能对输出更关键。我们发展的pol I-pol II克隆载体和基于使用II型限制性核酸内切酶的有效克隆方法将允许以合理的费用和在合理的时间内在核中合成正和负义RNA来产生细胞质RNA病毒。
***
这里描述的具体实施方案不限制本发明的范围。事实上，除了这里描述的那些，从前面的说明书和随同的附图，本发明的各种变型将对本领域技术人员变得很明显。这种变型意欲落在所附权利要求的范围内。
应该进一步理解所有值是近似的，提供用于说明。
所有专利、专利申请、出版物和这里引用的其它材料以其完整形式由此引入这里作为参考。
本申请还公开了以下内容：
1.表达质粒，含有插在RNA聚合酶II(pol II)启动子和多腺苷酸化信号之间的RNA聚合酶I(pol I)启动子和pol I终止子序列。
2.项目1的表达质粒，其中pol I启动子接近多腺苷酸化信号且pol I终止子序列接近pol II启动子。
3.项目1的表达质粒，其中pol I启动子接近pol II启动子且pol I终止子序列接近多腺苷酸化信号。
4.项目1的表达质粒，其中该质粒对应于具有选自pHW2000，pHW11和pHW12的图谱的质粒。
5.项目1的表达质粒，进一步包含插在pol I启动子和终止信号之间的负链RNA病毒病毒基因节段。
6.项目5的表达质粒，其中负链RNA病毒是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的成员。
7.项目6的表达质粒，其中病毒是甲型流感病毒。
8.项目7的表达质粒，其中病毒基因节段编码选自病毒聚合酶复合蛋白、M蛋白和NS蛋白的基因；其中该基因源自很好地适应在细胞培养中生长的株或减毒株，或二者皆有。
9.项目6的表达质粒，其中病毒是乙型流感病毒。
10.项目8的表达质粒，其中该质粒具有选自pHW241-PB2，pHW242-PB1，pHW243-PA，pHW245-NP，pHW247-M和pHW248-NS的图谱。
11.项目8的表达质粒，其中该质粒具有选自pHW181-PB2，pHW182-PB1，pHW183-PA，pHW185-NP，pHW187-M和pHW188-NS的图谱。
12.项目7的表达质粒，其中病毒基因节段编码选自流感血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因的基因。
13.项目12的表达质粒，其中流感基因来自致病性流感病毒株。
14.项目12的表达质粒，其中该质粒具有选自pHW244-HA，pHW246-NA，pHW184-HA和pHW186-NA的图谱。
15.用于从克隆的病毒cDNA产生感染性负链RNA病毒的基于最少质粒的系统，包括一组质粒，其中每个质粒包含一个自主的病毒基因组节段，且其中对应于自主病毒基因组节段的病毒cDNA插在RNA聚合酶I(pol I)启动子和终止子序列之间，由此导致vRNA表达；pol I启动子和终止子序列又插在RNA聚合酶II(pol II)启动子和多腺苷酸化信号之间，由此导致病毒mRNA表达。
16.项目15的基于最少质粒的系统，其中pol I启动子接近多腺苷酸化信号且pol I终止子序列接近pol II启动子。
17.项目15的基于最少质粒的系统，其中pol I启动子接近pol II启动子且pol I终止子序列接近多腺苷酸化信号。
18.项目15的基于最少质粒的系统，其中负链RNA病毒是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的成员。
19.项目18的基于质粒的系统，其中病毒是甲型流感病毒。
20.项目18的基于质粒的系统，其中病毒是乙型流感病毒。
21.项目19的基于质粒的系统，其中病毒基因节段编码选自病毒聚合酶复合蛋白、M蛋白和NS蛋白的蛋白；其中所述基因来自很好地适应在细胞培养中生长的株或来自减毒株，或二者皆有。
22.项目19的基于质粒的系统，其中病毒基因组节段包含编码选自血凝素和神经氨酸酶的蛋白或这两者的基因；其中所述的基因来自致病性流感病毒。
23.项目19的基于质粒的系统，其中所述的系统包含一个或多个具有选自pHW241-PB2，pHW242-PB1，pHW243-PA，pHW244-HA，pHW245-NP，pHW246-NA，pHW247-M和pHW248-NS的图谱的质粒。
24.项目19的基于质粒的系统，其中所述的系统包含一个或多个具有选自pHW181-PB2，pHW182-PB1，pHW183-PA，pHW184-HA，pHW185-NP，pHW186-NA，pHW187-M和pHW188-NS的图谱的质粒。
25.包含项目15的基于质粒的系统的宿主细胞。
26.包含项目18的基于质粒的系统的宿主细胞。
27.包含项目19的基于质粒的系统的宿主细胞。
28.包含项目22的基于质粒的系统的宿主细胞。
29.制备负链RNA病毒的病毒粒体的方法，该方法包括在允许病毒蛋白和vRNA或cRNA产生的条件下培养项目25的宿主细胞。
30.制备正粘病毒科(Orthomyxoviridae)病毒粒体的方法，该方法包括在允许病毒蛋白和vRNA或cRNA产生的条件下培养项目26的宿主细胞。
31.制备流感病毒粒体的方法，该方法包括在允许病毒蛋白和vRNA或cRNA产生的条件下培养项目27的宿主细胞。
32.制备致病性流感病毒粒体的方法，该方法包括在允许病毒蛋白和vRNA或cRNA产生的条件下培养项目28的宿主细胞。
33.制备负链RNA病毒特异性疫苗的方法，该方法包括纯化由项目29的方法制备的病毒粒体。
34.根据项目33的方法，进一步包括灭活该病毒粒体。
35.根据项目33的方法，其中负链RNA病毒是减毒病毒。
36.给受试者接种疫苗对抗负链RNA感染的方法，该方法包括将保护性剂量的项目33的疫苗施用给受试者。
37.给受试者接种疫苗对抗负链RNA感染的方法，该方法包括给受试者肌肉内注射保护性剂量的项目33的疫苗。
38.给受试者接种疫苗对抗负链RNA感染的方法，该方法包括将项目33的疫苗鼻内施用给受试者。
39.产生减毒负链RNA病毒的方法，该方法包括：
(a)使项目15的基于质粒的系统中的一个或多个病毒基因突变；和
(b)确定该系统产生的感染性RNA病毒是否被减毒。
40.含负链RNA病毒病毒粒体的组合物，其中病毒粒体的病毒内部蛋白来自很好地适应在培养中生长的株或来自减毒株，或二者皆有，而且该病毒粒体的病毒抗原蛋白来自致病性病毒株。
41.含用项目29的方法制备的负链RNA病毒病毒粒体的组合物。
序列表
<110>St.Jude Children’s HospitalHoffmann，Erich
<120>用于产生感染性流感病毒的DNA转染系统
<130>2427/2G772WO
<140>PCT/US01/13656
<141>2001-04-27
<160>21
<170>PatentIn version 3.1
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agcaaaagca gg                                12