人5HTSUB7/SUB受体启动子序列.pdf

本发明提供一种构成人5HT7受体启动子的分离的核酸分子。也公开了其包括增强子和/或效应元件例如NcoI或BARBIE的片段及其重组体的用途。因此，本发明的一个更进一步的方面是提供重组DNA分子，其中依照本发明的核苷酸与可检测产物例如萤光素酶基因或CAT基因有效连接。还提供基于细胞的筛选试验，用于鉴定调节与人5HT7受体启动子或其活性片段有效连接的基因的表达水平的化合物。

1.  一种分离的核酸分子，所述核酸分子选自：
(a)SEQ ID No：1的核苷酸1-3081，或其显示5HT₇受体启动子活性的片段；
(b)(a)的互补链；和
(c)能够在严格条件下与(a)或(b)所定义的核苷酸序列杂交的核酸。

2.  权利要求1的5-HT₇受体启动子区的分离的调节元件，所述调节元件包含选自以下的序列：
(a)SEQ ID No：1中位置-27至-110即SEQ ID No：2所示的核苷酸序列，或其显示5-HT₇受体增强子活性的片段；
(b)SEQ ID No：1中位置-925至-939即SEQ ID No：3所示的核苷酸序列，或其显示巴比妥盐诱导型元件活性的片段；
(c)SEQ ID No：1中位置-50至-80即SEQ ID No：4所示的核苷酸序列，或其显示5-HT₇受体启动子调节活性的片段；
(d)SEQ ID No：1中位置-X至-Y即SEQ ID No：6所示的核苷酸序列，或其显示5-HT₇受体启动子调节活性的片段；
(e)(a)、(b)、(c)或(d)的互补链；和
(f)能够在严格性杂交条件下与(a)、(b)、(c)或(d)所定义的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

3.  一种重组DNA分子，所述重组DNA分子包含权利要求1或2的分离的核酸分子。

4.  权利要求2的重组DNA分子，其中所述分离的核酸分子是83bp NcoI片段即SEQ ID No：2、BARBIE元件即SEQ ID No：3或233bp富含GC的基序即SEQ ID No：6。

5.  权利要求3或4的重组DNA分子，其中权利要求1的分离的核酸分子与编码可检测产物的核酸分子有效连接。

6.  权利要求4的重组DNA分子，其中所述分离的核酸分子与包含最小启动子的报道质粒有效连接。

7.  权利要求5或6的重组DNA分子，其中所述编码可检测产物的核酸分子选自编码5HT₇受体多肽的核酸序列或报道基因。

8.  权利要求7的重组DNA分子，其中所述报道基因选自萤火虫萤光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因、碱性磷酸酶基因、细菌氯霉素乙酰转移酶基因和绿色荧光蛋白基因。

9.  权利要求5-8中任一项的重组DNA分子，其中所述报道基因是萤火虫萤光素酶基因。

10.  一种载体，所述载体包含权利要求3-8中任一项的重组DNA分子。

11.  权利要求10的载体，其中所述载体是表达载体。

12.  一种宿主细胞，所述宿主细胞用权利要求10或11的载体转化。

13.  权利要求12的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞。

14.  权利要求12的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞。

15.  权利要求14的宿主细胞，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞，优选HEK293细胞、NS20Y细胞或N2A细胞。

16.  一种用于鉴定作为人5HT₇受体启动子活性调节剂的化合物的方法，所述方法包括：
(a)使包含权利要求3-8中任一项的重组DNA分子的宿主细胞与试验化合物接触；和
(b)确定所述试验化合物是否调节所述可检测产物的表达水平。

17.  权利要求16的方法，其中所述可检测产物是5HT₇受体蛋白或选自以下的报道基因：萤火虫萤光素酶、β-半乳糖苷酶基因、细菌氯霉素乙酰转移酶基因和绿色荧光蛋白基因。

18.  一种用于鉴定能够调节5HT₇受体启动子增强子活性的化合物的方法，所述方法包括：
(a)使用重组DNA分子转染的宿主细胞与试验化合物接触，所述重组DNA分子包含与可检测产物有效连接的83bp NcoI-片段即SEQID No：2；和
(b)确定所述试验化合物是否调节所述可检测产物的表达水平。

19.  一种用于鉴定能够调节5HT₇受体启动子区内巴比妥盐诱导型元件活性的化合物的方法，所述方法包括：
(a)使用重组DNA分子转染的宿主细胞与试验化合物接触，所述重组DNA分子包含与可检测产物有效连接的BARBIE元件即SEQ IDNo：3；和
(b)确定所述试验化合物是否调节所述可检测产物的表达水平。

20.  一种用于鉴定能够调节5HT₇受体启动子区内巴比妥盐诱导型元件活性的化合物的方法，所述方法包括：
(a)使用重组DNA分子转染的宿主细胞与试验化合物接触，所述重组DNA分子包含与可检测产物有效连接的富含GC的基序即SEQID No：6；和
(b)确定所述试验化合物是否调节所述可检测产物的表达水平。

21.  一种用于鉴定能够调节5HT₇受体启动子增强子活性的化合物的方法，所述方法包括：(a)在转录因子AP2存在下，使包含83bpNcoI-片段即SEQ ID No：2的重组DNA分子与试验化合物接触；和(b)确定所述试验化合物是否影响所述转录因子与83bp增强子区即SEQID No：2的结合。

22.  一种用于鉴定能够调节5HT₇受体启动子增强子活性的化合物的方法，所述方法包括：(a)在转录因子Sp1或Egr-1存在下，使包含富含GC的基序即SEQ ID No：6的重组DNA分子与试验化合物接触；和(b)确定所述试验化合物是否影响所述转录因子与所述富含GC的基序即SEQ ID No：6的结合。

23.  一种用于鉴定多肽的方法，所述多肽与参与5-羟色胺介导反应相关的生物途径的核苷酸序列结合，所述方法包括下述步骤：
(a)用权利要求3-8中任一项的重组DNA分子转染宿主细胞系；
(b)用多种人cDNA序列转染所述宿主细胞系；
(c)鉴定并分离所述报道基因的表达水平有改变的细胞；
(d)从步骤(c)所分离的细胞中回收cDNA；和
(e)鉴定步骤(d)回收的cDNA所表达的多肽。

人5-HT₇受体启动子序列
本申请为分案申请，原申请的申请日为2003年5月26日，申请号为03812246.4(PCT/EP03/05511)，发明名称为“人5-HT7受体启动子序列”。
本发明涉及分离的人5-HT₇受体启动子区。本发明还涉及调节人5-HT₇受体表达的试剂的筛选方法，因此本发明对于治疗5-羟色胺介导反应相关性医学病症具有潜在的应用价值，这些医学病症例如精神分裂症、抑郁症、偏头痛、情感障碍、睡眠障碍和胃肠功能失调。
发明背景
就介导细胞活性的受体补体而论，5-羟色胺(5-HT)系统可能是脊椎动物中枢神经系统(CNS)中最多样化神经递质系统。迄今为止，已有14种5-羟色胺(5-HT)受体被克隆出来，并被分为7个5-HT受体亚型。除5-HT₃受体(一种配体门控的离子通道)外，5-HT受体属于G蛋白偶联受体(GPCR)超家族。其中，5-HT₇受体是最近才被克隆出来的，尽管由于它独特的药理学性质，人们一直猜想其存在。原位杂交和配体-结合方法已绘制出5-HT₇受体在CNS中的分布，并揭示其在丘脑、下丘脑和海马中分布最丰富，而在大脑皮质和扁桃体中水平较低(Vanhoenacker等，2000)。
尽管这项研究深入了解了5-HT₇受体的定位，但有关这些受体的生理作用的报道却比较少。基于非选择性配体的研究提出了5-HT₇受体在调节昼夜节律中的作用(Lovenberg等，1993；Ying和Rusak，1997)以及与睡眠障碍和抑郁症的相关性。在慢性抗抑郁治疗后，5-HT₇样结合位点的负调节进一步支持这一作用。RT/PCR研究已帮助鉴定出在其预测细胞内羧基末端中结构上有差异的四种哺乳动物5-HT₇剪接变异体(Vanhoenacker等，2000)。
5-羟色胺受体的表达通常具有高度组织特异性，在研究的案例中，每一个5-羟色胺受体家族成员似乎都具有脑中区域表达特征性的模式。这种受限制的表达模式可能是控制介导针对5-羟色胺的特异性生物反应的临界点。直到最近才证明5-HT₇受体是在涉及昼夜节律上的区即交叉上核(SCN)中表达。8-OH-DPAT是一种对5-HT₇受体具有高亲和性的5-HT_1A激动剂，用8-OH-DPAT进行的研究也改变了仓鼠的昼夜节律(Ehlen等，2001)。这些结果表明5-HT₇受体在睡眠调节中的潜在作用。按照这种限制性的表达模式，5-HT₇受体成为研究其基因调节的一个有趣的候补者。
在这一方面，已有研究表明5-HT₇受体在体内(Le Corre等，1997；Yau等1997)和体外(Shimizu等，1997)受到类固醇负调节。这种负调节在情感障碍中发挥作用，因此鉴定了有关调节序列元件是重要的。同样，在慢性抗抑郁治疗后，会出现5-HT₇受体的负调节(Sleight等，1995；Mullins等，1999)。这一结果和其它的初步结果(Harsing等，Soc.Neurosc Abstr.380.1，2001)揭示出5-HT₇受体的突触前作用，因此该受体可能还参与控制5-羟色胺释放的负反馈循环。就这方面而言，改善目前可利用的5-HT₇受体拮抗剂的选择性将会是有益的。5-HT₇启动子调节机制的阐明将使得能够干预5-HT₇受体的形成，并促使产生干扰5-HT₇受体功能的药物的新筛选策略。
发明概述
本发明提供一种基本纯化的5-HT₇受体基因启动子区，其核苷酸序列示于图1(SEQ ID NO：1)。本发明还涉及对人5-HT₇受体启动子的转录因子或调节序列元件的鉴定，以及其在鉴定调节5-HT₇受体基因表达的化合物的筛选方法中的应用。
本发明还提供一种含有编码基因产物、与5-HT₇受体启动子区或其调节序列元件有效连接的核酸分子。
本发明还提供这样的方法：在基于细胞的筛选试验中，使用与5-HT₇受体启动子或其调节序列元件有效连接的基因例如报道基因，鉴定能够调节与5-HT₇受体启动子或其调节序列元件有效连接的基因表达水平的有效试剂。
这类有效试剂可以按照本发明的方法进行鉴定，即将含有与5-HT₇受体启动子或其调节序列元件有效连接的基因的核酸分子导入细胞中；测定所述基因在含有该基因的细胞中表达的对照水平；使含有该基因的细胞与假定的有效试剂接触；然后测定所述基因在接触了该试剂的细胞中表达的试验水平，其中该表达试验水平相对于表达对照水平的差异将所述试剂鉴定为有效试剂。
按照本发明方法所鉴定的有效试剂可以是例如降低或抑制细胞中5-HT₇受体基因表达的药物，因此，该有效试剂可用于治疗那些需要控制突触前自身受体水平的疾病，例如抑郁症。
有效试剂还可以是例如增加5-HT₇受体基因表达的药物，因此，该有效试剂可用于治疗以5-羟色胺反应降低为特征的疾病。

附图简述
图1说明预测的人5-HT₇受体的“最小启动子”区(SEQ ID No：1)。下划线序列表示可能的转录因子结合位点。粗体序列表示邻接转录起始位点(I)的富含GC的区域。
图2是表示人5-HT₇受体基因结构的图谱。外显子用灰色矩形表示，内含子用实线表示。短水平箭头表示表(I)中用于检查人5-HT₇受体的内含子-外显子组构部分的引物。短垂直箭头表示翻译起始密码子ATG下游内含子-外显子边界位置。
图3-表(II)中的启动子序列引物对用来产生PCR产物，将其克隆到Zero Blunt克隆载体pCR2.1TOPO(Invitrogen)中；随后该克隆片段分别通过NcoI/HindIII消化估计大小为1014bp片段，而通过NcoI/XhoI消化估计大小为2027bp片段和3011bp片段，最后被再克隆到类似消化的pGL3-basic萤光素酶报道载体(Promega)中。所得重组质粒分别被命名为1000luc、2000luc和3000luc。
图4是一幅条形图，显示HEK293T细胞在用150ng不同启动子构建体瞬时转染后所获得的相对萤光素酶值。该luc+构建体含有83bp增强子片段(SEQ ID No：2)。
图5是恰好位于翻译起始密码子ATG上游的人5-HT₇受体启动子序列片段(SEQ ID No：5)。下划线序列是83bp NcoI-片段(SEQ IDNo：2)。框内序列是包含AP2-结合基序的30bp寡核苷酸序列(SEQ IDNo：4)，如水平箭头所指。还标出了转录因子NRSF、SREB、Myf5和c-ETS的可能结合基序。
图6A是一幅条形图，显示1.5mM异戊巴比妥或苯巴比妥对HEK293T细胞的相对萤光素酶值影响，该HEK293T细胞事先已用150ng的2000luc+和1000luc+启动子构建体进行了瞬时转染。用CMVluc作为对照载体。转染后的24小时周期内，测量用所述巴比妥盐处理的细胞的萤光素酶活性。
图6B是一幅条形图，显示对HEK293T细胞的时程实验，该HEK293T细胞事先已用150ng的载体2000luc+和1000luc+瞬时转染并且用1.5mM苯巴比妥进行了处理，诱导时间范围从1.5小时至52小时。
图7是一幅条形图，显示用150ng具有不同长度的5-HT7启动子构建体瞬时转染的HEK293T细胞和NS20Y细胞的相对萤光素酶值。
图8是人5’UTR区或小鼠5’UTR区的序列比对，在该区域内启动子活性增加最多(271bp-653bp)。矩形框和椭圆形框分别表示推定的Egr-1和Sp1/MAZ的结合位置。
图9A是一幅条形图，显示用富含GC的区233luc和不同浓度的转录因子CMV-Sp1转染的NS20Y细胞的相对萤光素酶值(灰色条)。不同浓度的由Sp1结合结构域(Sp1-BD)构成的显性失活构建体显示对5-HT7启动子活性有负效应(黑色条)。
图9B是一幅条形图，显示用富含GC的区2331uc和不同浓度的转录因子CMV-Egr-1转染的NS20Y细胞的相对萤光素酶值(灰色条)。不同浓度的由Zn-Egr-1(Zn-Egr-1由Egr1的Zn指结构域构成)构成的显性失活构建体对5-HT7启动子活性有负效应(黑色条)。
图10A是一幅条形图，显示用F1000luc构建体和不同浓度的转录因子Sp1和/或Egr-1转染的NS20Y细胞的相对萤光素酶值。当Sp1保持恒定在500ng时，浓度递增的Egr-1对启动子活性有负效应(白色条)。
图10B是一幅条形图，显示用F1000luc构建体和不同浓度的转录因子Sp1和/或Egr-1转染的NS20Y细胞的相对萤光素酶值。当Egr-1保持恒定在500ng时，浓度递增的Sp1对启动子活性有负效应(白色条)。
图11A是一幅条形图，显示用F1000luc构建体转染并用不同浓度的光神霉素A处理24小时的NS20Y细胞的相对萤光素酶值。
图11B显示光神霉素A(泳道(1)-、泳道(2)10nM、泳道(3)100nM、泳道(4)500nM、泳道(5)1μM、泳道(6)2μM、泳道(7)5μM)对人星形细胞瘤细胞系1321-N1的内源性5-HT7mRNA水平的影响。
详细描述
本发明涉及构成人5-HT₇受体启动子的核酸分子及所述启动子的片段，该5-HT₇受体启动子由SEQ ID No：1的核苷酸1-3081组成，所述启动子的片段具有5-HT₇受体启动子活性。在所述基因这一以前未知的区域中，鉴定出与调节功能一致的差别保守区，在下文称为“调节元件”或“调节序列元件”。所述序列(也称为效应元件)的特征部分在于它们调节连锁基因的表达，并由于转录因子的结合或释放而被激活。调节元件和转录因子的多个实例是本文中公开的或者是本领域已知的。
本文中公开的5-HT₇受体启动子包括例如调节增强子，在下文称为83bp NcoI-片段。5-HT₇受体启动子序列(图1)的位置-27至-110(SEQ ID No：2)所示的序列对所述启动子序列的调节活性有正效应。在一个进一步的实施方案中，本发明提供图1的5-HT₇启动子序列的位置-50至-80(SEQ ID No.：4)的AP2结合基序。
本发明还包括巴比妥盐诱导型元件，在下文称为BARBIE。在瞬时转染试验中，在巴比妥盐例如苯巴比妥或异戊巴比妥存在下，显示5-HT₇受体启动子序列的位置-925至-939(SEQ ID No：3)所示的序列阻抑5-HT₇受体启动子活性。
本发明还包括一个富含GC的基序。显示鉴定为5-HT₇启动子位置-404至-637(SEQ ID No：6)的序列在转录因子Egr-1和Sp1的影响下具有5-HT₇启动子调节活性。
本发明说明书中所涉及的“负核苷酸位置”是位于翻译用ATG起始密码子上游5-HT₇受体启动子区(图1)内的核苷酸位置，其中A等于位置1，而前面的核苷酸等于位置-1。
预期对5-HT₇受体调节的调节对以下疾病具有治疗价值：精神分裂症、抑郁症、情感障碍和睡眠障碍、偏头痛、IBS和胃肠功能失调。
因此，在本发明的第一方面，提供一种分离的人5-HT₇受体启动子区，所述5-HT₇受体启动子区包含选自以下的序列：
(a)SEQ ID No：1的核苷酸1-3081、位置-110至-1124所示的核苷酸序列(1000luc构建体的边界序列)、位置-27至-1124所示的核苷酸序列(1000luc+构建体的边界序列)、位置-1至-1124所示的核苷酸序列(F1000luc构建体的边界序列)、位置-110至-2137所示的核苷酸序列(2000luc构建体的边界序列)、位置-27至-2137所示的核苷酸序列(2000luc+构建体的边界序列)、位置-1至-2137所示的核苷酸序列(F2000luc构建体的边界序列)、位置-110至-3081所示的核苷酸序列(3000luc构建体的边界序列)、位置-27至-3081所示的核苷酸序列(3000luc+构建体的边界序列)、位置-27至-3081所示的核苷酸序列(3000luc+构建体的边界序列)或SEQ ID NO：1中位置-404至-637所示的核苷酸序列(233luc构建体的边界序列)，或其显示5-HT₇受体启动子活性的片段；
(b)(a)的互补链；和
(c)能够在严格性杂交条件下与(a)或(b)所定义的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
“启动子区”是指有效控制一个或多个基因转录的DNA区，依据依赖DNA的RNA聚合酶结合位点的存在，以及依据同一分子上相互作用来调节基因转录的其它DNA序列的存在，对其结构进行鉴定。
“分离的”当涉及核酸时是指多核苷酸，包括从天然来源分离的或合成的RNA或DNA。本发明的分离的核酸在它们在自然中不以纯的或独立的状态存在的意义上是独特的。术语“分离的”的应用说明，已从其正常细胞环境中分离出天然存在的序列。因此，所述序列可能存在于无细胞溶液中，或被置于不同的细胞环境或核酸序列中。“严格性”杂交条件是在6X SSC中约45℃杂交，然后在65℃，用0.2X SSC、0.1％SDS洗涤一次或多次。
本发明的另一方面是一种包含如上定义的人5-HT₇受体启动子区的重组DNA分子。在所述重组DNA分子中，人5-HT₇受体启动子区可以与编码可检测产物的核酸分子例如人5-HT₇受体基因或报道基因有效连接。本文所用的术语“有效连接的”是指使启动子与基因在正确读框内功能性融合，以表达处于该启动子控制之下的基因。本文所用的术语“报道基因”是指编码可以用简单、便宜的方法或试剂鉴定的基因产物、并且可以与人5-HT₇受体启动子区或其活性片段有效连接的基因。可以用报道基因诸如萤火虫萤光素酶报道基因、β-半乳糖苷酶报道基因、碱性磷酸酶报道基因、细菌氯霉素乙酰转移酶报道基因或绿色荧光蛋白报道基因等在依照本发明的筛选试验中测定转录活性(参见例如Goeddel(主编)，Methods Enzymol.，第185卷，San Diego：Academic Press，Inc.(1990)；另见Sambrook，参见上文)。在一个优选的实施方案中，所述报道基因是萤火虫萤光素酶基因或绿色荧光蛋白基因。
本发明还提供一种包含如上定义的重组DNA分子的载体以及用所述载体或一般用依照本发明的重组DNA分子稳定转化的宿主细胞。术语“载体”是指外源DNA的任何载体，所述载体可用于将DNA转移到宿主细胞中，以由所述宿主细胞复制和/或适当表达所述外源DNA。因此，在一个具体的实施方案中，所述载体是一种表达载体如pGL3luc、pBLCAT5(LMBP 2451)、pGMCSFlacZ (LMBP2979)、pEGFP或基于pSEAP(DMB 3115)，其中LMBP和DMB编号是指这些表达载体在比利时微生物协调保藏中心(BelgianCo-ordinated Collections of Micro-organisms)的保藏号。
另一方面，本发明提供一种用于鉴定能能够调节5-HT₇受体启动子活性的化合物的方法，所述方法包括下述步骤：(i)使候选试剂与如上定义的人5-HT₇受体启动子区接触；和(ii)确定所述候选试剂是否调节所述可检测产物的表达，这种调节说明该试剂能够调节5-HT₇受体启动子活性。所述可检测产物或是指5-HT₇受体蛋白，或是指报道基因的产物，例如萤光素酶、β-半乳糖苷酶或绿色荧光蛋白。可检测产物的定量方法是本领域公知的，其中包括使用显色底物(如果表达产物为酶的话)、使用特异性抗体(在RIA或ELISA测定中)或者测量从与所述启动子有效连接的基因所转录的mRNA水平，其中所述mRNA可以用标准方法进行直接或间接测定。
本文所用的术语“化合物”或“试剂”是指生物学的或化学的化合物，例如简单的或复杂的有机分子、肽、蛋白质或寡核苷酸。本文所用的“试验化合物”是指在依照本发明的方法中所用的“化合物”或“试剂”，以评价所述化合物是否调节5-HT₇受体启动子活性或与其“调节元件”相互作用。
转染试验对于鉴定调节和/或调控5-HT₇受体启动子活性的有效试剂可以是特别有用的筛选试验。在转染试验中，将编码与人5-HT₇受体启动子或其活性片段有效连接的基因(例如报道基因)的核酸转染到所需细胞类型中。在候选试剂存在下，分析报道基因表达的试验水平，并与表达的对照水平进行比较。报道基因表达的对照水平是在没有候选试剂的情况下测定的表达水平，如果候选试剂所产生的报道基因表达的试验水平与对照水平不同，则该候选试剂就可被确定为有效试剂。
用于转染细胞的方法和多种便利的报道基因是本领域众所周知的(参见例如Goeddel(主编)，Methods Enzymol.，第185卷，San Diego：Academic Press，Inc.(1990)；另见Sambrook，参见上文)。因此，所述方法可以例如包括在存在和不存在候选试剂的情况下，用包含人5-HT₇受体启动子的重组DNA分子瞬时或稳定转化的宿主细胞，分析所述宿主细胞中报道基因的表达，其中与表达的对照水平相比，候选试剂如对表达的试验水平具有作用，那么就表示该试剂具有调节5-HT₇受体启动子活性的能力。在本实验程序中提供了一个具体的实施方案，其中将不同的5-HT₇受体启动子片段与萤火虫萤光素酶连接。
调节5-HT₇受体启动子活性的多肽的鉴定方法可以包括本领域已知的多项技术，例如用于鉴定与5-HT₇受体调节区结合的蛋白的电泳迁移率变动分析(EMSA)(Dignam D.等(1983)Nucl.Acids Research11，1475-1489)；例如用于鉴定5-HT₇受体调节区内的蛋白质结合特异性序列的酵母单杂交系统；用“southwestern″克隆策略进行与调节区结合的蛋白质的生物化学纯化(参见例如Hai等(1989)Genes&Development 3：2083-2090)，在此方案中，诱导用“噬菌体文库”感染的细菌库表达编码蛋白并用放射性DNA序列从5-HT₇受体调节区中探测此细菌文库，以鉴定结合蛋白。
再一方面，本发明提供5-HT₇受体启动子区的分离的调节元件，所述调节元件包含选自以下的序列：
(a)SEQ ID No：1中位置-27至-110(SEQ ID No：2)所示的核苷酸序列，或其显示5-HT₇受体增强子活性的片段；
(b)SEQ ID No：1中位置-925至-939(SEQ ID No：3)所示的核苷酸序列，或其显示巴比妥盐诱导型元件活性的片段；
(c)SEQ ID No：1中位置-50至-80(SEQ ID No：4)所示的核苷酸序列，或其显示5-HT₇受体启动子调节活性的片段；
(d)SEQ ID No：1中位置-404至-637(SEQ ID No：6)所示的核苷酸序列，或其显示5-HT₇受体启动子调节活性的片段；
(e)(a)、(b)、(c)或(d)的互补链；和
(f)能够在严格性杂交条件下与(a)、(b)、(c)或(d)所定义的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
如上面对5-HT₇受体启动子区所描述的，本发明还提供包含前述的调节元件之一的重组DNA分子，所述调节元件与编码可检测产物的核酸分子有效连接。所述可检测产物可以是5-HT₇受体多肽，或者是报道基因，例如萤火虫萤光素酶基因、碱性磷酸酶基因、细菌氯霉素乙酰转移酶基因、绿色荧光蛋白基因或β-半乳糖苷酶基因。那些缺少最小启动子元件、并且同样地不能够调节其连锁基因表达的调节元件能够与包含最小启动子的报道质粒有效连接，这些最小启动子例如最小的白介素6(IL6)启动子(phu.IL6P-50luc+-Plaisance等(1997)MCB 17，3733-3743)、最小的E1B启动子(pMCSLuc-Stratagene)或萤光素酶的TK启动子(pTKLuc-Promega)。在一个优选的实施方案中，重组分子包含选自83bp NcoI-片段(SEQ ID No：2)、BARBIE元件(SEQ ID No：3)或233bp富含GC的基序(SEQ ID No：6)的分离的核酸分子。
此外，本发明提供能够调节5-HT₇受体启动子调节元件活性或与其相互作用的化合物的鉴定方法，所述方法包括下述步骤：(i)使试验化合物与如上定义的人5-HT₇受体启动子调节元件接触；和(ii)确定所述候选试剂是否调节5-HT₇受体基因的表达，这种调节说明该试剂能够调节5-HT₇受体启动子调节元件的活性或与其相互作用。
因此，本发明提供一种分离的人5-HT₇受体增强子区，所述人5-HT₇受体增强子区包含选自以下的序列：
(a)SEQ ID No：1中位置-27至-110(SEQ ID No：2)所示的核苷酸序列，或其显示5-HT₇受体增强子活性的片段；
(b)SEQ ID No：1中位置-404至-637(SEQ ID No：6)所示的核苷酸序列，或其显示5-HT₇受体增强子活性的片段；
(c)(a)或(b)的互补链；和
(d)能够在严格性杂交条件下与(a)、(b)或(c)所定义的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
“增强子区”是指有效控制一个或多个基因转录的DNA区。
如上对人5-HT₇受体启动子区所描述的，本发明还提供包含人5-HT₇受体增强子区的重组DNA分子、包含所述重组DNA分子的载体以及用所述载体或所述重组DNA分子稳定转化的宿主细胞。
此外，本发明提供一种用于鉴定能够调节5-HT₇受体启动子活性的化合物的方法，所述方法包括下述步骤：(i)使试验化合物与如上定义的人5-HT₇受体增强子区接触；和(ii)确定所述试验化合物是否调节所述5-HT₇受体基因的表达，这种调节说明该试剂能够调节5-HT₇受体启动子活性。技术人员将会知道，能用已知的步骤履行这一方法。例如可以使用包含一系列突变和缺失的构建体“组”能将反应与调节装置的单碱基或亚节的特异性改变联系起来。一个简单的组包括：增强子加上启动子、单独的启动子、增强子加上来源干特殊基因的“最小的”启动子。
如上所述，用以合适的重组DNA分子稳定转化的宿主细胞所进行的转染试验，尤其可用于鉴定有效试剂的筛选试验中。
本发明更进一步的方面是包含依照本发明的核酸分子的载体。所述载体可以是例如那些能够携带依照本发明的DNA分子并能够介导DNA分子表达的复制型表达载体。在本文中，术语“复制型”表示载体能够在已导入该载体的给定类型的宿主细胞中进行复制。载体的实例是病毒如噬菌体、粘粒、质粒和其它重组体载体。用本领域众所周知的方法将核酸分子插入到载体基因组中。
本发明还包括携带依照本发明的载体的培养宿主细胞。这种宿主细胞可以是原核细胞、单细胞真核细胞或来源于多细胞生物的细胞。因此，这种宿主细胞可以例如是细菌细胞，如大肠杆菌(E.coli)细胞；酵母细胞，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；或哺乳动物细胞，如HEK293细胞。将载体有效导入宿主细胞中所用的标准方法是熟悉重组DNA技术的技术人员所熟知的标准方法。下面列举的优选细胞包括HEK293细胞、NS20Y细胞或N2A细胞。
因此，本发明的一个目的是提供一种用于鉴定能够调节5HT₇受体启动子活性的化合物的方法，所述方法包括：(a)使包含依照本发明的重组DNA分子的宿主细胞与试验化合物接触；和(b)确定所述试验化合物是否调节所述可检测产物的表达水平。上述方法中的重组DNA分子最好包含选自以下的分离的核酸分子：
(a)SEQ ID No：1中位置-27至-110(SEQ ID No：2)所示的核苷酸序列，或其显示5-HT₇受体增强子活性的片段；
(b)SEQ ID No：1中位置-925至-939(SEQ ID No：3)所示的核苷酸序列，或其显示巴比妥盐诱导型元件活性的片段；或
(c)SEQ ID No：1中位置-404至-637(SEQ ID No：6)所示的核苷酸序列，或其显示5-HT₇受体启动子调节活性的片段。
因此，本发明提供一种用于鉴定能够调节5HT₇受体启动子增强子活性的化合物的方法，所述方法包括：
(a)使用重组DNA分子转染的宿主细胞与试验化合物接触，该重组DNA分子包含与可检测产物有效连接的83bp NcoI-片段(SEQID No：2)；和
(b)确定所述试验化合物是否调节所述可检测产物的表达水平。
本发明提供一种用于鉴定能够调节5HT₇受体启动子区内巴比妥盐诱导型元件活性的化合物的方法，所述方法包括：
(a)使用重组DNA分子转染的宿主细胞与试验化合物接触，所述重组DNA分子包含与可检测产物有效连接的BARBIE元件(SEQID No：3)；和
(b)确定所述试验化合物是否调节所述可检测产物的表达水平。
本发明提供一种用于鉴定能够调节5HT₇受体启动子区内巴比妥盐诱导型元件活性的化合物的方法，所述方法包括：
(a)使用重组DNA分子转染的宿主细胞与试验化合物接触，所述重组DNA分子包含与可检测产物有效连接的富含GC的基序(SEQID No：6)；和
(b)确定所述试验化合物是否调节所述可检测产物的表达水平。
在一个可供选择的实施方案中，上述试验包括一个结合试验，其中将转录因子作为5HT₇受体启动子调节元件的特异性配体使用。因此，本发明的一个目的是提供一种用于鉴定能够调节5HT₇受体启动子增强子活性的化合物的方法，所述方法包括：(a)在转录因子存在下，使包含依照本发明的5-HT₇受体启动子调节元件的重组DNA分子与试验化合物接触；和(b)确定所述试验化合物是否影响所述转录因子与所述调节元件的结合。
具体地说，本发明提供一种用于鉴定能够调节5HT₇受体启动子增强子活性的化合物的方法，所述方法包括：(a)在转录因子AP2存在下，使包含83bp NcoI-片段(SEQ ID No：2)的重组DNA分子与试验化合物接触；和(b)确定所述试验化合物是否影响所述转录因子与83bp增强子区(SEQ ID No：2)的结合。
在一个进一步的具体实施方案中，本发明提供一种用于鉴定能够调节5HT₇受体启动子增强子活性的化合物的方法，所述方法包括：(a)在转录因子Sp1或Egr-1存在下，使包含富含GC的基序(SEQ IDNo：6)的重组DNA分子与试验化合物接触；和(b)确定所述试验化合物是否影响所述转录因子与所述富含GC的基序(SEQ ID No：6)的结合。
测定转录因子与其识别位点结合的方法是本领域已知的，并且包括例如下文实验部分中所概述的凝胶移位分析。
又一方面，本发明包括一用鉴定能够调节如上定义的核酸分子表达的试剂的方法，所述方法包括下述步骤：(i)使候选试剂与所述核酸分子与接触；和(ii)确定所述候选试剂是否调节所述核酸分子的表达。
例如通过用病毒载体或胶态分散系统如脂质体，将能够与5-HT₇受体基因的控制序列特异性地结合的反义核酸或siRNA(优选10-25个碱基对寡核苷酸)导入细胞中。该反义核酸或siRNA与细胞中的靶核苷酸序列结合，并阻止所述靶序列的转录和/或翻译。本发明特别考虑了硫代磷酸酯和甲基磷酸酯反义寡核苷酸的治疗用途。或在转录水平或在翻译水平上抑制5-HT₇受体基因的表达，可用于产生5-羟色胺介导反应相关的疾病/或病症的细胞或动物模型。
又一方面，本发明提供一种用于鉴定多肽分子的方法，该多肽与参与5-羟色胺介导反应相关的生物途径的核苷酸序列结合，所述方法包括下述步骤：
(a)用与报道基因(如编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因)连接的人5-HT₇受体启动子核苷酸序列转染宿主细胞系(有关综述参见例如Galbraith等(1999)Methods in Cell Biology 58：315-341)；
(b)用多种人cDNA序列如cDNA文库所包含的序列转染所述宿主细胞系；
(c)鉴定并分离(例如采用FACS细胞分选法)所述报道基因的表达水平有改变的细胞，说明由添加的cDNA编码的多肽能够正调节或负调节至少一种参与5-羟色胺介导反应相关的生物途径的基因；
(d)用标准方法例如PCR或CRE-LOX介导的方法(参见例如Sauer(1998)Methods 14：381-392)，从步骤(c)所分离的细胞中回收cDNA；和
(e)鉴定步骤(d)回收的cDNA所表达的多肽，例如通过对cDNA进行测序并将所获得的序列与序列数据库进行比较。
在本发明说明书中，术语“标准方法”、“标准方案”和“标准程序”，当用于分子生物学技术的情况下，可理解为能在普通实验室手册中查找到的方案和程序，例如Current Protocols in MolecularBiology，F.Ausubel等编著，John Wiley and Sons，Inc.1994和Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：Alaboratory manual，第二版，冷泉港实验室印刷，冷泉港纽约1989。
参考后面的实验细节，将能更好地理解本发明，但本领域技术人员将容易理解，同所附权利要求书更全面描述的一样，这些仅用于说明本发明。另外，在本申请中，引用了不同的出版物。这些出版物的公开内容通过引用结合到本申请中，以更全面描述本发明所属领域的现状。
实验程序
人5-HT₇受体基因组克隆的鉴定
用已知的5-HT₇5-羟色胺受体的cDNA序列(GI：17864131)搜索NCBI-数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。我们鉴定出一个BAC克隆(GI：14547262)：来自10号染色体上RP11-103A2的人DNA序列，是含有5-HT₇受体的完全编码序列的完整序列。基于BAC序列信息，设计引物以确认在得自Sanger Centre的BAC克隆中存在5-HT₇外显子。引物序列示于表1。
在起始变性步骤(90℃，5分钟)后，使用Pfu DNA聚合酶(Promega)进行PCR的25个循环(变性步骤：94℃1分钟，退火步骤：59℃1分钟，延伸步骤：68℃10分钟)。
采用Cre-LoxP技术，由Richard Wade-Martins进行再次克隆到基于EBV的载体中。
启动子构建体和质粒
基于BAC序列，设计引物以产生三种不同长度的5’侧翼区(表II)。
全部的片段都是按照下面的方案用Pfu聚合酶产生的。进行PCR的30次循环，每次循环为94℃1分钟、48℃1分钟、72℃4分钟。将所得的PCR产物克隆到零点平端克隆载体pCR 2.1TOPO(Invitrogen)上，并通过序列分析证实几个克隆。
对于亚克隆，将一个NcoI/HindE消化的1014bp片段或NcoI/XhoI消化的2027bp片段和3011bp片段连接到一个类似消化的pGL3-basic萤光素酶报道载体(Promega)上。将所得质粒分别命名为1000luc、2000luc和3000luc(图3)。由于这一克隆策略，所有构建体都缺少翻译起始位点正上游的110bp。一个新的83bp片段被成功地亚克隆到三个报道构建体中，产生了质粒1000luc+、2000luc+和3000luc+。用序列分析证实所插入的83bp的方向。
分别用缺少启动子区和增强子区的pGL3-basic和其中萤光素酶处于强CMV启动子控制之下的CMV luc作为阴性对照和阳性对照。用pNeogal校正转染效率的变动。在所有这三个质粒中，以正确位置和方向插入与在质粒1000luc+、2000luc+和3000luc+中所缺少的27bp具有相同身份的接头序列，产生构建体F1000luc、F2000luc和F3000luc。在下文中被称为233luc构建体的233bp luc片段，是用BamHI/BglI从F1000luc构建体中切下233bp产生的。经Klenow处理后，将所得的233bp片段克隆到NcoI开放和平端化的pGL3luc载体中，并用序列分析确证序列和方向。
细胞培养和瞬时表达试验
将HEK293T细胞维持在Dulbecco改良的Eagle培养基中，该培养基补充了100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10％新生小牛血清。将这些细胞在含5％的CO₂的湿润气氛中维持在37℃。
采用标准磷酸钙共沉淀法，在24孔培养皿中，用150ng启动子质粒和50ng neogal(作为内部对照)转染10⁵细胞/cm²。转染后24小时，细胞用PBSA洗涤一次，然后在150μL 100mM磷酸钾(pH 7.8)、0.2％Triton X-100中进行裂解。按照前面介绍的方法(Vanden Berghe等，1998)，分析该样品的萤光素酶活性。用Galacto Star(Tropix)作为底物，测定β-半乳糖苷酶活性。对于巴比妥盐实验，细胞转染后24小时，开始用不同的巴比妥盐进行处理。
对于CMV-AP2过度转染实验，采用磷酸钙方法，用12μgCMV-AP2质粒(R.Tjian赠送)转染3×10⁶HEK293T细胞。
将N2A细胞和NS20Y细胞维持在Dulbecco改良的Eagle培养基中，该Eagle培养基补充了100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素、和10％胎牛血清。将这些细胞在含5％的CO₂的湿润气氛中维持在37℃。使用阳离子聚合物转染试剂JetPEI(Qbiogene)，在6孔培养皿中，用500-1000ng启动子构建体和300ng neogal(作为内部对照)转染4×10⁵细胞。
在用Egr-1、Zn-Egr-1、Sp1和BD-Sp1的共转染实验中，用JetPEI转染4×10⁵NS20Y细胞或N2A细胞，DNA含量示于附图中(总是用pcDNA3将各孔中的DNA总量校正到相同水平)。
细胞用不同浓度的光神霉素A处理24小时。
凝胶移位分析
如上所述，用裂解缓冲液制备不同细胞系的总提取物。通过NcoI消化，从TOPO 2138构建体中分离出83bp探针。按照以下方案，通过使5′-GAGGTGAAGCCCCGGGGCCGGCAG-3′和5′-CCGGTGCCGGCCCCGGGGCTTCA-3′退火，产生30bp序列，退火方案为：94℃10分钟、70℃10分钟、50℃10分钟、30℃20分钟和4℃10分钟。
使用Klenow DNA聚合酶(Promega)，用[α-³²P]dCTP对DNA片段进行末端标记。在含有50mM Hepes(pH 7.9)、375mM KCl₂、12.5mM MgCl₂、0.5mM EDTA、5mM DTT和15％Ficoll的20μL最终体积中进行结合反应。将细胞提取物在反应缓冲液中在冰上预温育10分钟，然后加入标记的DNA探针，在室温下继续温育15分钟。
竞争性实验中，在加入标记的83bp探针之前，加入过量的未标记的30bp探针。用0.5x TBE中6％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳2小时。用Biorad分子图像仪分析实验结果。
人5-HT₇受体基因转录起始位点的鉴定
按照生产商的方案(Ambion)，用RLM-RACE技术进行5′RACE。用小牛肠磷酸酶(CIP)(Ambion)处理10ug的人胎儿脑总RNA(Stratagene)，从分子例如核糖体RNA、片段mRNA、tRNA和污染的基因组DNA中去除游离的5’磷酸。经过苯酚：氯仿(Invitrogen)提取后，RNA被沉淀并溶解在11μL无核酸酶的水中。取5μL用2μL的烟草酸焦磷酸酶(TAP)(Ambion)在20μL的总体积中37℃处理1小时。TAP从全长度的mRNA中去除帽结构，留下5’一磷酸。然后，用5μLCIP/TAP-处理的RNA、1μL 5′RACE接头和2μL T4RNA连接酶(Ambion)在20μL的总体积中于37℃反应1小时，将一个45碱基的RNA接头寡核苷酸(5′-GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUUUGAUGAAA-3′)连接到RNA群。然后，用随机引物(Ambion)和M-MLV反转录酶(Ambion)，在42℃下将该连接的RNA用于反转录酶反应一小时。
用1μL该cDNA，进行三次连续的嵌套PCR反应。用一个接头特异性的外部引物(5′-GCTGATGGCGATGAATGAACACTG-3′)和一个基因特异性引物B1(5′-GGTGGTGGCTGCTTTCTGTTCTCGCTTAAA-3′)进行第一次PCR反应。PCR反应是在最终体积为50μL、在以下条件下进行的：94℃30秒、60℃30秒、和72℃1分钟(35次循环)。然后，在第二次嵌套PCR反应中，在如上同样的条件下，用接头特异性的外部引物(见后)和基因特异性外部引物(5′-ATGACGTCCATGGCGATGAA-3′)，对十分之一的PCR混合物进行进一步扩增反应。
最后用接头特异性的内部引物(5′-CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG-3′)和基因特异性的内部引物(5′-GATGGAGCCGATCACAACTT-3′)，再采用同样的PCR条件，将十分之一的该PCR扩增的混合物用于第三次嵌套PCR反应。将5μL的最终PCR反应物克隆到TOPO TA克隆载体pCR2.1TOPO(Invitrogen)上，用序列分析确证阳性克隆。
内源性5-HT₇mRNA水平的RT-PCR分析
将人星形细胞瘤细胞接种到58cm²的培养皿中；接种后12小时，或用单纯的培养基(-)，或用含10nM、100nM、500nM、1μM，2μM或5uM光神霉素A(Serva)的培养基培养细胞。用RNeasy总RNA分离试剂盒(Qiagen)来分离总RNA。用AMV反转录酶(Promega)合成cDNA。然后在总体积30μL包含10pmol的每一引物、200μM dNTP、Taq DNA聚合酶缓冲液、2，5单位的Taq和5μL的cDNA的混和溶液中，用PCR对cDNA进行扩增。PCR的条件为：94℃，30秒；56℃，1分钟；72℃，2分钟；35次循环。通过6％的聚丙烯酰胺凝胶对PCR产物进行电泳分析。
5-HT₇正向引物F1：GGAACAGATCAACTACGGCAGAGT
5-HT₇反向引物B1：GGTGGTGGCTGCTTTCTGTTCTCGCTTAAA
用F1和B1产生一个780bp PCR产物
GAPDH正向引物：ACCACAGTCCATGCCATCAC
GAPDH反向引物：TCCACCACCCTGTTGCTGTA
用GAPDH引物产生一个420bp PCR产物
结果
基因组克隆的鉴定
用已公布的5-HT₇受体的cDNA序列(GI：17864131)，在NCBI胚细胞网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)上进行完整人基因组胚细胞的搜索。这就导致了一个包含人5-HT₇受体完整基因组序列的BAC克隆(GI：14547262)的鉴定。该BAC克隆自Sanger中心(http://www.sanger.ac.uk/)定购的，并用一套引物Pri 3-Pri 4(6643bp)、Pri 5-Pri 6(8597bp)和Pri 7-Pri 8(6015bp)，通过PCR鉴定不同的外显子和内含子序列的存在。通过比较cDNA序列与人基因组DNA序列，来揭示人5-HT₇受体的外显子-内含子的结构。该BAC克隆除了包含编码序列和内含子外，还包含14.025bp上游序列和28.421bp下游序列。图2显示了人5-HT₇受体的结构。用LoxP-Cre重组酶技术(Wade-Martins，1999；Wade-Martins，2000)，将包含完整基因组插入物的BAC克隆变化为EBV载体。用同样的用于确认BAC克隆的系列引物，通过PCR再次确认EBV载体中基因组插入物的存在。该EBV载体使我们能将完整的基因组5-HT₇受体序列转移到真核细胞中，并因此用于鉴定那些控制可变剪接的序列以及研究基因的启动子调节。
启动子区的鉴定
用MatInspector(http://www.genomatix.de)对5’-侧翼DNA的序列分析显示了多个转录因子的共有结合位点。该5’-侧翼区(图1)富含GC，并在邻近转录起始位点的区域不含TATA框或CACA框(见后)。有趣的是，已鉴别了几个神经元-限制性的沉默子元件/抑制子元件(NRSE/RE1)的基序，这几个基序可能对于5-HT₇受体基因的神经元限制有重要意义。
对于5-HT₇受体基因的调节具有重要意义的几个其它的基序是Sp1、AP2、OLF₁、BARBIE、PPAR/RXR、NGFIC、Egr，等等。
当我们用Proscan(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/proscan)和PromotorInspector(http://www.genomatix.de)来鉴定5’-侧翼区的潜在的启动子时，两个程序均显示了在ATG密码子的上游端-663至-68之间的推定的启动子区。
这一结果已在用不同长度的5-HT₇受体启动子区对HEK293T和NS20Y细胞的瞬时转染中得到了证实(图7)。在这一启动子活性增加最多的区域内(271bp-365bp)，有一个富含GC的区和推定的Sp1/MAZ和Egr-1结合位置(图8)。这一233bp区域(SEQ ID No：6)是用BamHl和Bgll对F1000构建体进行限制性降解，从中剪切出来的；并将该23bp区域克隆到pGL3luc上，产生233luc构建体。
启动子区的分析
为了研究5-HT₇受体基因的潜在的启动子活性，用特异性的引物组和高保真性的Pfu DNA聚合酶来分离不同长度的片段(表II)。PCR片段被克隆到Zero-Blunt载体pCR2.1TOPO(Invitrogen)上，并从这里将启动子片段亚克隆到pGL3-basic萤光素酶报道载体(Promega)上。
由于此克隆策略，全部构建体最初都缺少83bp NcoI-片段(SEQID No：2)。随后将该片段插入到所有的启动子构建体中，从而产生了‘+’构建体。所有的构建体仍缺少翻译起始位点前面的27bp。图4显示所有片段在HEK293T细胞中均显示相当强的转录活性。用2000bp片段得到了最高活性，该结果显示2000bp片段与1000bp片段相比，存在潜在性的增强子元件。又一方面，用更长的启动子片段导致产生表达水平的下降，该结果表明在位置-2000至-3000中，存在潜在的抑制子元件。可是对于全部的构建体，我们发现：当83bp NcoI-片段不存在时，启动子活性明显降低。这些结果明确表明：在这个83bp序列中，存在一个重要的基本启动子或增强子元件。
用不同长度的5-HT₇推定启动子区进行瞬时转染，导致271bp和653bp之间区域的启动子活性明显增加(图7)。该区域的分析显示了几个潜在的Egr-1结合位点和至少一个推定的Sp1结合位点(图8)。
利用一个SmarTest(http://www.genomatix.de)，我们还在位置2840直至2590的范围内，鉴定了一个推定的S/MAR序列的存在。S/MAR被认为是启动子活性的主要控制因子，所以他们能够阻止邻近序列的影响。这是否就意味着全部5-HT₇受体启动子活性均存在于3000bp片段中，对此还需要用更长的启动子片段来研究。
总之，这些结果表明：从5-HT₇受体的5’-非翻译区分离出来的片段明显地显示启动子活性。
人5-HT₇基因中转录起始位点的鉴定
用从人5-HT₇受体的已知序列衍生出的基因特异性的反义引物，进行始于人胎儿脑RNA(Stratagene)的5’PACE。用一个接头-特异性的外部引物和引物B 1进行第一轮实验后，就可检测到一个800bp片段。用另一个接头-特异性的外部引物和基因-特异性的外部引物对该片段进一步扩增，就产生了一个600bp片段。最后在第三轮PCR中，用一个接头-特异性的内部引物和基因-特异性的内部引物对该片段进一步扩增，产生了一个400bp片段。这个400bp片段被克隆到TOPO-TA载体上，序列分析显示在翻译起始位点ATG的上游端的307bp位置，存在一个转录起始位点。该转录位点与由Bard鉴定的公开的位点(GI：10880132，GI：10880130，GI：10880128)和Heidmann鉴定的公开的位点(GI：1857144，GI：1857142)不同。
83bp片段上有趣的潜在转录因子的鉴定
我们对HEK293T细胞的分析显示了83bp NcoI-片段对于5-HT₇启动子活性的重要性。为了进一步研究这一问题，我们在凝胶移位实验中使用了这个83bp片段(SEQ ID No：2)和内部的30bp寡核苷酸(SEQ ID No：4)。对两个探针进行放射性标记，并用HEK293T细胞和CMV-AP2瞬时转染的HEK293T细胞的提取物(Williams和Tjian，1991)进行温育。83bp片段的结果显示：来源于HEK293T细胞的几种蛋白质与该启动子片段相互作用。因为序列分析表明这个83bp中存在一个AP2基序，我们用AP2转染的HEK293T细胞的提取物来研究它的作用。凝胶移位实验显示：AP2实际上与83bp片段相互作用，并且通过用一个包含AP2位点的较短的30bp寡核苷酸证实了这些结果。这种相互作用的特异性在一个用冷30bp的竞争性实验中得到了证明。但是，用30bp寡核苷酸作为竞争物，导致了未知蛋白质B和C之间较强的结合。这一结果可能表示这些蛋白质具有重叠的结合-基序，而且它们与AP2竞争结合这一位点。可能的候选蛋白质是SREB、NRSF、Myf5、或c-ETS(图5)。
巴比妥盐在5-HT₇启动子活性中的作用
按照MatInspector，5-HT₇受体的启动子区内存在一个推定的BARBIE(巴比妥盐诱导型元件)。为了研究巴比妥盐对5-HT₇启动子活性的可能影响，我们用不同的启动子构建体瞬时转染HEK293T细胞，并用巴比妥盐处理这些转染细胞24小时(图6a)。结果显示：24小时的巴比妥盐(1.5mM)处理抑制了瞬时转染的HEK293T细胞中的启动子活性。依照所用的启动子构建体和巴比妥盐的种类，启动子活性降低的水平在30-50％之间变化。异戊巴比妥似乎更有效，而且在2000启动子片段中其作用更明显。由于巴比妥盐不影响CMV启动子的活性，这些结果表明被观察的作用具有5-HT₇-启动子特异性。
接下来，我们进行了时程实验(图6)，该实验表明：6小时后已经呈现了抑制作用，16小时后抑制作用达到最大。52小时后启动子活性又增加。
Egr-1和Sp1对5-HT₇启动子调节的作用
用CMV-Sp1或CMV-Egrl加上5-HT₇启动子构建体在NS20Y细胞中进行的瞬时转染显示：两种转录因子(Egrl和Sp1)对5-HT₇启动子活性有正效应(分别为图9A和图9B)。另外，两种转录因子(CMV-Sp1-BD和Zn-Egrl)的显性失活构建体对5-HT₇启动子活性显示负效应。提示两种转录因子在5-HT₇基因调节中的作用。
用CMV-Sp1和CMV-Egrl加上5-HT₇启动子构建体在N2A细胞中进行的共转染实验显示了这两种转录因子的相互作用。当其中一个转录因子保持在相同水平(500ng)时，另一个的转录水平就得到增加，从中可以看到其对5-HT₇启动子活性的负效应(分别为图10A和图10B)。
光神霉素A是一种能够干扰Sp1与DNA中的GC框结合的化合物，用光神霉素A的实验证实了Sp1与5-HT₇启动子的结合对于转录活性的意义。在第一次实验中，用5-HT₇启动子的F1000构建体瞬时感染NS20Y细胞并用连续增加浓度的光神霉素A处理NS20Y细胞，该实验证明了启动子活性的计量依赖性损失(图11A)。在1321-N1细胞中观察到了相似的现象。用不同浓度的光神霉素A处理这一内源性表达5-HT₇受体的人细胞系24小时，导致5-HT₇mRNA水平显著降低，而一种管家基因GAPDH的水平未受影响(图11B)。这些结果表明Sp1在5-HT₇启动子活性的“体内”体内调节中起重要作用。
讨论
我们首次报道了人5-HT₇受体的完整基因组结构，包括5’-和3’-侧翼区。将包含107kB第一内含子的完整基因组序列克隆到基于EBV的载体中，使我们能研究真核细胞中5-HT₇受体基因的调节。
通过5’RACE实验，我们能够鉴定出位于翻译起始位点上游307bp位置的一个主要转录起始位点。该位点不同于以前鉴定的位点。这一现象能够与至今在启动子区内不能鉴定到真实的CAAT元件的TATA-框的事实联系起来。
用多种软件程序进行的5’-侧翼区的序列分析显示和鉴定了转录因子的几个基序。在这些基序中，存在一些推定的Sp1和AP2位点，这些位点与5’-侧翼区的富含GC的特性相关。
我们分离出不同长度的启动子片段，并在HEK293T细胞中测试了它们的转录活性。所有片段明显地表现启动子活性，我们的结果表明存在增强子区和阻抑物子区。当构建体中包含83bp NcoI-片段时，可观察到转录明显增加。在凝胶移位实验中仅用此83bp片段，该实验证明存在几种相互作用蛋白。迄今为止，我们将AP2鉴定作为增强子区结合因子。
已有报道指出AP2在几个其它的神经递质受体基因的启动子调节中发挥作用，这些神经递质受体包括人m3毒蝇碱性乙酰胆碱受体(Billington和Penn，2002)、α7神经元烟碱性乙酰胆碱受体(Gault等，1998)和D(1A)多巴胺受体(Takeuchi等，1999)。
用包含AP2位点的30bp片段进行的竞争实验显示：其它的转录因子能够竞争重叠序列。这些因子例如SREBP、NRSF、Myf5、c-ETS在5-HT₇受体启动子的30bp序列中有它们的识别序列。
已有研究显示5-HT₇受体在体内(LeCorre等，1997；Yau等1997)和体外(Shimizu等1997)受类固醇负调节，这也许在情感障碍中起作用。鉴定存在于5’-侧翼区的调节序列元件GREF/PRE和PPAR/RXR为试验类固醇，例如地塞米松或其它核受体配体对启动子活性的影响提供了一个手段，同时也为检查这种活性上的差异是否由其中之一的基序引起提供了一个手段。另外，结合全长基因组克隆，现在已能够研究类固醇，例如地塞米松是如何影响5-HT₇受体的剪接模式。
对普通的镇静剂来说，已知在高剂量时，它们能够抑制神经和肌肉的活性，并抑制组织中氧的消耗。在低剂量时，巴比妥盐行使镇静剂的作用，举例来说，它们具有镇静的作用；增加剂量具有催眠或诱导睡眠的作用。在中枢神经系统中的作用机制还是未知的。
5-HT₇受体启动子的序列分析令人惊讶地显示了巴比妥盐诱导型元件(BARBIE)的存在。我们用1.5mM的巴比妥盐的结果清楚地表明巴比妥盐对5-HT₇启动活性有负效应。这提示了5-HT₇受体在睡眠调节中的潜在作用，并支持了Ehlen等人在2001年的早期发现，Ehlen等证实了用8-OH-DPAT(一种对5-HT₇受体具有高亲和性的5-HT_1A激动剂)治疗的仓鼠在昼夜节律上的改变。目前，对BARBIE元件的鉴定作为研究巴比妥盐对5-HT₇受体调节的影响提供了一个工具，也为鉴定那些特异性影响巴比妥盐诱导型元件活性的试剂提供了一种手段。
利用Smar试验(http://www.genomatix.de)，我们在3000bp片段中鉴定出S/MAR。MAR(Matrix Attachment Regions)被认为负责基因组DNA与核基质或骨架的连接，这一连接是允许转录的必要条件(Bode等1995)。MAR的一些功能性特征包括：1)将调节元件例如启动子和增强子锚定到核基质上，2)定义独立染色质域的边界(包括基因的协同表达所必需的全部顺式-调节元件)，3)保证启动子和增强子的长期活性，4)绝缘、放弃对位置作用不敏感的功能区域。因此期望完整的5-HT₇启动子调节存在于3000bp片段中。
5-HT₇启动子的富含GC的区的鉴定证实了早期的发现，即缺少不变的TATA和CAAT框的基因具有富含GC的区域，该区域可能代替TATA框行使作用。几个这种基因已经显示能够被Sp1激活。例子包括EGF受体[Kageyama，1988#38]和雌激素受体α[deGraffenried，2002#39]。Egr-1被认为、并被报道为在它们的富含G+C的元件中，既抑制又刺激基因启动子的转录。Sp1通常是一种激活因子，但当Egr-1存在时，Sp1引起复杂的反应。Ackerman首先报道了Sp1和Egr-1之间在与ADA基因启动子的结合和激活上的竞争[Ackerman，1993#40]。此后，几个报道指出Sp1和Egr-1之间有复杂的关系。Huang说明Egr-1的表达增大了非重叠的Sp1+Egr-1位点上Sp1的激活，但当位点被与Sp1竞争的结合位点重叠时，Egr-1的表达抑制Sp1的活性[Huang，1997#41]。
我们的结果清楚地表明这两种转录因子在调节5HT₇受体基因中的作用。因此，影响这些转录因子活性的策略可能提供一种用于控制5-HT₇受体水平的工具。
此外，我们发现了一种能够抑制5-HT₇启动子活性的化合物-光神霉素A，该化合物干扰Sp1与DNA中的GC框的结合。
迄今为止，仅描述了几种选择性5-HT₇受体拮抗剂，例如SB258719、DR4004和SB269970(Thomas等，1998；Kikuchi等，1999；Hagan等，2000)，但是至今还没有得到选择性激动剂。对5-HT₇启动子调节的阐明，将使我们以一种新的方式干扰5-HT₇受体的形成，并可能导致产生针对干扰5-HT₇受体功能的药物的新筛选策略。同样，我们拥有完整的基因组克隆的事实将允许我们确定那些负责5-HT₇受体可变剪接的机制。尽管至今还没有剪接变异体之间差异的报道，但为了未来的治疗性干预，为干扰潜在机制的可能性付出努力是值得的。
参考文献
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表I

表II：

序列表
<110>詹森药业有限公司(Janssen Pharmaceutica N.V.)
<120>人5-HT7受体启动子序列
<130>JAB 1720
<150>EP 02077309.9
<151>2002-05-31
<160>6
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>3081
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
tggtggctca tgcctgtaat ctcagcactt tgggaggctg aggcaggcgg atcacttgag     60
gttaagagtt tgaggccagc ctggccaaca tggtgaaacc cggtccctac taaaaacaat    120
acaaaaatta ggcaggtgtg gtggcatgtg cctgtaatcc cagctacttg ggaagctgag    180
gcagaagaat cgcttgaacc tgggaggttg aggttgcagt gagccgagat cgcgccactg    240
cactccagcc tgggtgacag agcaagaccc tgtctcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    300
aaagaaagag agacccagag agctctccta ccccctttgc caggtgagga cacagcaaca    360
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ctgttgtgaa atataaatgg gctacgtgag ggctgtaaga gtgtaggtgg taaatcatat    540
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gcggcacacg gcggcgcgat g                                            3081
<210>2
<211>83
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>2
catggctggg ccgggcggag cggaaccggt gaggtgaagc cccggggccg gcagccggag    60
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<210>3
<211>15
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>3
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<211>30
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>4
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<210>5
<211>154
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>5
ccgagacaga gccaggcgcc ccccagcggt cggcgcgggc cccatggctg ggccgggcgg    60
agcggaaccg gtgaggtgaa gccccggggc cggcagccgg aggcgcgtgg ccggggcgcc   120
ggctccatgg gcagcggcac acggcggcgc gatg                               154
<210>6
<211>233
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>6
gatcccggga ggcgcgtgca gcgccgcccc ctcacagtag ggaggcgcgg gagaggcggc    60
ggtgcctgcc cagcccgggt atcccgtccc aggagcgcga gggagcgggc agcggccgga   120
ggcggcggcg gcggggacgc ggcgcggctg ccgcagggga gcggcggcgg cggcggcggc    180
ggcggcgggc gcgaggggcg gggcgcactc cgcaacttct gccgctgccg ccc           233