技术领域
本发明涉及微生物领域中的一种梭菌及其培养方法与应用。
背景技术
植物通过光合作用生成有机物，其中35％或更多以作物秸秆等纤维素类物质形式存在，但是这类纤维素类物质目前还没能被充分开发利用，因而又成为重要的环境污染源。纤维素类物质能被降解为五碳糖、六碳糖，然后糖可通过微生物发酵产生燃料酒精或其它化工产品原料。因此人们一直在探索研究将纤维素类废弃物转化为可再生能源。目前一般是用化学或物理方法水解纤维素产生糖，再用生物发酵糖产生燃料乙醇，但此种技术成本高，一直没有大规模产业化。用微生物细胞及纤维素酶来降解纤维素可以提高降解效率，降低成本。因而寻找高效的微生物细胞或纤维素酶应用于纤维素降解工业，将会对促进纤维素类物质转化为可再生资源有重要的意义。
瘤胃作为反刍动物的消化器官，是迄今已知的、降解转化纤维素类物质效率最高的天然体系，它依赖于瘤胃微生物群体的协同作用将天然纤维类物质快速降解转化成一系列动物营养和能源物质。可以认为瘤胃是一个完美的、天然的秸秆纤维降解消化加工厂和高效厌氧发酵罐，目前尚没有任何人工系统能与之媲美。
目前报道的能降解纤维素的梭菌有：解纤维梭菌，分离自土壤，具有分解纤维素的能力，但不具有酯酶活性(Petitdemange，E.，F.Caillet，J.Giallo，andC.Gaudin.1984.Clostridium cellulolyticum sp.nov.，a cellulolytic，mesophilic species from decayed grass.Int.J.Syst.Bacteriol.34：155-159)；热纤维梭菌，分离自土壤，高温(58℃)生长，具有分解纤维素的能力，但不能利用其中的木聚糖和木糖(Johnson EA，Sakajoh M，Halliwell G，Madia A，Demain AL.1982.Saccharification of Complex Cellulosic Substratesby the Cellulase System from Clostridium thermocellum.Appl EnvironMicrobiol.43(5)：1125-1132)。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种梭菌，该梭菌具有降解纤维素及木聚糖、木糖和酯类物质的活性。
本发明所提供的梭菌，被鉴定为居瘤胃梭菌Clostridium ruminocolum，来源于牦牛瘤胃内容物。
所述居瘤胃梭菌具体为居瘤胃梭菌(Clostridium ruminocolum)H1，它于2007年8月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址是中国北京市朝阳区大屯路甲3号，保藏号为CGMCC No.2125。
本发明所提供的居瘤胃梭菌H1具有以下特征：
1)菌落特征：菌落直径为1.0-2.0mm，菌落呈圆形，表面光滑，边缘整齐，凸起，黄色或白色。
2)细胞形态特征：细胞为杆状，顶端圆钝；革兰氏染色阴性；细胞直径0.8-1.0μm。
3)生理生化特征：厌氧生长；接触酶阴性；不产吲哚；脲酶阴性；不水解七叶灵；不液化明胶；不产生H2S；不还原硝酸盐；VP试验阴性；能利用纤维二糖、纤维素、麦芽糖、木糖、木聚糖、乳糖作为碳源，不能利用阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、糖原、丙酮酸、蔗糖、海藻糖、淀粉、苦杏仁苷、赤藓糖醇、甘油、肌醇、乳酸、甘露醇、松三糖、蜜二糖、棉子糖、鼠李糖、核糖、水杨苷、马尿酸；可以利用铵盐作为氮源。
4)居瘤胃梭菌H1的16S rRNA基因序列长度为1547bp，其核苷酸序列如序列表序列1所示。
本发明的另一个目的是提供一种培养居瘤胃梭菌H1的方法。
本发明所提供的培养居瘤胃梭菌H1的方法，是将居瘤胃梭菌H1接种于RC培养基，在25-45℃、pH 6-10的条件下培养。
在1000ml上述RC培养基中含有：瘤胃液，200-600ml；无机盐溶液I，100-200ml；无机盐溶液II，100-200ml；碳源物质，1-4g；氮源物质，0.3-1.0g；余量为水。
其中，所述无机盐溶液I是浓度为0.2-0.4％的K2HPO4溶液；所述无机盐溶液II为含0.2-0.4％KH2PO4、0.4-0.8％(NH4)2SO4、0.4-0.8％NaCl、0.04-0.08％MgSO4、0.04-0.08％CaCl2的水溶液。所述百分含量均为质量百分含量。
其中，碳源物质可以选自纤维二糖、纤维素、麦芽糖、木糖、木聚糖和乳糖中的一种或几种，氮源物质可以为半胱氨酸盐酸盐和铵盐中的一种或几种，具体可以根据实际情况而定。
为了使RC培养基维持在一个比较稳定的pH值范围内，还要向培养基中加入5-15g的NaHCO3。
上述RC培养基还包括氧化还原指示剂，具体可为刃天青，其含量可为0.2-0.6mg。
本发明培养方法中，所需的厌氧环境是通过注入CO2气体得到的，一般注入达到1大气压的量。其中，最适培养温度为35-41℃，最适pH为6.5-7.5。
本发明所提供的居瘤胃梭菌H1易培养，培养效率高，可达2.5±1g/L。
本发明的居瘤胃梭菌H1是从牦牛的瘤胃中分离得到的，是一种能够降解纤维素及木聚糖、木糖和酯类的微生物。该微生物中含有降解纤维素的复合酶系，包括外切纤维素酶、内切纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、酯酶、果胶酸酶，酶活分别为为4.1±1.19U/mg、118.7±4.5U/mg、167.36±22.9U/mg、45.9±3.52U/mg、4±0.5U/mg、35.3±1.77U/mg。与解纤维梭菌相比，本发明中的居瘤胃梭菌H1除具有分解天然纤维素的能力外，还具有分解其中酯的酯酶活性；与热纤维梭菌相比，居瘤胃梭菌H1中温(39℃)生长，易培养，并具有利用戊糖的能力。通过对本发明居瘤胃梭菌H1参与纤维素类物质降解的酶系的研究，探索利用其细胞或纤维素酶建立纤维素类物质高效转化系统，可以为实现纤维素类物质高效利用提供技术支持。因此本发明中的居瘤胃梭菌H1在降解纤维素类物质中将能够得到广泛应用，在纤维素降解工业中会有广阔的应用前景。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。
实验中所使用的RC液体培养基的基本组成为(/升)：
瘤胃液：400ml；无机盐溶液I：150ml；无机盐溶液II：150ml；纤维二糖：2.5g；半胱氨酸盐酸盐：0.5g；刃天青：0.4mg；NaHCO3：10g；蒸馏水定容至1000ml。
无机盐溶液I：质量百分比浓度为0.3％的K2HPO4溶液。
无机盐溶液II：含0.3％KH2PO4、0.6％(NH4)2SO4、0.6％NaCl、0.06％MgSO4、0.06％CaCl2的水溶液。
所述百分含量均为质量百分含量。
实验中所使用的RC固体培养基是向上述RC液体培养基中加入15g琼脂，使其终浓度为1.5％。
实施例1、菌株H1的分离制备
取牦牛瘤胃内容物，将其接种于以滤纸纤维素为底物的RC液体培养基中传代培养，得到富集物；用富集物作为接种源，将其接种于以纤维二糖为底物的RC固体培养基，用Hungate滚管技术分离得到。
将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏编号为CGMCC No.2125。
实施例2、菌株鉴定
一、形态及生理生化特征
将菌株H1(CGMCC No.2125)接种于纤维二糖为底物的RC固体培养基(含质量百分含量为1.5％的琼脂)，在pH为7.0，温度为39℃的条件下固体滚管培养2天。
观察菌落及细胞的形态特征，并进行如下生理生化实验：1革兰氏染色试验，2接触酶试验，3产生吲哚试验，4脲酶试验，5水解七叶灵试验，6液化明胶试验，7产生H2S试验，8还原硝酸盐试验，9VP试验，10底物利用试验，11氮源利用实验。
观察结果及实验结果如下：
1)菌落特征：菌落直径为1.0-2.0mm，菌落呈圆形，表面光滑，边缘整齐，凸起，黄色或白色。
2)细胞形态特征：细胞为杆状，顶端圆钝；革兰氏染色阴性；细胞直径0.8-1.0μm。产生端生芽孢，胞囊膨大。
3)生理生化特征：厌氧生长；接触酶阴性；不产吲哚；脲酶阴性；不水解七叶灵；不液化明胶；不产生H2S；不还原硝酸盐；VP试验阴性；能利用纤维二糖、纤维素、麦芽糖、木糖、木聚糖、乳糖作为碳源，不能利用阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、糖原、丙酮酸、蔗糖、海藻糖、淀粉、苦杏仁苷、赤藓糖醇、甘油、肌醇、乳酸、甘露醇、松三糖、蜜二糖、棉子糖、鼠李糖、核糖、水杨苷、马尿酸；可以利用铵盐作为氮源。
二、菌株H1(CGMCC No.2125)的16S rRNA基因的PCR扩增和序列测定
1)提取DNA
将居瘤胃梭菌H1(CGMCC No.2125)接种于RC液体培养基培养；取生长至对数晚期的发酵液，5000转/分钟离心5分钟，去除上清液；用TES(50mM Tris，50mM EDTA-Na2，50mM NaCl，pH 8.0-8.2)溶液洗3遍；用0.5mL TES溶液将菌体混匀，加入适量溶菌酶，37℃保温2小时；加入0.2mL 20％SDS，60℃保温10分钟；加入0.3mL 5M NaClO4，混匀；加入等体积酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)，轻轻摇匀5分钟左右，离心(5000转/分钟，5分钟)，吸取上清液，再用酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)处理一遍；然后依次用氯仿-异戊醇(24∶1，v/v)处理两遍，直到没有蛋白膜出现；上清液加入20μl 0.2％RNA酶37℃保温30分钟，氯仿-异戊醇(24∶1，v/v)处理一遍；上清液加入20μl蛋白酶K(50-70μg/mL)，37℃保温1小时，氯仿-异戊醇(24∶1，v/v)处理一遍；上清液用2倍体积冰乙醇沉淀，70％冰乙醇溶液浸泡5分钟；晾干后溶于TE溶液中作为模板DNA。
2)16S rRNA基因的PCR扩增及测序
用于PCR扩增的正向引物为5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3’(nt8-37)，反向引物为5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3’(nt 1479-1506)，分别对应于大肠杆菌的16S rRNA基因中8-37和1479-1506位的碱基。PCR反应体系(50μl)为：10×buffer 5μl；25mmol/L MgCl24μl；10mmol/L dNTPs 1μl；30pmol/L引物各1μl；ddH2O 36μl；Taq DNA酶1μl；模板1μl。PCR反应条件为：95℃10min，95℃1min，55℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min，4℃保存。
PCR产物的测序采用ABI BigDye3.1测序试剂盒(Applied Biosystems)和DNA自动测序仪(model ABI3730；Applied Biosystems)。
测序结果表明，菌株H1(CGMCC No.2125)的16S rRNA基因序列长度为1547bp，其核苷酸序列如序列表序列1所示。
将16S rRNA基因序列在GenBank中进行同源比对分析，结果表明，其序列与Clostridium lentocellum的16S rRNA基因序列的相似性为94％。
参照《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》(第二版)，根据其形态特征和生理生化特征，以及根据其16S rRNA基因序列在GenBank中的搜索结果，菌株H1(CGMCC No.2125)被鉴定为新种居瘤胃梭菌(Clostridiumruminocolum)。
实施例3、居瘤胃梭菌H1的培养
1)将居瘤胃梭菌H1以5％的比例接种于50ml RC液体培养基，在25℃、pH为6的条件下培养。
RC液体培养基的组成(/升)如下：
瘤胃液：200ml；无机盐溶液I：100ml；无机盐溶液II：100ml；纤维素：1.0g；半胱氨酸盐酸盐：0.3g；NaHCO3：5g；刃天青：0.2mg；蒸馏水定容至10000ml。
无机盐溶液I：质量百分比浓度为0.2％的K2HPO4溶液。
无机盐溶液II：含0.2％KH2PO4、0.4％(NH4)2SO4、0.4％NaCl、0.04％MgSO4、0.04％CaCl2的水溶液。
所述百分含量均为质量百分含量。
培养所需的厌氧环境是通过注入CO2气体得到的，直至达到1大气压(1.01×105Pa)为止。
实验设三次重复，平均菌体浓度达0.5±0.3g/L。
2)将居瘤胃梭菌H1以5％比例接种于50ml RC培养基，在35℃、pH为6.5的条件下培养。
RC培养基的组成(/升)如下：
瘤胃液：300ml；无机盐溶液I：125ml；无机盐溶液II：125ml；麦芽糖：2.0g；半胱氨酸盐酸盐：0.4g；NaHCO3：7g；刃天青：0.3mg；蒸馏水定容至1000ml。
无机盐溶液I：质量百分比浓度为0.25％的K2HPO4溶液。
无机盐溶液II：含0.25％KH2PO4、0.5％(NH4)2SO4、0.5％NaCl、0.05％MgSO4、0.05％CaCl2的水溶液。
所述百分含量均为质量百分含量。
培养所需的厌氧环境是通过注入CO2气体得到的，直至达到1大气压(1.01×105Pa)为止。
实验设三次重复，平均菌体浓度达2.0±1g/L
3)将居瘤胃梭菌H1以5％的比例接种于50ml RC培养基，在38℃、pH为7.0的条件下培养。
RC培养基的组成(/升)：
瘤胃液：400ml；无机盐溶液I：150ml；无机盐溶液II：150ml；纤维二糖：2.5g；半胱氨酸盐酸盐：0.5g；NaHCO3：10g；刃天青：0.4mg；蒸馏水定容至10000ml。
无机盐溶液I：质量百分比浓度为0.3％的K2HPO4溶液。
无机盐溶液II：含0.3％KH2PO4、0.6％(NH4)2SO4、0.6％NaCl、0.06％MgSO4、0.06％CaCl2的水溶液。
所述百分含量均为质量百分含量。
培养所需的厌氧环境是通过注入CO2气体得到的，直至达到1大气压(1.01×105Pa)为止。
实验设三次重复，平均菌体浓度达2.5±1g/L。
4)将居瘤胃梭菌H1以5％比例接种于50ml RC培养基，在41℃、pH为7.5的条件下培养。
RC培养基的组成(/升)：
瘤胃液：500ml；无机盐溶液I：175ml；无机盐溶液II：175ml；木聚糖和木糖中的一种或二种：共3.5g；(NH4)2SO4：0.7g；NaHCO3：12g；刃天青：0.5mg；蒸馏水定容至1000ml。
无机盐溶液I：质量百分比浓度为0.35％的K2HPO4溶液。
无机盐溶液II：含0.35％KH2PO4、0.7％(NH4)2SO4、0.7％NaCl、0.07％MgSO4、0.07％CaCl2的水溶液。
所述百分含量均为质量百分含量。
培养所需的厌氧环境是通过注入CO2气体得到的，直至达到1大气压(1.01×105Pa)为止。
实验设三次重复，平均菌体浓度达2.0±1g/L。
5)将居瘤胃梭菌H1以5％比例接种于50ml RC培养基，在45℃、pH为10的条件下培养。
RC培养基的组成(/升)：
瘤胃液：600ml；无机盐溶液I：200ml；无机盐溶液II：200ml；乳糖：4g；NH4NO3：1.0g；NaHCO3：15g；刃天青：0.6mg；蒸馏水定容至1000ml。
无机盐溶液I：质量百分比浓度为0.4％的K2HPO4溶液。
无机盐溶液II：含0.4％KH2PO4、0.8％(NH4)2SO4、0.8％NaCl、0.08％MgSO4、0.08％CaCl2的水溶液。
所述百分含量均为质量百分含量。
培养所需的厌氧环境是通过注入CO2气体得到的，直至达到1大气压(1.01×105Pa)为止。
实验设三次重复，平均菌体浓度达0.3±0.1g/L。
6)将居瘤胃梭菌H1以5％比例接种于50ml RC培养基，在46℃、pH为7.0的条件下培养。
RC培养基的组成(/升)：
瘤胃液：400ml；无机盐溶液I：150ml；无机盐溶液II：150ml；纤维二糖：2.5g；半胱氨酸盐酸盐：0.5g；NaHCO3：10g；刃天青：0.4mg；蒸馏水定容至1000ml。
无机盐溶液I：质量百分比浓度为0.3％的K2HPO4溶液。
无机盐溶液II：含0.3％KH2PO4、0.6％(NH4)2SO4、0.6％NaCl、0.06％MgSO4、0.06％CaCl2的水溶液。
所述百分含量均为质量百分含量。
培养所需的厌氧环境是通过注入CO2气体得到的，直至达到1大气压(1.01×105Pa)为止。
实验设三次重复，三次重复中菌体均不生长。
实验结果表明：菌株H1厌氧生长，生长温度从25℃到45℃，46℃不生长，最适生长温度35-41℃；pH生长范围6-10，最适生长pH为6.5-7.5。在最适生长条件下，菌体浓度可达2.5±1g/L。
实施例4、居瘤胃梭菌H1CGMCC No.2125中几种降解纤维素的酶的酶活测定
一、制备酶液
将居瘤胃梭菌H1 CGMCC No.2125接种于RC液体培养基，pH为7.0，培养温度为39℃，培养3天后，离心收集细胞；将细胞沉淀悬浮于PBS缓冲液中作为酶液。
RC培养基组成为(/升)：
瘤胃液：400ml；无机盐溶液I：150ml；无机盐溶液II：150ml；纤维二糖：2.5g；半胱氨酸盐酸盐：0.5g；NaHCO3：10g；刃天青：0.4mg；蒸馏水定容至1000ml。
无机盐溶液I：质量百分比浓度为0.3％的K2HPO4溶液。
无机盐溶液II：含0.3％KH2PO4、0.6％(NH4)2SO4、0.6％NaCl、0.06％MgSO4、0.06％CaCl2的水溶液。
所述百分含量均为质量百分含量。
培养所需的厌氧环境是通过注入CO2气体得到的，直至达到1大气压(1.01×105Pa)为止。
二、酶活测定
1)酶活测定反应体系(500μl)包括：1％反应底物(质量百分含量)，250μl；500mM乙烷磺酸吗啉(morpholine ethanesulfonic acid，MES)-NaOH缓冲液，100μl，pH为6.0；酶液，150μl。反应温度为37℃，采用DNS比色法测定产生的还原糖量。
一个酶活力单位(1U)定义为每分钟释放出1μmol还原糖的酶量。
2)用上述酶活测定反应体系分别测定不同酶活，每个实验设三次重复：
A、外切纤维素酶：底物为微晶纤维素，反应12小时，三次重复平均测得酶活为4.1±1.19U/mg。
B、内切纤维素酶：底物为羧甲基纤维素(CMC)，反应30分钟，三次重复平均测得酶活为118.7±4.5U/mg。
C、木聚糖酶：底物为木聚糖，反应30分钟，三次重复平均测得酶活为167.36±22.9U/mg。
D、甘露聚糖酶：底物为槐豆胶(locust bean gum)，反应30分钟，三次重复平均测得酶活为45.9±3.52U/mg。
E、果胶酸酶：底物为果胶，反应30分钟，三次重复平均测得酶活为35.3±1.77U/mg。
F、酯酶：底物为阿魏酸甲酯，反应30分钟，三次重复平均测得酶活为4±0.5U/mg。
实施例5、利用本发明的居瘤胃梭菌H1降解滤纸纤维素
一、配制培养基
将Whatman I滤纸剪成条状，以3％的质量百分含量加入不含底物的RC培养基中，最终形成的RC培养基的组成如下(/升)：
瘤胃液：400ml；无机盐溶液I：150ml；无机盐溶液II：150ml；WhatmanI号滤纸：2.5g；半胱氨酸盐酸盐：0.5g；NaHCO3：10g；刃天青：0.4mg；蒸馏水定容至1000ml。
无机盐溶液I：质量百分比浓度为0.3％的K2HPO4溶液。
无机盐溶液II：含0.3％KH2PO4、0.6％(NH4)2SO4、0.6％NaCl、0.06％MgSO4、0.06％CaCl2的水溶液。
所述百分含量均为质量百分含量。
培养所需的厌氧环境是通过注入CO2气体得到的，直至达到1大气压(1.01×105Pa)为止。
二、将在以纤维二糖为底物的RC液体培养基中生长的居瘤胃梭菌H1作为实验菌体，当菌体浓度达2.5g/L时，将其以1/10的体积比接种于4ml上述以WhatmanI滤纸为底物的RC培养基，在38℃、pH 7.0的条件下培养。
三、滤纸失重测定
利用硝酸-乙醇法测定培养后剩余的滤纸质量，同培养前的滤纸质量进行比较，减少的质量为降解造成的滤纸失重。
原来滤纸的质量为0.12g，培养8天后滤纸的质量为0.06g。
四、降解率：
降解率的计算公式为：
降解率＝(培养前滤纸的质量-培养后滤纸的质量)/培养前滤纸的质量
本实验中的降解率＝(0.12g-0.06g)/0.12g＝50％
序列表
<160>1
<210>1
<211>1547
<212>DNA
<213>梭菌属居瘤胃梭菌(Clostridium ruminocolum)
<400>1
agagtttgat acctggctca ggctggatac acctccttag agtttgatca tggctcaggc 60
tgaacgctgg cggcgtgctt aacacatgca agtcgaacga actgaggaga gcttgctctc 120
caaagttagt ggcggacggg tgagtaacgc gtgggtaacc tgcctcatgc agggggataa 180
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