一种梭菌及其培养方法与应用.pdf

1、(10)授权公告号 CN 101148651 B (45)授权公告日 2010.04.21 CN 101148651 B *CN101148651B* (21)申请号 200710121453.X (22)申请日 2007.09.06 CGMCC No.2125 2007.08.06 C12N 1/20(2006.01) C12P 1/04(2006.01) (73)专利权人 中国科学院微生物研究所 地址 100080 北京市海淀区中关村北一条 13 号 (72)发明人 东秀珠 蔡世淳 张科贵 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 CN 1995330

2、 A,2007.07.11, 全文 . 张晓华 刘敏雄 谭蓓英 . 一个分解纤维素的瘤胃梭菌新 种 . 微生物学报 35 6.1995,35(6), 全文 . (54) 发明名称 一种梭菌及其培养方法与应用 (57) 摘要 本发明公开了一种梭菌及其培养方法与应 用。所述梭菌为居瘤胃梭菌， 具体为居瘤胃梭菌 H1， 其保藏号为 CGMCC No.2125。本发明所提供的 居瘤胃梭菌 H1 的培养效率高， 含有降解纤维素的 复合酶系， 包括外切纤维素酶、 内切纤维素酶、 木 聚糖酶、 甘露聚糖酶、 酯酶、 果胶酸酶。 与已发现的 解纤维梭菌相比， 本发明中的居瘤胃梭菌 H1 除具 有分解天然纤维素

3、的能力外， 还具有分解其中酯 的酯酶活性 ； 与热纤维梭菌相比， 居瘤胃梭菌 H1 中温 (39 ) 生长， 易培养， 并具有利用戊糖的能 力。 本发明中的居瘤胃梭菌H1在纤维素降解工业 中将有广阔的应用前景。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 李美宣 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 8 页 CN 101148651 B1/1 页 2 1. 居瘤胃梭菌 (Clostridium ruminocolum)H1 CGMCC No.2125。 2. 权利要求 1 所述居瘤胃梭菌 H1 CGMCC No.2125

4、 的培养方法， 是将居瘤胃梭菌 H1 CGMCC No.2125 接种于 RC 培养基， 在 25-45、 pH 6-10 的条件下进行培养 ； 所述RC培养基， 在1000ml中含有 ： 瘤胃液， 200-600ml ； 无机盐溶液I， 100-200ml ； 无机 盐溶液 II， 100-200ml ； 碳源物质， 1-4g ； 氮源物质， 0.3-1.0g ； 余量为水 ； 所述无机盐溶液 I 是浓度为 0.2-0.4的 K2HPO4溶液 ； 所述无机盐溶液 II 为含 0.2-0.4 KH2PO4、 0.4-0.8 (NH4)2SO4、 0.4-0.8 NaCl、 0.04-0.08

5、MgSO4、 0.04-0.08 CaCl2的水溶液 ； 所述百分含量均为质量百分含量。 3. 根据权利要求 2 所述的培养方法， 其特征在于 ： 所述碳源物质为纤维二糖、 纤维素、 麦芽糖、 木糖、 木聚糖和乳糖中的一种或几种。 4. 根据权利要求 2 或 3 所述的培养方法， 其特征在于 ： 所述氮源物质为半胱氨酸盐酸 盐和铵盐中的一种或几种。 5. 根据权利要求 2 或 3 所述的培养方法， 其特征在于 ： 所述 RC 培养基中还含有 5-15g 的 NaHCO3。 6. 根据权利要求 2 或 3 所述的培养方法， 其特征在于 ： 所述 RC 培养基中还含有 0.2-0.6mg 的刃天青

6、。 7. 根据权利要求 2 或 3 所述的培养方法， 其特征在于 ： 所述培养温度为 35-41。 8. 根据权利要求 2 或 3 所述的培养方法， 其特征在于 ： 所述 pH 为 6.5-7.5。 9. 权利要求 1 所述居瘤胃梭菌 H1 CGMCC No.2125 在降解纤维素类物质中的应用。 权 利 要 求 书 CN 101148651 B1/8 页 3 一种梭菌及其培养方法与应用 技术领域 0001 本发明涉及微生物领域中的一种梭菌及其培养方法与应用。 背景技术 0002 植物通过光合作用生成有机物， 其中 35或更多以作物秸秆等纤维素类物质形式 存在， 但是这类纤维素类物质目前还没能

7、被充分开发利用， 因而又成为重要的环境污染源。 纤维素类物质能被降解为五碳糖、 六碳糖， 然后糖可通过微生物发酵产生燃料酒精或其它 化工产品原料。因此人们一直在探索研究将纤维素类废弃物转化为可再生能源。目前一般 是用化学或物理方法水解纤维素产生糖， 再用生物发酵糖产生燃料乙醇， 但此种技术成本 高， 一直没有大规模产业化。 用微生物细胞及纤维素酶来降解纤维素可以提高降解效率， 降 低成本。因而寻找高效的微生物细胞或纤维素酶应用于纤维素降解工业， 将会对促进纤维 素类物质转化为可再生资源有重要的意义。 0003 瘤胃作为反刍动物的消化器官， 是迄今已知的、 降解转化纤维素类物质效率最高 的天然体

8、系， 它依赖于瘤胃微生物群体的协同作用将天然纤维类物质快速降解转化成一系 列动物营养和能源物质。可以认为瘤胃是一个完美的、 天然的秸秆纤维降解消化加工厂和 高效厌氧发酵罐， 目前尚没有任何人工系统能与之媲美。 0004 目前报道的能降解纤维素的梭菌有 ： 解纤维梭菌， 分离自土壤， 具有分解纤维素的 能力， 但不具有酯酶活性 (Petitdemange， E.， F.Caillet， J.Giallo， andC.Gaudin.1984. Clostridium cellulolyticum sp.nov.， a cellulolytic， mesophilic species from de

9、cayed grass.Int.J.Syst.Bacteriol.34 ： 155-159) ； 热纤维梭菌， 分离自土壤， 高温 (58 ) 生长， 具有分解纤维素的能力， 但不能利用其中的木聚糖和木糖 (Johnson EA， Sakajoh M， Halliwell G， Madia A， Demain AL.1982.Saccharification of Complex Cellulosic Substratesby the Cellulase System from Clostridium thermocellum.Appl EnvironMicrobiol.43(5) ： 112

10、5-1132)。 发明内容 0005 本发明的一个目的是提供一种梭菌， 该梭菌具有降解纤维素及木聚糖、 木糖和酯 类物质的活性。 0006 本发明所提供的梭菌， 被鉴定为居瘤胃梭菌 Clostridium ruminocolum， 来源于牦 牛瘤胃内容物。 0007 所述居瘤胃梭菌具体为居瘤胃梭菌 (Clostridium ruminocolum)H1， 它于 2007 年 8 月 6 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏中心地址是中国北 京市朝阳区大屯路甲 3 号， 保藏号为 CGMCC No.2125。 0008 本发明所提供的居瘤胃梭菌 H1 具有以下特征 ： 00

11、09 1) 菌落特征 ： 菌落直径为 1.0-2.0mm， 菌落呈圆形， 表面光滑， 边缘整齐， 凸起， 黄 色或白色。 说 明 书 CN 101148651 B2/8 页 4 0010 2) 细 胞 形 态 特 征 ： 细 胞 为 杆 状， 顶 端 圆 钝 ； 革 兰 氏 染 色 阴 性 ； 细 胞 直 径 0.8-1.0m。 0011 3) 生理生化特征 ： 厌氧生长 ； 接触酶阴性 ； 不产吲哚 ； 脲酶阴性 ； 不水解七叶灵 ； 不液化明胶 ； 不产生 H2S ； 不还原硝酸盐 ； VP 试验阴性 ； 能利用纤维二糖、 纤维素、 麦芽糖、 木 糖、 木聚糖、 乳糖作为碳源， 不能利用阿

12、拉伯糖、 果糖、 半乳糖、 葡萄糖、 糖原、 丙酮酸、 蔗糖、 海藻糖、 淀粉、 苦杏仁苷、 赤藓糖醇、 甘油、 肌醇、 乳酸、 甘露醇、 松三糖、 蜜二糖、 棉子糖、 鼠李 糖、 核糖、 水杨苷、 马尿酸 ； 可以利用铵盐作为氮源。 0012 4) 居瘤胃梭菌 H1 的 16S rRNA 基因序列长度为 1547bp， 其核苷酸序列如序列表序 列 1 所示。 0013 本发明的另一个目的是提供一种培养居瘤胃梭菌 H1 的方法。 0014 本发明所提供的培养居瘤胃梭菌 H1 的方法， 是将居瘤胃梭菌 H1 接种于 RC 培养 基， 在 25-45、 pH 6-10 的条件下培养。 0015 在

13、 1000ml 上述 RC 培养基中含有 ： 瘤胃液， 200-600ml ； 无机盐溶液 I， 100-200ml ； 无机盐溶液 II， 100-200ml ； 碳源物质， 1-4g ； 氮源物质， 0.3-1.0g ； 余量为水。 0016 其中， 所述无机盐溶液 I 是浓度为 0.2-0.4的 K2HPO4溶液 ； 所述无机盐溶 液 II 为含 0.2-0.4 KH2PO4、 0.4-0.8 (NH4)2SO4、 0.4-0.8 NaCl、 0.04-0.08 MgSO4、 0.04-0.08 CaCl2的水溶液。所述百分含量均为质量百分含量。 0017 其中， 碳源物质可以选自纤维二

14、糖、 纤维素、 麦芽糖、 木糖、 木聚糖和乳糖中的一种 或几种， 氮源物质可以为半胱氨酸盐酸盐和铵盐中的一种或几种， 具体可以根据实际情况 而定。 0018 为了使RC培养基维持在一个比较稳定的pH值范围内， 还要向培养基中加入5-15g 的 NaHCO3。 0019 上述 RC 培养基还包括氧化还原指示剂， 具体可为刃天青， 其含量可为 0.2-0.6mg。 0020 本发明培养方法中， 所需的厌氧环境是通过注入 CO2气体得到的， 一般注入达到 1 大气压的量。其中， 最适培养温度为 35-41， 最适 pH 为 6.5-7.5。 0021 本发明所提供的居瘤胃梭菌 H1 易培养， 培养效

15、率高， 可达 2.51g/L。 0022 本发明的居瘤胃梭菌 H1 是从牦牛的瘤胃中分离得到的， 是一种能够降解纤维素 及木聚糖、 木糖和酯类的微生物。 该微生物中含有降解纤维素的复合酶系， 包括外切纤维素 酶、 内切纤维素酶、 木聚糖酶、 甘露聚糖酶、 酯酶、 果胶酸酶， 酶活分别为为 4.11.19U/mg、 118.74.5U/mg、 167.3622.9U/mg、 45.93.52U/mg、 40.5U/mg、 35.31.77U/mg。 与解 纤维梭菌相比， 本发明中的居瘤胃梭菌 H1 除具有分解天然纤维素的能力外， 还具有分解其 中酯的酯酶活性 ； 与热纤维梭菌相比， 居瘤胃梭菌

16、H1 中温 (39 ) 生长， 易培养， 并具有利 用戊糖的能力。通过对本发明居瘤胃梭菌 H1 参与纤维素类物质降解的酶系的研究， 探索利 用其细胞或纤维素酶建立纤维素类物质高效转化系统， 可以为实现纤维素类物质高效利用 提供技术支持。因此本发明中的居瘤胃梭菌 H1 在降解纤维素类物质中将能够得到广泛应 用， 在纤维素降解工业中会有广阔的应用前景。 具体实施方式 0023 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。 说 明 书 CN 101148651 B3/8 页 5 0024 实验中所使用的 RC 液体培养基的基本组成为 (/ 升 ) ： 0025 瘤胃液 ： 400ml ；

17、无机盐溶液 I ： 150ml ； 无机盐溶液 II ： 150ml ； 纤维二糖 ： 2.5g ； 半 胱氨酸盐酸盐 ： 0.5g ； 刃天青 ： 0.4mg ； NaHCO3： 10g ； 蒸馏水定容至 1000ml。 0026 无机盐溶液 I ： 质量百分比浓度为 0.3的 K2HPO4溶液。 0027 无机盐溶液II ： 含0.3KH2PO4、 0.6(NH4)2SO4、 0.6NaCl、 0.06MgSO4、 0.06 CaCl2的水溶液。 0028 所述百分含量均为质量百分含量。 0029 实验中所使用的 RC 固体培养基是向上述 RC 液体培养基中加入 15g 琼脂， 使其终 浓

18、度为 1.5。 0030 实施例 1、 菌株 H1 的分离制备 0031 取牦牛瘤胃内容物， 将其接种于以滤纸纤维素为底物的 RC 液体培养基中传代培 养， 得到富集物 ； 用富集物作为接种源， 将其接种于以纤维二糖为底物的 RC 固体培养基， 用 Hungate 滚管技术分离得到。 0032 将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)， 其保藏编 号为 CGMCC No.2125。 0033 实施例 2、 菌株鉴定 0034 一、 形态及生理生化特征 0035 将菌株 H1(CGMCC No.2125) 接种于纤维二糖为底物的 RC 固体培养基 ( 含质量百 分含量

19、为 1.5的琼脂 )， 在 pH 为 7.0， 温度为 39的条件下固体滚管培养 2 天。 0036 观察菌落及细胞的形态特征， 并进行如下生理生化实验 ： 1 革兰氏染色试验， 2 接 触酶试验， 3产生吲哚试验， 4脲酶试验， 5水解七叶灵试验， 6液化明胶试验， 7产生H2S试验， 8 还原硝酸盐试验， 9VP 试验， 10 底物利用试验， 11 氮源利用实验。 0037 观察结果及实验结果如下 ： 0038 1) 菌落特征 ： 菌落直径为 1.0-2.0mm， 菌落呈圆形， 表面光滑， 边缘整齐， 凸起， 黄 色或白色。 0039 2) 细 胞 形 态 特 征 ： 细 胞 为 杆 状，

20、 顶 端 圆 钝 ； 革 兰 氏 染 色 阴 性 ； 细 胞 直 径 0.8-1.0m。产生端生芽孢， 胞囊膨大。 0040 3) 生理生化特征 ： 厌氧生长 ； 接触酶阴性 ； 不产吲哚 ； 脲酶阴性 ； 不水解七叶灵 ； 不液化明胶 ； 不产生 H2S ； 不还原硝酸盐 ； VP 试验阴性 ； 能利用纤维二糖、 纤维素、 麦芽糖、 木 糖、 木聚糖、 乳糖作为碳源， 不能利用阿拉伯糖、 果糖、 半乳糖、 葡萄糖、 糖原、 丙酮酸、 蔗糖、 海藻糖、 淀粉、 苦杏仁苷、 赤藓糖醇、 甘油、 肌醇、 乳酸、 甘露醇、 松三糖、 蜜二糖、 棉子糖、 鼠李 糖、 核糖、 水杨苷、 马尿酸 ； 可以

21、利用铵盐作为氮源。 0041 二、 菌株 H1(CGMCC No.2125) 的 16S rRNA 基因的 PCR 扩增和序列测定 0042 1) 提取 DNA 0043 将居瘤胃梭菌H1(CGMCC No.2125)接种于RC液体培养基培养 ； 取生长至对数晚期 的发酵液， 5000 转 / 分钟离心 5 分钟， 去除上清液 ； 用 TES(50mM Tris， 50mM EDTA-Na2， 50mM NaCl， pH 8.0-8.2) 溶液洗 3 遍 ； 用 0.5mL TES 溶液将菌体混匀， 加入适量溶菌酶， 37保温 2 小时 ； 加入 0.2mL 20 SDS， 60保温 10 分

22、钟 ； 加入 0.3mL 5M NaClO4， 混匀 ； 加入等体积 酚 - 氯仿 - 异戊醇 (25 24 1)， 轻轻摇匀 5 分钟左右， 离心 (5000 转 / 分钟， 5 分钟 )， 说 明 书 CN 101148651 B4/8 页 6 吸取上清液， 再用酚 - 氯仿 - 异戊醇 (25 24 1) 处理一遍 ； 然后依次用氯仿 - 异戊醇 (241， v/v)处理两遍， 直到没有蛋白膜出现 ； 上清液加入20l 0.2RNA酶37保温30 分钟， 氯仿 - 异戊醇 (24 1， v/v) 处理一遍 ； 上清液加入 20l 蛋白酶 K(50-70g/mL)， 37保温 1 小时，

23、氯仿 - 异戊醇 (24 1， v/v) 处理一遍 ； 上清液用 2 倍体积冰乙醇沉淀， 70冰乙醇溶液浸泡 5 分钟 ； 晾干后溶于 TE 溶液中作为模板 DNA。 0044 2)16S rRNA 基因的 PCR 扩增及测序 0045 用于 PCR 扩增的正向引物为 5 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3 (nt8-37)， 反向引物为 5 -TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3 (nt 1479-1506)， 分别对应于大肠杆菌 的 16S rRNA 基因中 8-37 和 1479-1506 位的碱基。PCR 反应体系 (50l) 为

24、 ： 10buffer 5l ； 25mmol/L MgCl24l ； 10mmol/L dNTPs 1l ； 30pmol/L 引物各 1l ； ddH2O 36l ； Taq DNA酶1l ； 模板1l。 PCR反应条件为 ： 9510min， 951min， 551min， 721min， 30 个循环 ； 72 10min， 4保存。 0046 PCR产物的测序采用ABI BigDye3.1测序试剂盒(Applied Biosystems)和DNA自 动测序仪 (model ABI3730 ； Applied Biosystems)。 0047 测序结果表明， 菌株 H1(CGMCC

25、No.2125) 的 16S rRNA 基因序列长度为 1547bp， 其 核苷酸序列如序列表序列 1 所示。 0048 将 16S rRNA 基因序列在 GenBank 中进行同源比对分析， 结果表明， 其序列与 Clostridium lentocellum 的 16S rRNA 基因序列的相似性为 94。 0049 参照 Bergey s Manual of Systematic Bacteriology ( 第二版 )， 根据其形 态特征和生理生化特征， 以及根据其 16S rRNA 基因序列在 GenBank 中的搜索结果， 菌株 H1(CGMCC No.2125) 被鉴定为新种居瘤

26、胃梭菌 (Clostridiumruminocolum)。 0050 实施例 3、 居瘤胃梭菌 H1 的培养 0051 1) 将居瘤胃梭菌 H1 以 5的比例接种于 50ml RC 液体培养基， 在 25、 pH 为 6 的 条件下培养。 0052 RC 液体培养基的组成 (/ 升 ) 如下 ： 0053 瘤胃液 ： 200ml ； 无机盐溶液 I ： 100ml ； 无机盐溶液 II ： 100ml ； 纤维素 ： 1.0g ； 半胱 氨酸盐酸盐 ： 0.3g ； NaHCO3： 5g ； 刃天青 ： 0.2mg ； 蒸馏水定容至 10000ml。 0054 无机盐溶液 I ： 质量百分比浓

27、度为 0.2的 K2HPO4溶液。 0055 无机盐溶液II ： 含0.2KH2PO4、 0.4(NH4)2SO4、 0.4NaCl、 0.04MgSO4、 0.04 CaCl2的水溶液。 0056 所述百分含量均为质量百分含量。 0057 培 养 所 需 的 厌 氧 环 境 是 通 过 注 入 CO2气 体 得 到 的， 直 至 达 到 1 大 气 压 (1.01105Pa) 为止。 0058 实验设三次重复， 平均菌体浓度达 0.50.3g/L。 0059 2) 将居瘤胃梭菌 H1 以 5比例接种于 50ml RC 培养基， 在 35、 pH 为 6.5 的条件 下培养。 0060 RC

28、培养基的组成 (/ 升 ) 如下 ： 0061 瘤胃液 ： 300ml ； 无机盐溶液 I ： 125ml ； 无机盐溶液 II ： 125ml ； 麦芽糖 ： 2.0g ； 半胱 氨酸盐酸盐 ： 0.4g ； NaHCO3： 7g ； 刃天青 ： 0.3mg ； 蒸馏水定容至 1000ml。 说 明 书 CN 101148651 B5/8 页 7 0062 无机盐溶液 I ： 质量百分比浓度为 0.25的 K2HPO4溶液。 0063 无机盐溶液 II ： 含 0.25 KH2PO4、 0.5 (NH4)2SO4、 0.5 NaCl、 0.05 MgSO4、 0.05 CaCl2的水溶液。

29、0064 所述百分含量均为质量百分含量。 0065 培 养 所 需 的 厌 氧 环 境 是 通 过 注 入 CO2气 体 得 到 的， 直 至 达 到 1 大 气 压 (1.01105Pa) 为止。 0066 实验设三次重复， 平均菌体浓度达 2.01g/L 0067 3) 将居瘤胃梭菌 H1 以 5的比例接种于 50ml RC 培养基， 在 38、 pH 为 7.0 的条 件下培养。 0068 RC 培养基的组成 (/ 升 ) ： 0069 瘤胃液 ： 400ml ； 无机盐溶液 I ： 150ml ； 无机盐溶液 II ： 150ml ； 纤维二糖 ： 2.5g ； 半 胱氨酸盐酸盐 ：

30、0.5g ； NaHCO3： 10g ； 刃天青 ： 0.4mg ； 蒸馏水定容至 10000ml。 0070 无机盐溶液 I ： 质量百分比浓度为 0.3的 K2HPO4溶液。 0071 无机盐溶液II ： 含0.3KH2PO4、 0.6(NH4)2SO4、 0.6NaCl、 0.06MgSO4、 0.06 CaCl2的水溶液。 0072 所述百分含量均为质量百分含量。 0073 培 养 所 需 的 厌 氧 环 境 是 通 过 注 入 CO2气 体 得 到 的， 直 至 达 到 1 大 气 压 (1.01105Pa) 为止。 0074 实验设三次重复， 平均菌体浓度达 2.51g/L。 00

31、75 4) 将居瘤胃梭菌 H1 以 5比例接种于 50ml RC 培养基， 在 41、 pH 为 7.5 的条件 下培养。 0076 RC 培养基的组成 (/ 升 ) ： 0077 瘤胃液 ： 500ml ； 无机盐溶液 I ： 175ml ； 无机盐溶液 II ： 175ml ； 木聚糖和木糖中的 一种或二种 ： 共 3.5g ； (NH4)2SO4： 0.7g ； NaHCO3： 12g ； 刃天青 ： 0.5mg ； 蒸馏水定容至 1000ml。 0078 无机盐溶液 I ： 质量百分比浓度为 0.35的 K2HPO4溶液。 0079 无机盐溶液 II ： 含 0.35 KH2PO4、

32、0.7 (NH4)2SO4、 0.7 NaCl、 0.07 MgSO4、 0.07 CaCl2的水溶液。 0080 所述百分含量均为质量百分含量。 0081 培 养 所 需 的 厌 氧 环 境 是 通 过 注 入 CO2气 体 得 到 的， 直 至 达 到 1 大 气 压 (1.01105Pa) 为止。 0082 实验设三次重复， 平均菌体浓度达 2.01g/L。 0083 5) 将居瘤胃梭菌 H1 以 5比例接种于 50ml RC 培养基， 在 45、 pH 为 10 的条件 下培养。 0084 RC 培养基的组成 (/ 升 ) ： 0085 瘤胃液 ： 600ml ； 无机盐溶液 I ：

33、200ml ； 无机盐溶液 II ： 200ml ； 乳糖 ： 4g ； NH4NO3： 1.0g ； NaHCO3： 15g ； 刃天青 ： 0.6mg ； 蒸馏水定容至 1000ml。 0086 无机盐溶液 I ： 质量百分比浓度为 0.4的 K2HPO4溶液。 0087 无机盐溶液II ： 含0.4KH2PO4、 0.8(NH4)2SO4、 0.8NaCl、 0.08MgSO4、 0.08 CaCl2的水溶液。 说 明 书 CN 101148651 B6/8 页 8 0088 所述百分含量均为质量百分含量。 0089 培 养 所 需 的 厌 氧 环 境 是 通 过 注 入 CO2气 体

34、得 到 的， 直 至 达 到 1 大 气 压 (1.01105Pa) 为止。 0090 实验设三次重复， 平均菌体浓度达 0.30.1g/L。 0091 6) 将居瘤胃梭菌 H1 以 5比例接种于 50ml RC 培养基， 在 46、 pH 为 7.0 的条件 下培养。 0092 RC 培养基的组成 (/ 升 ) ： 0093 瘤胃液 ： 400ml ； 无机盐溶液 I ： 150ml ； 无机盐溶液 II ： 150ml ； 纤维二糖 ： 2.5g ； 半 胱氨酸盐酸盐 ： 0.5g ； NaHCO3： 10g ； 刃天青 ： 0.4mg ； 蒸馏水定容至 1000ml。 0094 无机盐溶

35、液 I ： 质量百分比浓度为 0.3的 K2HPO4溶液。 0095 无机盐溶液II ： 含0.3KH2PO4、 0.6(NH4)2SO4、 0.6NaCl、 0.06MgSO4、 0.06 CaCl2的水溶液。 0096 所述百分含量均为质量百分含量。 0097 培 养 所 需 的 厌 氧 环 境 是 通 过 注 入 CO2气 体 得 到 的， 直 至 达 到 1 大 气 压 (1.01105Pa) 为止。 0098 实验设三次重复， 三次重复中菌体均不生长。 0099 实验结果表明 ： 菌株H1厌氧生长， 生长温度从25到45， 46不生长， 最适生长 温度 35-41； pH 生长范围

36、6-10， 最适生长 pH 为 6.5-7.5。在最适生长条件下， 菌体浓度可 达 2.51g/L。 0100 实施例 4、 居瘤胃梭菌 H1CGMCC No.2125 中几种降解纤维素的酶的酶活测定 0101 一、 制备酶液 0102 将居瘤胃梭菌 H1 CGMCC No.2125 接种于 RC 液体培养基， pH 为 7.0， 培养温度为 39， 培养 3 天后， 离心收集细胞 ； 将细胞沉淀悬浮于 PBS 缓冲液中作为酶液。 0103 RC 培养基组成为 (/ 升 ) ： 0104 瘤胃液 ： 400ml ； 无机盐溶液 I ： 150ml ； 无机盐溶液 II ： 150ml ； 纤维

37、二糖 ： 2.5g ； 半 胱氨酸盐酸盐 ： 0.5g ； NaHCO3： 10g ； 刃天青 ： 0.4mg ； 蒸馏水定容至 1000ml。 0105 无机盐溶液 I ： 质量百分比浓度为 0.3的 K2HPO4溶液。 0106 无机盐溶液II ： 含0.3KH2PO4、 0.6(NH4)2SO4、 0.6NaCl、 0.06MgSO4、 0.06 CaCl2的水溶液。 0107 所述百分含量均为质量百分含量。 0108 培 养 所 需 的 厌 氧 环 境 是 通 过 注 入 CO2气 体 得 到 的， 直 至 达 到 1 大 气 压 (1.01105Pa) 为止。 0109 二、 酶活测

38、定 0110 1) 酶活测定反应体系 (500l) 包括 ： 1反应底物 ( 质量百分含量 )， 250l ； 500mM乙烷磺酸吗啉(morpholine ethanesulfonic acid， MES)-NaOH缓冲液， 100l， pH为 6.0 ； 酶液， 150l。反应温度为 37， 采用 DNS 比色法测定产生的还原糖量。 0111 一个酶活力单位 (1U) 定义为每分钟释放出 1mol 还原糖的酶量。 0112 2) 用上述酶活测定反应体系分别测定不同酶活， 每个实验设三次重复 ： 0113 A、 外切纤维素酶 ： 底物为微晶纤维素， 反应 12 小时， 三次重复平均测得酶活为

39、 说 明 书 CN 101148651 B7/8 页 9 4.11.19U/mg。 0114 B、 内切纤维素酶 ： 底物为羧甲基纤维素 (CMC)， 反应 30 分钟， 三次重复平均测得酶 活为 118.74.5U/mg。 0115 C、 木 聚 糖 酶 ： 底 物 为 木 聚 糖， 反 应 30 分 钟， 三 次 重 复 平 均 测 得 酶 活 为 167.3622.9U/mg。 0116 D、 甘露聚糖酶 ： 底物为槐豆胶 (locust bean gum)， 反应 30 分钟， 三次重复平均测 得酶活为 45.93.52U/mg。 0117 E、 果胶酸酶 ： 底物为果胶， 反应 30

40、 分钟， 三次重复平均测得酶活为 35.31.77U/ mg。 0118 F、 酯酶 ： 底物为阿魏酸甲酯， 反应 30 分钟， 三次重复平均测得酶活为 40.5U/mg。 0119 实施例 5、 利用本发明的居瘤胃梭菌 H1 降解滤纸纤维素 0120 一、 配制培养基 0121 将Whatman I滤纸剪成条状， 以3的质量百分含量加入不含底物的RC培养基中， 最终形成的 RC 培养基的组成如下 (/ 升 ) ： 0122 瘤胃液 ： 400ml ； 无机盐溶液 I ： 150ml ； 无机盐溶液 II ： 150ml ； WhatmanI 号滤纸 ： 2.5g ； 半胱氨酸盐酸盐 ： 0.

41、5g ； NaHCO3： 10g ； 刃天青 ： 0.4mg ； 蒸馏水定容至 1000ml。 0123 无机盐溶液 I ： 质量百分比浓度为 0.3的 K2HPO4溶液。 0124 无机盐溶液II ： 含0.3KH2PO4、 0.6(NH4)2SO4、 0.6NaCl、 0.06MgSO4、 0.06 CaCl2的水溶液。 0125 所述百分含量均为质量百分含量。 0126 培 养 所 需 的 厌 氧 环 境 是 通 过 注 入 CO2气 体 得 到 的， 直 至 达 到 1 大 气 压 (1.01105Pa) 为止。 0127 二、 将在以纤维二糖为底物的 RC 液体培养基中生长的居瘤胃梭

42、菌 H1 作为实验菌 体， 当菌体浓度达 2.5g/L 时， 将其以 1/10 的体积比接种于 4ml 上述以 WhatmanI 滤纸为底 物的 RC 培养基， 在 38、 pH 7.0 的条件下培养。 0128 三、 滤纸失重测定 0129 利用硝酸 - 乙醇法测定培养后剩余的滤纸质量， 同培养前的滤纸质量进行比较， 减少的质量为降解造成的滤纸失重。 0130 原来滤纸的质量为 0.12g， 培养 8 天后滤纸的质量为 0.06g。 0131 四、 降解率 ： 0132 降解率的计算公式为 ： 0133 降解率 ( 培养前滤纸的质量 - 培养后滤纸的质量 )/ 培养前滤纸的质量 0134 本

43、实验中的降解率 (0.12g-0.06g)/0.12g 50 0135 序列表 0136 1 0137 1 0138 1547 0139 DNA 0140 梭菌属居瘤胃梭菌 (Clostridium ruminocolum) 说 明 书 CN 101148651 B8/8 页 10 0141 1 0142 agagtttgat acctggctca ggctggatac acctccttag agtttgatca tggctcaggc 60 0143 tgaacgctgg cggcgtgctt aacacatgca agtcgaacga actgaggaga gcttgctctc 120 01

44、44 caaagttagt ggcggacggg tgagtaacgc gtgggtaacc tgcctcatgc agggggataa 180 0145 cgtttggaaa cgaacgctaa taccgcataa actatggatt accgcatggt aattatagca 240 0146 aagatttatc ggcatgagat ggacccgcgt tggattagct agttggtgag ataacagccc 300 0147 accaaggcga cgatccatag ccggcctgag agggtgaacg gccacattgg gactgagaca 360 01

45、48 cggcccaaac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg cacaatgggc gcaagcctga 420 0149 tgcagcgacg ccgcgtgaag gaagaaggtc ttcggattgt aaacttctat cagcagggaa 480 0150 gaaaaaaatg acggtacctg actaagaagc tccggctaac tacgtgccag cagccgcggt 540 0151 aatacgtagg gagcgagcgt tatccggatt tactgggtgt aaagggtgcg taggcggcat 600 01

46、52 ggtaagtcag aagtgaaatt ttggggctca actccagagc tgctctgaaa ctgctgtgct 660 0153 agagtgtggg agaggaaagt ggaattccga gtgtagcggt gaaatgcgta gagattcgga 720 0154 ggaacaccag tagcgaaggc ggctttctgg accataactg acgctgaggc acgaaagcgt 780 0155 ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga atgctaggtg 840 01

47、56 tcggccctta cgggggtcgg tgccgaagtt aacacattaa gcattccacc tgggaagtac 900 0157 gatcgcaaga ttgaaactca aaggaattga cggggacccg cacaagcggt ggagcatgtg 960 0158 gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta cctaaacttg acatccttct gaccggtctt 1020 0159 taatcggact tttcggtgct tgcactgacg gaagtgacag gtggtgcatg gttgtcgtca 1080

48、0160 gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccccta tccttagtag 1140 0161 ccatcattaa gttgggcact ctagggagac tgccagggat aacttggagg aaggtgggga 1200 0162 tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgttt agggctacac acgtgctaca atggctgcta 1260 0163 caaagggaag caatgccgcg aggccgagcg aacctcaaaa aagcagtccc agttcggatt 1

49、320 0164 gtagtctgca actcgactac atgaagttgg aatcgctagt aatcgcgaat cagaatgtcg 1380 0165 cggtgaatac gttcccgggt cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga gttgaggggg 1440 0166 cccaacgtcg gtgacccaac ccgtaaggga gggagccgcc taaggcaaaa tcaataactg 1500 0167 gggtgaagtc gtaacaaggt agccgtatcg gaaggtgcgg ctggatc 1547 说 明 书