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1、10申请公布号CN102002529A43申请公布日20110406CN102002529ACN102002529A21申请号201010554974622申请日20101122C12Q1/68200601C12Q1/06200601G01N21/6420060171申请人浙江省疾病预防控制中心地址310051浙江省杭州市滨江区信诚路630号72发明人金大智罗芸张政程苏云韩建康74专利代理机构杭州天正专利事务所有限公司33201代理人黄美娟冷红梅54发明名称碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的荧光检测试剂盒及检测方法57摘要本发明提供了一种碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的荧光检测试剂盒及检测方法。所述试剂盒中。
2、特异性引物和荧光探针序列如下上游引物5ACTGGGCGCGCACCTA3，下游引物5TCGCTGTGCTTGTCATCCTT3，荧光探针5FAMCCGTCTACACCCGGGCGCCTAMRA3，其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。本发明的有益效果主要体现在使用本发明检测试剂盒，碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的检测敏感性高，特异性好，降低了常规PCR扩增的假阳性率；可实现对碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的快速、准确、特异检测。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页附图2页CN102002540A1/1页21一种碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的荧光检。
3、测试剂盒，所述试剂盒主要包括特异性引物和荧光探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，其特征在于所述特异性引物和荧光探针序列如下上游引物5ACTGGGCGCGCACCTA3下游引物5TCGCTGTGCTTGTCATCCTT3荧光探针5FAMCCGTCTACACCCGGGCGCCTAMRA3其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。2如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌基因标准品，所述标准品序列如下GGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCGCACCTATTGTGTTGGCCGTCTACA。
4、CCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGGCCGTCATCGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGG。3一种碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的PCR检测方法，所述方法包括1提取待测样本DNA；2取特异性扩增引物及特异性探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，分别加入阴性对照品或待测样品DNA配成PCR反应体系，于同等条件下进行PCR扩增反应，反应管置于定量荧光PCR仪进行荧光检测；所述特异性引物和荧光探针序列如下上游引物5ACTGGGCGCGCACCTA3下游引物5TCGCTGTGCTTGTCATCCTT3荧光探针5FAMCCGTCTACA。
5、CCCGGGCGCCTAMRA3其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团；3选择荧光检测模式FAM荧光，基线调整取315个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，则判断为阳性。4如权利要求3所述的方法，其特征在于所述方法同时以梯度浓度的标准品DNA溶液在与样品DNA相同条件下进行PCR扩增反应，以标准品DNA溶液拷贝浓度的对数值为横坐标、标准品CT值为纵坐标绘制标准曲线；根据样品DNA测得的CT值，对照标准曲线，获得样品DNA的拷贝浓度；所述标准品DNA序列如下GGCACGGCAAATGACTATGCCGT。
6、CGTCTGGCCCACTGGGCGCGCACCTATTGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGGCCGTCATCGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGG。5如权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述PCR扩增反应条件如下95变性2分钟，9515秒、6030秒进行40个循环扩增。权利要求书CN102002529ACN102002540A1/5页3碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的荧光检测试剂盒及检测方法一技术领域0001本发明涉及一种碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的荧光检测试剂盒及检测方法。二背景技术0002抗药性细菌KPC也就。
7、是碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌KLEBSIELLAPNEUMONIAECARBAPENAMASE，最早在一株亚胺培南耐药的肺炎克雷伯菌中被发现，属于BUSH分类的2F组，AMBLER分类的A类，能够水解碳青霉烯类、青霉素类、头孢菌素类和氨曲南等抗生素。目前已有5个KPC亚型被国内外研究发现，碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌属于2型。碳青霉烯类药物通常用于对付其他抗生素无法应付的细菌感染，具有非常广泛的抗菌活性，因能抵抗大多数内酰胺酶的水解，故常用于产超广谱内酰胺酶ESBL和/或去阻遏AMPC内酰胺酶AMPC菌株引起严重感染的治疗。但是碳青霉烯耐药肠杆菌的出现，给临床治疗带来了极大困难。从2000年以后，K。
8、PC酶家族陆续在美国的新英格兰和亚特兰大地区被发现，主要在克雷伯菌属中，也在其他菌株中被发现。由于肠杆菌是临床上重要的医院感染菌，其对碳青霉烯类抗菌药物的耐药给临床抗感染治疗带来了极大困难。KPC细菌被视为突破了临床治疗的最后一道防线碳青霉烯类抗生素的生物体，碳青霉烯类抗生素都对它起不了作用。0003据报道，巴西卫生部门2010年10月19日表示，截至10月15日，这种KPC超级细菌已经在首都巴西利亚造成15人死亡，另有135人被感染，发病数量在过去几个星期以来人数不断激增。美国卫生员说，现有抗生素几乎全都无法控制的一种超级细菌，已出现在美国35州医院，其中纽约和新泽西出现感染最多。这种具有新。
9、基因的超级细菌也在世界其他地方扩散。美国医院发现的这些细菌尤其容易感染危重病人，而且4亡率高达30至60。美国疾病预防控制中心说，虽然KPC细菌在纽约和新泽西州最常见，可是美国一半以上的州都发现其踪影。10年前美国各地医院发现的KPC细菌，只有1对碳青霉烯类抗生素具有抗药性，现在比率已超过8。我国KPC2酶基因主要见于我国华东地区，而其它地区鲜有报道。由于KPC细菌对临床抗生素的使用产生极大影响，因此有必要建立一种碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌KPC快速、有效的诊断方法。三发明内容0004本发明目的是根据碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌基因设计引物和TAQMAN探针，提供一种检测碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的荧。
10、光检测试剂盒及其检测方法，可实现对碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌进行快速、准确、特异检测。0005本发明采用的技术方案是0006一种碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的荧光检测试剂盒，所述试剂盒主要包括特异性引物和荧光探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，所述特异性引物和荧光探针序列如下0007上游引物5ACTGGGCGCGCACCTA3说明书CN102002529ACN102002540A2/5页40008下游引物5TCGCTGTGCTTGTCATCCTT30009荧光探针5FAMCCGTCTACACCCGGGCGCCTAMRA30010其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。。
11、0011本发明关键在于特异性引物和荧光探针序列的设计，试剂盒中其他组成，可按本领域常规进行选择，该试剂盒可用作碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的定性检测，也可加入标准品进行定量检测。0012优选的，所述试剂盒中还可包括碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌基因标准品，所述标准品序列如下GGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCGCACCTATTGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGGCCGTCATCGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGG。以标准品的梯度浓度的DNA溶液进行荧光PCR检测，根据。
12、拷贝浓度的对数值与标准品CT值的关系可绘制得到标准曲线，测得样品DNA的CT值后，对照标准曲线即可获得样品DNA的拷贝浓度。0013本发明还涉及一种碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的PCR检测方法，所述方法包括00141提取待测样本DNA；00152取特异性扩增引物及特异性探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，分别加入阴性对照品或待测样品DNA配成PCR反应体系，于同等条件下进行PCR扩增反应，反应管置于定量荧光PCR仪进行荧光检测；0016所述特异性引物和荧光探针序列如下0017上游引物5ACTGGGCGCGCACCTA30018下游引物5TCGCTGTGCTTGTCATCCTT3。
13、0019荧光探针5FAMCCGTCTACACCCGGGCGCCTAMRA30020其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团；0021所述阴性对照品可按本领域常规方法选择，通常选择非靶细菌，如副溶血性弧菌、志贺菌、沙门菌、非耐药肺炎克雷伯氏菌等。00223选择荧光检测模式FAM荧光，基线调整取315个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，则判断为阳性。0023为达到定量检测的要求，所述方法可同时以梯度浓度的标准品DNA溶液在与样品DNA相同条件下进行PCR扩增反应，以标准品DNA溶液拷贝浓度的对数值为横坐标。
14、、标准品CT值为纵坐标绘制标准曲线；根据样品DNA测得的CT值，对照标准曲线，获得样品DNA的拷贝浓度；所述标准品DNA序列如下GGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCGCACCTATTGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGGCCGTCATCGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGG。0024所述PCR反应条件可按参照本领域常规荧光定量PCR方法，优选的，所述PCR扩增反应条件如下95变性2分钟，9515秒、6030秒进行40个循环扩增。0025PCR反应液通常按如下组成。
15、配制终浓度PCRBUFFER终浓度为1、0305M的引物、0103M的荧光探针、125U的DNA聚合酶、0204MM的DNTPS，通常取2L约50NG/L的模板，反应总体积通常为2050L。PCRBUFFER终浓度为1，是指缓冲液中各组分终浓度与1PCRBUFFER相同，通常采用市购2PCRBUFFER，说明书CN102002529ACN102002540A3/5页5体积用量为PCR反应液体系总体积的1/2。1PCRBUFFER组成如下KCL50MM，TRISHCL10MM，TRITONX10001，MGCL215MM。0026本发明建立了利用TAQMAN荧光定量PCR技术检测碳青霉烯酶肺炎克。
16、雷伯氏菌的方法，并经检测临床样本，表明该方法切实可行。由于本方法采用了PCR扩增技术，使得碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌检测的敏感性大大提高，而且由于荧光探针的应用，使得其特异性亦大大提高，降低了常规PCR扩增的假阳性率，使得我们可以在极少的标本中获得足够的监测信息。0027本发明采用了目前较先进的特异性荧光探针杂交定量PCR检测技术，在保持高敏感性的前提下尽量减少假阳性干扰。在实时荧光定量PCR检测技术出现之前，人们对PCR模板的定量不论是直接PCR还是竞争性PCR，基本上都要通过PCR产物电泳，再将电泳结果经计算机图像处理，根据电泳条带的亮度来确定最终PCR产物量的多少，或将带标记的PCR产物以。
17、ELISA的方式进行检测，再由此推测起始模板的量，但这些方法实际上都属于半定量水平，因为即使PCR条件已优化到最佳程度，电泳及后续步骤的操作的不稳定性仍会给结果分析带来影响，从而影响定量这的结果。随着实时荧光定量PCR技术的出现，人们可以真正地做到对PCR模板的精确定量，这种定量不仅保持了常规PCR的高灵敏性，而且由于特异性荧光探针杂交技术的应用，使得被检测基因的特异性大大提高。0028本发明的有益效果主要体现在碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的检测敏感性高，特异性好，降低了常规PCR扩增的假阳性率；可实现对碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌快速、准确、特异检测。四附图说明0029图1为实时荧光定量PCR标准品。
18、检测碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌实时荧光定量PCR标准品检测结果，从左至右分别为107、106、105、104、103、102、101COPIES/L标准品。0030图2为实时荧光定量PCR标准曲线。标准曲线为Y3494LGX34916；Y对应的CT值；X碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌基因的COPIES。0031图3为不同浓度的5例临床标本荧光定量PCR检测结果，CT值分别为2432、2509、2815、2891和3297，拷贝数分别为658104COPIES/L、309104COPIES/L、741102COPIES/L、225102COPIES/L和0003COPIES/L。五具体实施方式0032下。
19、面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此0033实施例100341、材料0035细菌基因组DNA提取试剂购自大连宝生物工程有限公司；限制性内切酶购自美国LTI/GIBCO公司，PGEMTEASY克隆系统、TAQDNA聚合酶购自美国PROMEGA公司，测序试剂、377型测序仪、BIORADICYCLERPCR仪、ROTORGENEQ5PLEX型定量PCR仪QIAGEN公司。00362、引物及探针设计与合成说明书CN102002529ACN102002540A4/5页60037以碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌基因序列注册号为AY034847为模板，使用PRIMEREXPRE。
20、SSTMV20，美国ABI公司软件分析TAQMAN引物和探针位点，从中选择最佳组合。0038标准品PCR序列0039上游引物5GGCACGGCAAATGACTATGC3，0040下游引物5CCCTCGAGCGCGAGTCTAGC3，0041检测用PCR序列为0042上游引物5ACTGGGCGCGCACCTA30043下游引物5TCGCTGTGCTTGTCATCCTT30044荧光探针5FAMCCGTCTACACCCGGGCGCCTAMRA30045其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。0046均由上海辉睿生物科技有限公司合成。00473、检测标准品制备0048采用ABI394寡核。
21、苷酸合成仪根据碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌基因序列中标准品PCR序列的位置，全基因合成140BP的寡核苷酸片段。用标准品上下游引物在BIORADICYCLERPCR仪上进行PCR扩增0049PCR反应液组成如下00502PCRBUFFER100L0051标准品上游引物10M1L0052标准品下游引物10M1L0053DNA聚合酶5U/L02L0054DNTPS各250MM16L0055DATP、DTTP、DCTP、DGTP物质的量比11110056模板DNA50NG/L1L0057水补足至20L。0058PCR条件为945分钟变性，9420秒、5520秒、7220秒进行35个循环扩增，最后于72延。
22、伸5分钟后置4。0059PCR产物经电泳检测后即用克隆系统插入PGEMTEASY克隆载体，并将阳性克隆经测序验证。回收140BP片段，即为标准品，测定浓度并换算成拷贝数/体积。00604、结果0061经测序，上述设计标准品完全与预期相符，回收的标准品片段序列如下GGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCGCACCTATTGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGGCCGTCATCGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGSEQIDNO4。0062实施例2荧光定量PCR法检测临床。
23、样本00631、标本检测00645例人工模拟标本，采用基因组DNA提取试剂提取基因组DNA，分别取10L做模板，用检测用上下游引物在ROTORGENEQ5PLEX型定量PCR仪QIAGEN公司上进行PCR扩增。说明书CN102002529ACN102002540A5/5页70065PCR反应液组成如下00662PCRBUFFER100L0067检测用上游引物10M1L0068检测用下游引物10M1L0069检测用荧光探针10M05L0070DNA聚合酶5U/L02L0071DNTPS各250MM160L0072DATP、DTTP、DCTP、DGTP物质的量比11110073模板DNA50NG/。
24、L1L0074水补足至20L。0075PCR反应条件为95预变性2分钟，9515秒、6030秒进行40个循环扩增。0076以非耐药肺炎克雷伯氏菌ATCC700603为阴性对照于相同条件下进行PCR检测，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，则判断为阳性，否则判断为阴性。0077同时在相同条件下以不同浓度标准品进行检测，并绘制标准曲线。0078待测样本的测定结果经仪器处理根据标准曲线计算出检测样本中的碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌基因的数量。0079以副溶血性弧菌ATCC17802、志贺菌ATCC12022、沙门菌ATCC50035、金黄。
25、色葡萄球菌ATCC25933、非耐药肺炎克雷伯氏菌ATCC13883和空肠弯曲菌ATCC33560菌株按照上述方法进行PCR检测，检测结果均呈阴性，说明本发明方法特异性好。00802、样品检测结果0081标准品检测结果参见图1，标准曲线参见图2。00825例临床标本检出碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌阳性，检测结果参见图35例阳性临床标本荧光定量PCR检测结果，CT值分别为2432、2509、2815、2891和3297，拷贝数分别为658104COPIES/L、309104COPIES/L、741102COPIES/L、225102COPIES/L和0003COPIES/L。0083本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。说明书CN102002529ACN102002540A1/2页8图1图2说明书附图CN102002529ACN102002540A2/2页9图3说明书附图CN102002529A。