棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GHMAPK16的克隆及其应用.pdf

本发明涉及一种棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因的克隆、重组及抗盐性功能分析和应用，属于分子生物学和生物技术领域。本发明从棉花幼叶中提取总RNA，反转录得到cDNA。根据其它植物中促丝裂原活化蛋白激酶基因的保守氨基酸序列，设计兼并引物，进行常规聚合酶链式反应，将PCR产物与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选重组子，进行序列分析，再通过3′和5′末端快速扩增技术获得全长cDNA。进一步构建植物正义表达载体，转化烟草栽培品种NC89，转基因烟草具有明显的抗盐能力，将该基因转化棉花、小麦、玉米等农作物，可提高作物抗盐能力，提高其产量和品质，具有重大的经济价值和社会价值。

1.  一种棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK16，其特征在于它具有核苷酸序列SEQ.ID.NO.1；具有氨基酸序列SEQ.ID.NO.2。

2.  根据权利要求1所示的核苷酸序列，其特征在于该基因选自棉花。

3.  实现权利要求1所述的一种克隆棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因的方法，步骤为：
A、根据国际基因库中已发布的其它植物中促丝裂原活化蛋白激酶基因的保守氨基酸序列，设计兼并引物；B、棉花幼叶中提取总RNA，进行常规反转录-聚合酶链式反应；C、将PCR产物与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选重组子，进行序列分析；D、通过3′和5′末端快速扩增技术分别获得3′和5′端序列，并拼接成完整的cDNA序列。

4.  根据权利要求1所述的编码促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK16的应用，其特征在于该基因在烟草栽培品种NC89中过量表达，能提高转基因烟草抗盐能力，该基因可应用在农作物中以提高其抗盐能力。

棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK16的克隆及其应用
一、技术领域
本发明涉及一种棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK16的克隆、重组及转基因烟草抗盐能力的分析和应用，属于分子生物学和生物技术领域。
二、背景技术
我国农作物生产中的淡水、土地等资源严重匮乏已严重制约着我国农业的可持续发展，可耕地中有近三分之一面积的土地受到不同程度盐渍化的影响，而且盐渍化耕地面积还在逐年增加。此外，我国还有15亿亩以上的荒地和滩涂是盐碱地。据保守估计，盐碱、低温等环境胁迫造成的我国主要农作物减产每年高达总产的15％以上，其中土壤含盐量是限制农作物产量的关键因素。高浓度的盐溶液能引起植物的高渗透胁迫，导致植物发育不良，生长缓慢，甚至死亡，以致大大降低农作物产量。因此，提高农作物的抗盐能力越来越受到人们的重视。早期提高作物抗盐能力的措施主要是改善土壤结构、改进栽培管理技术和传统的杂交育种。通过改善土壤结构来增强作物适应性的措施周期长、成本高。通过改进栽培管理技术来提高植物的抗盐能力的措施也收效甚微。而传统的育种方式由于育种周期长、工作量大、成本高，加之绝大多数植物缺少抗盐或耐盐基因，因此，通过传统的育种方式来提高植物的抗盐能力已远远无法满足人们的要求。近年来，植物分子生物学和基因工程技术的发展给植物抗盐育种开辟了新途径。寻找与抗盐相关的基因并研究其具体功能，通过转基因技术提高作物的抗盐能力已成为一种行之有效的方法。
植物能产生一系列主动适应机制来应对各种内外因素的影响，并将信号在细胞内与细胞间进行快速传递。20世纪90年代以来，细胞信号转导的研究引起了国内外生物界极为广泛的关注。近年来的研究表明，信号转导过程是一个立体网络系统，促丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联反应途径位于网络中心，它通过磷酸化和去磷酸化将多种胁迫信号逐级放大并传递到靶分子，引起细胞的一系列抗逆反应。植物中的MAPK级联途径与机械损伤、干旱、低温、高盐、植物激素、生长发育以及病原物的侵染等各种刺激反应相关联(Jonak et al.，2004；Xiong and Yang，2003；Agarawal et al.，2002；Zhang and Klessig，1998；彭立新等，2003)。当植物受到高盐胁迫时，MAPK基因会被诱导而高效表达。
三、发明内容
本发明从棉花幼叶中提取总RNA，反转录得到cDNA。根据国际基因库中已发布的其它植物中促丝裂原活化蛋白激酶基因的保守氨基酸序列，设计兼并引物，进行常规聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)。将PCR产物与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选重组子，进行序列分析。然后通过3′和5′末端快速扩增(Rapid-amplification of cDNA ends，RACE)技术分别获得3′和5′端序列，并拼接成完整的cDNA序列。根据cDNA的3′和5′端序列设计特异引物，以棉花幼叶的cDNA为模板进行PCR扩增，得到cDNA全长序列，将该cDNA命名为GhMAPK16。
该基因的全长cDNA为2030bp，其中开放阅读框部分为1662bp。由此推得，该基因具有554个氨基酸。将其氨基酸序列在GenBank中检索，发现与已发表的OsMPK16-1(水稻，EU779804)、ZmMPK6(玉米，NM_001111768)、AtMPK16(拟南芥，NM_121906)相比，氨基酸同源性分别为73.84％、76.02％、75.31％。由此表明，经过上述克隆步骤得到了编码棉花促丝裂原活化蛋白激酶的基因GhMAPK16。
该基因序列如下：
序列表
(1)SEQ.ID.NO.1的信息
(a)序列特征
长度：2030bp
类型：核酸
链型：双链
拓扑结构：线性
(b)分析类型：cDNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：棉花
(f)序列描述：SEQ.ID.NO.1
AACTTGGTTT CTACTATTAC TTTGGGGGCT TCCTGTTTGA TGCCAATTGT TTTCTGTTTC  60
CAAAGTTTTG ATGCTAAGCAGCCTGAT CAGAGAAGAA AGTCAGCTGC GGATGTAGAT  120
TTTTTCACTG AATATGGTGA GGGAAGCAGG TATAGAATAG AGGAAGTAAT TGGAAAAGGA 180
AGCTATGGTG TTGTTTGTTC AGCGTATGAC ACTCATACTG GAGAAAAGGT TGCTATTAAG 240
AAAATCAATG ATATATTTGA ACATGTATCT GACGCCACCC GAATCCTCAG AGAGATTAAA 300
CTTCTCAGGC TCCTACGTCA TCCAGACATT GTTGAGATCA AGCACATATT GTTCCCTCCT 360
TCAAGAAGGG AATTTAAAGA TATATACGTG GTATTTGAAC TTATGGAATC TGATTTACAC 420
CAGGTTATCA AAGCAAATGA TGATTTGACC CCAGAACACT ACCAGTTTCT TCTTTATCAG 480
CTTCTTCGGG GCCTGAAATA CATTCACACA GCTAATGTTT TTCATCGGGA TCTAAAGCCG 540
AAAAATATCT TAGCCAATGC TGATTGCAAA CTGAAGATCT GTGATTTTGG GCTTGCAAGA 600
GTAGCTTTTA ATGACACCCC CACTGCAATA TTCTGGACGG ACTATGTTGC AACAAGATGG 660
TACAGGGCTC CGGGATTGTG TGGATCCTTT TTCTCCAAGT ATACCCCAGC AATAGATATA   720
TGGAGCATTG GGTGCATCTT TGCTGAACTT CTAACAGGGA AACCTCTGTT TCCTGGAAAA   780
AATGTTGTCC ATCAATTGGA TCTGATGACT GATCTTTTGG GAACACCATC TGCTGAAGCC   840
ATTGCTAGGG TGCGTAATGA GAAAGCTCGG AGATACTTGA GCAGCATGCG AAAGAAAAAG   900
CCAATTCCTC TCTCCCACAA GTTCCCTAAT GCAGATCCTC TTGCTGTTCT TTTGTTAGAA   960
AGGATGCTTG CTTTTGAACC CAAGGATCGA CCTAGTGCTG AAGAGGCCCT AGCTGATCCA  1020
TATTTCAAGG GGTTGGCCAA AGTTGAAAGG GAGCCTTCCG CACAACCAGT TACCAAGATG  1080
GAATTTGAGT TTGAGAGACG TAGGATTACA AAGGAAGATG TTAGGGAGCT CATATACCGT  1140
GAAATTCTTG AGTATCATCC TAAAATGTTG AAAGAGTATC TGGAAGGATC AGAGCCAACT  1200
GGCTTCATGT ATCCAAGTGC GGTTGACCAT TTCAAGAAGC AGTTTGCCTT CCTTGAGGAG  1260
CACTATGGAA ATGGTACGAC TGCAGCTCCA CTTGAGAGAC AACATGCATC TTTGCCAAGG  1320
CCATGTGTGT TATATTCAGA TAATTCAGTA CAAAACTCAA CAGATGTGAC AGATAACTTA  1380
TCTAAATGTT CCATCAAGGA AACTGAGAAA CCCCAACCAG AGAGAAGCTT TCCAATCCCT  1440
ATGTCAAGGC TTCCCCCTCA AGTTCCTCAA AGCATCCAAG GTGCTGCCAG ACCTGGGAAA  1500
GTAGTTGGAT CAGTATTGCG ATACAACAAT TGTGGGGCAG TAGCCGCAGG TGAGGCTCTT  1560
GAACAGCGAA GAATGGCTCG GAATCCTTCA GTTCCAACTC AGTATACTGC CACAAATTGT  1620
TCATATCCAC GGAGAAATCC TGTCTGTAAA GATGATGAAG AAAATGAATT GCAGCCAAAA  1680
CCCCAGTACA TGGCTAGGAA AGTTGCTGCT GCCCAAGGTG GATCAAGAAG TCAGTGGTAT  1740
CCTAATA TCAACTACAA ATGGCCAACA AAAAAGGCCG GTGAGGATTT ACTCCCAAAT  1800
TGCTCTTCCT ACTGCTGGTT GAGGAAAGCT CAGACAAGTT ACAAGTGAAG CTATGCATTG  1860
TAATTTATAG CACTAATTTC AAAGAGATGA AACTGTGCCT TCTTATCCTT CATAAGATAT  1920
GTGAAAGTTA GAGACTTGAG GAAAAGGCAA AAGTGAACTC TGTAACTTAT GAAGTTGGTT  1980
CTCTACTTTA TTTATTCTTT ATTAACACCC TTAAAAAAAA AAAAAAAAAA             2030
其中透明方框内的为起始密码子，灰色方框内的为终止密码子。
(3)SEQ.ID.NO.2的信息
(a)序列特征
长度：554个氨基酸
类型：氨基酸
链型：单链
拓扑结构：线性
(b)分析类型：蛋白质
(c)序列描述：SEQ.ID.NO.2
Met Gln Pro Asp Gln Arg Arg Lys Ser Ala Ala Asp Val Asp Phe Phe
1               5                   10                  15
Thr Glu Tyr Gly Glu Gly Ser Arg Tyr Arg Ile Glu Glu Val Ile Gly
            20                  25                  30
Lys Gly Ser Tyr Gly Val Val Cys Ser Ala Tyr Asp Thr His Thr Gly
        35                  40                  45
Glu Lys Val Ala Ile Lys Lys Ile Asn Asp Ile Phe Glu His Val Ser
    50                  55                  60
Asp Ala Thr Arg Ile Leu Arg Glu Ile Lys Leu Leu Arg Leu Leu Arg
65                  70                  75                  80
His Pro Asp Ile Val Glu Ile Lys His Ile Leu Phe Pro Pro Ser Arg
                85                  90                  95
Arg Glu Phe Lys Asp Ile Tyr Val Val Phe Glu Leu Met Glu Ser Asp
            100                 105                 110
Leu His Gln Val Ile Lys Ala Asn Asp Asp Leu Thr Pro Glu His Tyr
        115                 120                 125
Gln Phe Leu Leu Tyr Gln Leu Leu Arg Gly Leu Lys Tyr Ile His Thr
    130                 135                 140
Ala Asn Val Phe His Arg Asp Leu Lys Pro Lys Asn Ile Leu Ala Asn
145                 150                 155                 160
Ala Asp Cys Lys Leu Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Val Ala
                165                 170                 175
Phe Asn Asp Thr Pro Thr Ala Ile Phe Trp Thr Asp Tyr Val Ala Thr
            180                 185                 190
Arg Trp Tyr Arg Ala Pro Gly Leu Cys Gly Ser Phe Phe Ser Lys Tyr
        195                 200                 205
Thr Pro Ala Ile Asp Ile Trp Ser Ile Gly Cys Ile Phe Ala Glu Leu
    210                 215                 220
Leu Thr Gly Lys Pro Leu Phe Pro Gly Lys Asn Val Val His Gln Leu
225                 230                 235                 240
Asp Leu Met Thr Asp Leu Leu Gly Thr Pro Ser Ala Glu Ala Ile Ala
                245                 250                 255
Arg Val Arg Asn Glu Lys Ala Arg Arg Tyr Leu Ser Ser Met Arg Lys
            260                 265                 270
Lys Lys Pro Ile Pro Leu Ser His Lys Phe Pro Asn Ala Asp Pro Leu
        275                 280                 285
Ala Val Leu Leu Leu Glu Arg Met Leu Ala Phe Glu Pro Lys Asp Arg
    290                 295                 300
Pro Ser Ala Glu Glu Ala Leu Ala Asp Pro Tyr Phe Lys Gly Leu Ala
305                 310                 315                 320
Lys Val Glu Arg Glu Pro Ser Ala Gln Pro Val Thr Lys Met Glu Phe
                325                 330                 335
Glu Phe Glu Arg Arg Arg Ile Thr Lys Glu Asp Val Arg Glu Leu Ile
            340                 345                 350
Tyr Arg Glu Ile Leu Glu Tyr His Pro Lys Met Leu Lys Glu Tyr Leu
        355                 360                 365
Glu Gly Ser Glu Pro Thr Gly Phe Met Tyr Pro Ser Ala Val Asp His
    370                 375                 380
Phe Lys Lys Gln Phe Ala Phe Leu Glu Glu His Tyr Gly Asn Gly Thr
385                 390                 395                 400
Thr Ala Ala Pro Leu Glu Arg Gln His Ala Ser Leu Pro Arg Pro Cys
                405                 410                 415
Val Leu Tyr Ser Asp Asn Ser Val Gln Asn Ser Thr Asp Val Thr Asp
            420                 425                 430
Asn Leu Ser Lys Cys Ser Ile Lys Glu Thr Glu Lys Pro Gln Pro Glu
        435                 440                 445
Arg Ser Phe Pro Ile Pro Met Ser Arg Leu Pro Pro Gln Val Pro Gln
    450                 455                 460
Ser Ile Gln Gly Ala Ala Arg Pro Gly Lys Val Val Gly Ser Val Leu
465                 470                 475                 480
Arg Tyr Asn Asn Cys Gly Ala Val Ala Ala Gly Glu Ala Leu Glu Gln
                485                 490                 495
Arg Arg Met Ala Arg Asn Pro Ser Val Pro Thr Gln Tyr Thr Ala Thr
            500                 505                 510
Asn Cys Ser Tyr Pro Arg Arg Asn Pro Val Cys Lys Asp Asp Glu Glu
        515                 520                 525
Asn Glu Leu Gln Pro Lys Pro Gln Tyr Met Ala Arg Lys Val Ala Ala
    530                 535                 540
Ala Gln Gly Gly Ser Arg  Ser Gln Trp Tyr
545                 550
本发明还提供了编码促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK16在农作物中应用的方法，可提高作物的抗盐能力。步骤为：
(a)利用棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK16，将cDNA序列置于CaMV 35S启动子之下，构建植物表达载体。
(b)将表达载体转入农杆菌LBA4404感受态细胞。
(c)利用(b)获得的转化子转化植物，得到转基因植株。
本发明从棉花中分离出一种编码促丝裂原活化蛋白激酶的基因(GhMAPK16)，将该cDNA序列构建在由组成型CaMV 35S强启动子控制的真核转化载体pBI121上，构建了GhMAPK16的正义表达载体，采用农杆菌介导的方法转化烟草栽培品种NC89。对获得的转基因烟草进行抗盐能力分析表明，转基因烟草中GhMAPK16的过量表达能提高其抗盐能力。在含200mM NaCl的GM固体培养基上，转基因烟草可正常生长，而非转基因烟草发育迟缓。在土壤中生长6周后对其定时定量浇灌浓度为200mM的NaCl溶液，相对于非转基因烟草，转基因植株具有明显的抗盐能力。该基因转化棉花、小麦、玉米等农作物，可提高其抗盐能力，提高其产量和品质，具有重大的经济价值和社会价值。
四、附图说明
图1.棉花中GhMAPK16氨基酸序列与几种其它植物的MAPK氨基酸序列的比较结果。其中相同的氨基酸残基用黑底表示。它们在GenBank中的注册号及其物种来源分别为：OsMPK16-1(水稻，EU779804)、ZmMPK6(玉米，NM_001111768)、AtMPK16(拟南芥，NM_121906)。
图2.烟草正义表达载体的构建程序。
图3.部分转基因植株的PCR鉴定结果。CK-：非转基因对照；CK+：pBI121质粒作为阳性对照；1-12：转基因烟草植株M：markerDL2000
图4.过量表达GhMAPK16的转基因烟草与非转基因烟草在含200mMNaCl的GM固体培养基上的生长状况比较。A：转基因烟草；B：非转基因烟草
图5.转基因烟草与非转基因烟草在土壤中的生长状况。生长6周后对其浇灌浓度为200mM的NaCl溶液，每次定量浇30ml，每周浇2-3次，维持3周。然后用清水浇灌，使其恢复一周。A：转基因烟草；B：非转基因烟草
五、具体实施方式
实施方式(一)：一种棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK16的克隆方法
1.RNA的提取：利用TRIZOL试剂盒提取棉花总RNA
2.cDNA第一链的合成
在0.25ml离心管中加入下列试剂：
mRNA                4μl
oligo d(T)引物      2μl
DEPC-H₂O            6μl
吸打混匀后65℃水浴5min，冰上冷却5min，轻离心，加入下列试剂：
5×First-Strand Buffer             4μl
Rnasin Ribonuclease Inhibitor      1μl
10mM dNTP                          1μl
EasyScript Reverse Transcriptase   1μl
0.1M DTT                           2μl
轻轻敲打混匀，稍离心后，42℃保温1h，然后-20℃保存备用。
3.cDNA的5′加尾反应
(a)反应体系：
cDNA                    20μl
5×TdT Buffer           10μl
0.1％BSA                5μl
100mM dCTP              1μl
TdT                     1μl
ddH₂O Up to             50μl
(b)37℃保温30min。
(c)加100μl无水乙醇，-20℃沉淀30min。
(d)12,000rpm，室温离心5min。弃上清，干燥后加适量ddH₂O回溶。
4.cDNA全长序列的获得
4.1用兼并引物进行PCR反应获得GhMAPK16中间片段体系如下：
10×EasyTaq buffer        2.5μl
dNTP mixture(10mM)        1μl
MP1(10μM)                1μl
MP2(10μM)                1μl
cDNA                      1μl
Taq E                     0.25μl
ddH₂O Up to               25μl
反应程序为：
94℃5min

72℃5min
反应完毕后，电泳检测结果并回收正确片段。将所得片段连入pMD18-T，取PCR产物4μl与pMD18-T载体连接，操作步骤按照TaKaRa公司产品pMD18-T Vector说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB固体培养基上培养过夜。挑取白色菌落至LB液体培养基中培养3h，进行菌液PCR鉴定。将正确的菌样在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB液体培养基中培养过夜。碱法小量提取质粒DNA，酶切鉴定后进行序列测定。
4.25′RACE获得5′端序列
(a)用上述反转录产物进行PCR，体系如下：
10×EasyTaq buffer            2.5μl
dNTP mixture(10mM)            1μl
AAP(10μM)                    1μl
5P1(10μM)                    1μl
cDNA                          1μl
Taq E                         0.25μl
ddH₂O Up to                   25μl
(b)反应程序为：
94℃5min

72℃5min
(c)同样的体系和反应程序以第一次PCR产物为模板做二次PCR，引物为AUAP和5P2。
(d)将所得片段连入pMD18-T，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，对生长的菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切鉴定，然后进行序列测定。
4.33′RACE获得3′端序列
(a)用上述反转录产物进行PCR，体系如下：
10×EasyTaq buffer        2.5μl
dNTP mixture(10mM)        1μl
B26(10μM)                1μl
3P1(10μM)                1μl
cDNA                      0.5μl
Taq E                     0.25μl
ddH₂O Up to               25μl
(b)反应程序为：
94℃5min

72℃5min
(c)以同样的体系和反应程序，用第一次PCR产物为模板做二次PCR，引物为B25和3P2。
(d)将所得片段连入pMD18-T，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，对生长的菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切鉴定，然后进行序列测定。
4.4cDNA全长序列的获得
根据已测定序列及其重叠区域，拼出目的基因的全长cDNA，设计引物HP1和引物HP2，PCR扩增全长序列作进一步的验证。
(a)反应体系：
10×EasyTaq buffer        2.5μl
dNTP mixture(10mM)        1μl
HP1(10μM)                1μl
HP2(10μM)                1μl
cDNA                      0.5μl
Taq E                     0.25μl
ddH₂O Up to               50μl
(b)反应程序：
94℃5min

72℃5min
(c)将所得片段连入pMD18-T，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，对生长的菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切鉴定，然后进行序列测定。
5.同源检索：利用BLAST软件将分离出的全长cDNA序列与GenBank中的序列进行比较。
实施方式(二)：棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK16的序列见SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2。
实施方式(三)：表达载体的构建
(1)根据分离出的棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因的核苷酸序列，设计引物：
正向引物：5′-TCTAGAGGGGCTTCCTGTTTGATGCC-3′
划横线部分为Xba I酶切位点
反向引物：5′-GTCGACGGGGCTTCCTGTTTGATGCC-3′
划横线部分为Sal I酶切位点
以棉花幼叶的总RNA反转录得到的cDNA为模板，进行PCR反应。
(2)取PCR产物4μl与pMD18-T Simple载体连接，操作步骤按照TaKaRa公司产品pMD 18-T Simple Vector说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有卡那霉素(50mg/L)的LB固体培养基上培养过夜。挑取白色菌落至LB液体培养基中培养3h，进行菌液PCR鉴定。将正确的菌样在含有卡那霉素(50mg/L)的LB液体培养基中培养过夜。碱法小量提取质粒DNA，酶切鉴定后进行序列测定。
(3)将PCR扩增得到目的片段用Xba I和Sal I酶切，与用相同的限制性内切酶酶切的pBI121表达载体连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，然后在含卡那霉素(50mg/L)的LB固体培养基上培养，对生长的菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切鉴定。
(4)将构建好的表达载体转化农杆菌LBA4404感受态细胞，本发明采用的是冻融法转化农杆菌。
实施方式(四)：转基因植物的获得
(1)烟草NC89种子，播种于MS基本培养基中，至5-6片真叶期，备用。
(2)挑取农杆菌(携带重组质粒的农杆菌单菌落)接种于含有50mg/L卡那霉素的YEP培养基中，28℃，250rpm，振荡培养约48h，至对数生长后期；将菌液用MS培养液稀释10倍，待用。
(3)取烟草叶片，剪成小块(0.5×0.5cm)，将剪好的烟草叶片，置于MS预分化培养基中，28℃，光照时间16h/d，光照强度2,000Lux，预培养2d。
(4)将预培养后的烟草叶片浸入菌液5-10min，然后用灭菌的滤纸吸干多余菌液，接入MS基本培养基；弱光下，28℃共培养2d。
(5)共培养后的外殖体先用含羧苄青霉素250mg/L的无菌水洗涤3次，再用含羧苄青霉素250mg/L的MS培养液洗1次，然后用灭菌滤纸吸干，转入含有卡那霉素100mg/L，羧苄青霉素250mg/L的MS选择培养基上，恒温培养(条件同预培养)；每15d更换一次培养基。
(6)待芽长至1cm左右时，切下，移入MS生根培养基(附加卡那霉素50mg/L，羧苄青霉素250mg/L)中，促其生根。
(7)根系发育好后(5-6片叶)，移入盛有无菌土的花盆中，温室常规管理。
实施方式(五)：转基因烟草抗盐能力分析
(1)将T2代转基因株系种子种在200mM NaCl的GM培养基上，观察其生长状况。
(2)观察转基因烟草与非转基因烟草在土壤中的生长状况。生长6周后对其浇灌浓度为200mM的NaCl溶液，每次定量浇30ml，每周浇3次，维持3周。然后用清水浇灌，使其恢复一周。
通过转基因烟草抗盐能力分析看出，转基因植株相对于非转基因烟草具有明显的抗盐能力。该基因转化棉花、小麦、玉米等农作物，可提高其抗盐能力，提高其产量和品质，具有重大的经济价值和社会价值。
序列表
<110>山东农业大学
<120>棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK16的克隆及其应用
<160>2
<210>1
<211>2030
<212>cDNA
<213>棉花(Gossypinm hirsutum)
<221>1-2030
<400>1
AACTTGGTTT CTACTATTAC TTTGGGGGCT TCCTGTTTGA TGCCAATTGT TTTCTGTTTC  60
CAAAGTTTTG ATGCTAAGAT GCAGCCTGAT CAGAGAAGAA AGTCAGCTGC GGATGTAGAT 120
TTTTTCACTG AATATGGTGA GGGAAGCAGG TATAGAATAG AGGAAGTAAT TGGAAAAGGA 180
AGCTATGGTG TTGTTTGTTC AGCGTATGAC ACTCATACTG GAGAAAAGGT TGCTATTAAG 240
AAAATCAATG ATATATTTGA ACATGTATCT GACGCCACCC GAATCCTCAG AGAGATTAAA 300
CTTCTCAGGC TCCTACGTCA TCCAGACATT GTTGAGATCA AGCACATATT GTTCCCTCCT 360
TCAAGAAGGG AATTTAAAGA TATATACGTG GTATTTGAAC TTATGGAATC TGATTTACAC 420
CAGGTTATCA AAGCAAATGA TGATTTGACC CCAGAACACT ACCAGTTTCT TCTTTATCAG 480
CTTCTTCGGG GCCTGAAATA CATTCACACA GCTAATGTTT TTCATCGGGA TCTAAAGCCG 540
AAAAATATCT TAGCCAATGC TGATTGCAAA CTGAAGATCT GTGATTTTGG GCTTGCAAGA 600
GTAGCTTTTA ATGACACCCC CACTGCAATA TTCTGGACGG ACTATGTTGC AACAAGATGG 660
TACAGGGCTC CGGGATTGTG TGGATCCTTT TTCTCCAAGT ATACCCCAGC AATAGATATA 720
TGGAGCATTG GGTGCATCTT TGCTGAACTT CTAACAGGGA AACCTCTGTT TCCTGGAAAA 780
AATGTTGTCC ATCAATTGGA TCTGATGACT GATCTTTTGG GAACACCATC TGCTGAAGCC 840
ATTGCTAGGG TGCGTAATGA GAAAGCTCGG AGATACTTGA GCAGCATGCG AAAGAAAAAG 900
CCAATTCCTC TCTCCCACAA GTTCCCTAAT GCAGATCCTC TTGCTGTTCT TTTGTTAGAA 960
AGGATGCTTG CTTTTGAACC CAAGGATCGA CCTAGTGCTG AAGAGGCCCT AGCTGATCCA  1020
TATTTCAAGG GGTTGGCCAA AGTTGAAAGG GAGCCTTCCG CACAACCAGT TACCAAGATG  1080
GAATTTGAGT TTGAGAGACG TAGGATTACA AAGGAAGATG TTAGGGAGCT CATATACCGT  1140
GAAATTCTTG AGTATCATCC TAAAATGTTG AAAGAGTATC TGGAAGGATC AGAGCCAACT  1200
GGCTTCATGT ATCCAAGTGC GGTTGACCAT TTCAAGAAGC AGTTTGCCTT CCTTGAGGAG  1260
CACTATGGAA ATGGTACGAC TGCAGCTCCA CTTGAGAGAC AACATGCATC TTTGCCAAGG  1320
CCATGTGTGT TATATTCAGA TAATTCAGTA CAAAACTCAA CAGATGTGAC AGATAACTTA  1380
TCTAAATGTT CCATCAAGGA AACTGAGAAA CCCCAACCAG AGAGAAGCTT TCCAATCCCT  1440
ATGTCAAGGC TTCCCCCTCA AGTTCCTCAA AGCATCCAAG GTGCTGCCAG ACCTGGGAAA  1500
GTAGTTGGAT CAGTATTGCG ATACAACAAT TGTGGGGCAG TAGCCGCAGG TGAGGCTCTT  1560
GAACAGCGAA GAATGGCTCG GAATCCTTCA GTTCCAACTC AGTATACTGC CACAAATTGT  1620
TCATATCCAC GGAGAAATCC TGTCTGTAAA GATGATGAAG AAAATGAATT GCAGCCAAAA  1680
CCCCAGTACA TGGCTAGGAA AGTTGCTGCT GCCCAAGGTG GATCAAGAAG TCAGTGGTAT  1740
TGACCTAATA TCAACTACAA ATGGCCAACA AAAAAGGCCG GTGAGGATTT ACTCCCAAAT  1800
TGCTCTTCCT ACTGCTGGTT GAGGAAAGCT CAGACAAGTT ACAAGTGAAG CTATGCATTG  1860
TAATTTATAG CACTAATTTC AAAGAGATGA AACTGTGCCT TCTTATCCTT CATAAGATAT  1920
GTGAAAGTTA GAGACTTGAG GAAAAGGCAA AAGTGAACTC TGTAACTTAT GAAGTTGGTT  1980
CTCTACTTTA TTTATTCTTT ATTAACACCC TTAAAAAAAA AAAAAAAAAA             2030
<210>2
<211>554
<212>PRT
<213>棉花(Gossypinm hirsutum)
<221>1-554
<400>2
Met Gln Pro Asp Gln Arg Arg Lys Ser Ala Ala Asp Val Asp Phe Phe
1               5                   10                  15
Thr Glu Tyr Gly Glu Gly Ser Arg Tyr Arg Ile Glu Glu Val Ile Gly
            20                  25                  30
Lys Gly Ser Tyr Gly Val Val Cys Ser Ala Tyr Asp Thr His Thr Gly
        35                  40                  45
Glu Lys Val Ala Ile Lys Lys Ile Asn Asp Ile Phe Glu His Val Ser
    50                  55                  60
Asp Ala Thr Arg Ile Leu Arg Glu Ile Lys Leu Leu Arg Leu Leu Arg
65                  70                  75                  80
His Pro Asp Ile Val Glu Ile Lys His Ile Leu Phe Pro Pro Ser Arg
                85                  90                  95
Arg Glu Phe Lys Asp Ile Tyr Val Val Phe Glu Leu Met Glu Ser Asp
            100                 105                 110
Leu His Gln Val Ile Lys Ala Asn Asp Asp Leu Thr Pro Glu His Tyr
        115                 120                 125
Gln Phe Leu Leu Tyr Gln Leu Leu Arg Gly Leu Lys Tyr Ile His Thr
    130                 135                 140
Ala Asn Val Phe His Arg Asp Leu Lys Pro Lys Asn Ile Leu Ala Asn
145                 150                 155                 160
Ala Asp Cys Lys Leu Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Val Ala
                165                 170                 175
Phe Asn Asp Thr Pro Thr Ala Ile Phe Trp Thr Asp Tyr Val Ala Thr
            180                 185                 190
Arg Trp Tyr Arg Ala Pro Gly Leu Cys Gly Ser Phe Phe Ser Lys Tyr
        195                 200                 205
Thr Pro Ala Ile Asp Ile Trp Ser Ile Gly Cys Ile Phe Ala Glu Leu
    210                 215                 220
Leu Thr Gly Lys Pro Leu Phe Pro Gly Lys Asn Val Val His Gln Leu
225                 230                 235                 240
Asp Leu Met Thr Asp Leu Leu Gly Thr Pro Ser Ala Glu Ala Ile Ala
                245                 250                 255
Arg Val Arg Asn Glu Lys Ala Arg Arg Tyr Leu Ser Ser Met Arg Lys
            260                 265                 270
Lys Lys Pro Ile Pro Leu Ser His Lys Phe Pro Asn Ala Asp Pro Leu
        275                 280                 285
Ala Val Leu Leu Leu Glu Arg Met Leu Ala Phe Glu Pro Lys Asp Arg
    290                 295                 300
Pro Ser Ala Glu Glu Ala Leu Ala Asp Pro Tyr Phe Lys Gly Leu Ala
305                 310                 315                 320
Lys Val Glu Arg Glu Pro Ser Ala Gln Pro Val Thr Lys Met Glu Phe
                325                 330                 335
Glu Phe Glu Arg Arg Arg Ile Thr Lys Glu Asp Val Arg Glu Leu Ile
            340                 345                 350
Tyr Arg Glu Ile Leu Glu Tyr His Pro Lys Met Leu Lys Glu Tyr Leu
        355                 360                 365
Glu Gly Ser Glu Pro Thr Gly Phe Met Tyr Pro Ser Ala Val Asp His
    370                 375                 380
Phe Lys Lys Gln Phe Ala Phe Leu Glu Glu His Tyr Gly Asn Gly Thr
385                 390                 395                 400
Thr Ala Ala Pro Leu Glu Arg Gln His Ala Ser Leu Pro Arg Pro Cys
                405                 410                 415
Val Leu Tyr Ser Asp Asn Ser Val Gln Asn Ser Thr Asp Val Thr Asp
            420                 425                 430
Asn Leu Ser Lys Cys Ser Ile Lys Glu Thr Glu Lys Pro Gln Pro Glu
        435                 440                 445
Arg Ser Phe Pro Ile Pro Met Ser Arg Leu Pro Pro Gln Val Pro Gln
    450                 455                 460
Ser Ile Gln Gly Ala Ala Arg Pro Gly Lys Val Val Gly Ser Val Leu
465                 470                 475                 480
Arg Tyr Asn Asn Cys Gly Ala Val Ala Ala Gly Glu Ala Leu Glu Gln
                485                 490                 495
Arg Arg Met Ala Arg Asn Pro Ser Val Pro Thr Gln Tyr Thr Ala Thr
            500                 505                 510
Asn Cys Ser Tyr Pro Arg Arg Asn Pro Val Cys Lys Asp Asp Glu Glu
        515                 520                 525
Asn Glu Leu Gln Pro Lys Pro Gln Tyr Met Ala Arg Lys Val Ala Ala
    530                 535                 540
Ala Gln Gly Gly Ser Arg Ser Gln Trp Tyr
545                 550