梨火疫病菌和亚洲梨火疫病菌的PADLOCK探针及多重检测方法.pdf

本发明用于检测梨火疫病菌和亚州梨火疫病菌的padlock探针及其多重检测方法属于农作物防病治病及植物检疫范畴。用于检测梨火疫病菌的padlock探针序列：P-e.amy：GACTTCGCAGGCGCCTTGCTCATTACTTPIP2ATCGGCCTGTAATCGGATCGACACGGTGTGTCGC用于检测亚洲梨火疫病菌的padlock探针序列P-e.pyr：TATGGCGTCCCCAAGGGGATTCGAACCCPIP2CCGACTCTAGGATCGTGGATCACTTCGTTACCGG.以此探针为基础结合Macroaary技术能够同时检测梨火疫病菌和亚州梨火疫病菌，这种多重检测方法具较强的特异性、灵敏性及稳定性，为梨火疫病菌和亚州梨火疫病菌的检测提供了快速、灵敏、特异的技术方法。图为padlock探针结合Macroaary技术同时检测梨火疫病菌和亚州梨火疫病菌结果。

1.  用于检测梨火疫病菌的padlock探针序列：
P-e.amy：GACTTCGCAGGCGCCTTGCTCATTACTTP_IP₂ATCGGCCTGTAATCGGATCGACACGGTGTGTCGC。

2.  用于检测亚洲梨火疫病菌的padlock探针序列P-e.pyr：TATGGCGTCCCCAAGGGGATTCGAACCCP_IP₂CCGACTCTAGGATCGTGGATCACTTCGTTACCGG。

3.  权利要求Padlock探针结合Macroarray技术检测方法，包括如下步骤：(1)探针的连接与外切酶处理。首先将padlock探针和待检测的目标DNA进行杂交，在TaqDNA连接酶的作用下，探针的两端通过与特定的检测靶标物的DNA序列互补而相结合，探针的5’末端和3’末端连成环状。采用核酸外切酶去除没有形成环状的探针和错配的探针。(2)探针的扩增。采用两条探针P-e.amy、P-e.pyr经地高辛标记的通用引物对连接产物进行扩增。(3)Macroaary多重检测。将扩增后的产物与固定在膜上的与探针上的ZipCode序列互补的探针(cZipcode探针)进行杂交。通过膜上的地高辛标记信号来判断检测样品中哪些病原物。

梨火疫病菌和亚洲梨火疫病菌的padlock探针及多重检测方法
(一)技术领域
本发明涉及检测梨火疫病菌(Erwinia amylovora)和亚洲梨火疫病菌(Erwiniapyrifoliae)的padlock探针以及同时检测这两种植物病原菌的多重检测方法，属于生物技术领域。适用于口岸检验检疫、农业生产、植物保护等部门使用。
(二)背景技术
梨火疫菌(Erwinia amylovora(Burrill)Winslow et al.)是蔷薇科(Rosaceae)，苹果亚科(Maloideae)植物火疫病的致病因子。梨火疫病原产自北美，1920在新西兰发现该病。1957年英格兰报道了梨火疫病疫情的发生，自此除葡萄牙外欧洲大多数栽种感病寄主植物的国家都有了梨火疫病发生的相关报道。到目前为止梨火疫病已广泛分布于43个国家(Ven der Zwet 2002)，但南美、大部分非洲、亚洲国家(除地中海国家)未见有梨火疫病发生的报道，中国也是非疫区。由于梨火疫病对许多国家的水果产业构成了巨大威胁，所以世界多数国家将其列为检疫性有害生物。
自1995年起，在韩国的Chuncheon地区果园的亚洲梨(Pyrus pyrifoliae)上发现一种与梨火疫病(Erwinia amylovora)十分相似的病害。该菌主要侵染亚洲梨和部分西洋梨(Pyrus communis)品种，对苹果无致病力。最终在德国所做的分子生物学鉴定进一步将此病鉴定为一个新种：亚洲梨火疫病菌(Erwiniapyrifoliae)。我国没有发生此病害，是我国规定的检疫性有害生物。该病主要侵染梨树花序和嫩枝，引起花腐和枝枯，症状与Erwinia amylovora引起的症状十分相似。
梨和苹果是我国的主要果品，各省均有栽培，也是我国出口创汇的重要农产品之一。如果梨火疫病或亚洲梨火疫病一旦在我国发生，所遭受的不仅仅是病害直接引起的损失，最重要的是其他国家的贸易限制而引起的市场损失，对我国果品出口造成负面影响。因此在我国检疫是主要的控制此病害的手段，严格限制或禁止从发生此类病害的国家和地区进口梨和苗木等，从其它国家进口的种子必须进行有关的检验。目前梨火疫病和亚洲梨火疫病具体的检测手段主要是传统的检测技术和分子检测技术。传统的检测技术包括利用半选择性培养基分离和鉴定病菌、免疫学检测方法、致病性测定及过敏反应测定、生理生化反应测试等。这些方法往往需耗费较长时间并且灵敏度和准确性不高，因此常规的检测方法难以适应检疫的需求。
近年来，采用PCR扩增病原菌的致病性基因、未知的DNA片段、质粒DNA和rDNA转录间隔区(ITS)等进行病原菌鉴定、检测及病害诊断为国际上广泛使用。Bereswill等人(1992)利用梨火疫病菌的pEA29质粒上0.9kb的pstI片段对梨火疫病菌进行特异性鉴定，特异性扩增梨火疫病菌菌体，检测灵敏度可达50个菌体细胞，并在6小时内可得结果。Bereswill等人(1995)利用梨火疫病菌的ams基因设计了一对引物，对梨火疫病菌进行特异性检测，专化性极好，由于ams基因的拷贝数很低，因此灵敏度只有扩增pEA29质粒PCR技术的1/10(500细胞)。Merighi等(2000)利用PCR-ELISA技术对梨火疫病进行了检测，检测人工接种的梨枝条，灵敏度达4×10²cfu/g。Llop等(2000)在1个封闭的管内同时使用2套引物进行巢式PCR引物，对梨火疫病菌进行特异性检测。由于退火温度上的差异，基于两套引物的PCR反应在时间顺序上前后连贯。外部引物的序列由McManus和Jones(1995)设计，内部引物由Llop等(2000)设计。但是这些报道都是针对Erwinia amylovora设计的引物，无法将亚洲梨火疫区分开来。目前尚未有能够同时检测梨火疫病菌和亚洲梨火疫病菌技术的报道。
Padlock探针(PLPs)的发明为植物病原菌的高通量分子检测提供了一条新的思路。Padlock探针是一条长度为100bp左右的单核苷酸探针(图4-1)，包括磷酸化的5’端和羟基化的3’端，这两端能够识别特定目标物的DNA序列(Nilsson et al，1994)，我们通常称之为T1端和T2端。在T1端和T2之间，存在着一段通用序列和一段特异序列，我们称之为P1、P2端和ZipCode。在进行反应时，首先将padlock探针和要检测的目标DNA进行连接，在TaqDNA连接酶的作用下，探针的T1端和T2端通过和特定的检测靶标物的DNA序列互补而相结合，探针的5’端和3’端连成环状。由于TaqDNA连接酶的特性，只有DNA序列和探针的T1端和T2端完全互补时，探针才能形成环状，否则，探针以线性存在。采用核酸外切酶去除没有形成环状的探针和错配的探针，然后采用所有探针的通用端T1端和T2端的引物对切除后的产物进行滚环扩增。然后将扩增后的产物与固定在膜上或者Microarray上的与ZipCode序列互补的核酸序列进行杂交(Shoemaker etal，1996)。通过膜上的地高辛标记信号或者Microarray上的荧光来判断检测样品中是否有特定的病原物。由于padlock探针可与Macroarray或者Microarray技术相结合，因此能够在检测的过程中实现高通量(Hardenbol et al，2003)。Padlock探针独特的设计多与基因芯片相结合应用于病毒性疾病分子的检测(Baner J et al，2007)和单核苷酸突变检测当中(Baner J et al，2003)。目前尚未有将padlock探针应用于植物病原菌实际检测的实例。
参考文献
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Baner J.，Isaksson A.，WaldenstroEml E.，et al.，2003.Parallel gene analysis with allele-specificpadlock probea and tag microarrays.Nucleic Acids Research 31(17)：e103.
Bereswill，S.，Pahl，A.，Bellemann，P.，Zeller，W.&Geider，K.1992.Sensitive andspecies-specific detection of Erwinia amylovora by polymerase chain reaction analysis.ApplEnviron Microbiol 58，3522-3526.
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Hardenbol，P.，Baner，J.，Jain，M.，Nilsson，M.，Namsaraev，E.A.，Karlin-Neumann，G.A.，Fakhrai-Rad，H.，Ronaghi，M.，Willis，T.D.，Landegren，U.，and Davis，R.W.2003.Multiplexedgenotyping with sequence-tagged molecular inversion probes.Nat Biotechnol 21：673-678.
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(三)发明内容
技术问题
本发明的目的是解决现有技术中对梨火疫病菌和亚洲梨火疫病菌的分子检测方法难以实现多重检测等问题，提供分别用于检测梨火疫病菌和亚洲梨火疫病菌的Padlock探针以及同时检测这两种病原菌的分子检测方法，对梨火疫病菌和亚洲梨火疫病菌进行检测，灵敏度高、特异性好。
技术方案
本发明的目的意在克服上述现有技术的不足，提供快速、可靠、灵敏度高、特异性强的检测梨火疫病菌和亚洲梨火疫病菌的padlock探针以及能够同时检测这两种病原菌的分子检测方法。
实现上述目的的技术方案：
1)用于检测梨火疫病菌的padlock探针序列：
P-e.amy：GACTTCGCAGGCGCCTTGCTCATTACTTP_IP₂ATCGGCCTGTA ATCGGATCGACACGGTGTGTCGC
2)用于检测亚洲梨火疫病菌的padlock探针序列：
P-e.pyr：TATGGCGTCCCCAAGGGGATTCGAACCCP_IP₂CCGACTCTAGGATCGTGGATCACTTCGTTACCGG
探针的靶标识别序列(即5’末端和3’末端)取自待测病原菌16S-23S rDNA(ITS)区域特异的核酸序列。探针中间P_IP₂(CTCGACCGTTAGCAGCATGACCGAGATGTACCGCTATCGT)为通用引物结合区，加下划线的碱基序列(即Zipcode序列)用于识别固定在尼龙膜上的cZipcode探针。
3)Padlock探针是一种长寡核苷酸探针，其两端的序列可通过核酸间的互补与靶标DNA结合。通过和靶标DNA的杂交，padlock探针的两端在连接酶的作用下连成环状，具有非常高的特异性。Padlock探针可与Macroarray技术结合进行多重检测。Padlock探针结合Macroarray技术检测方法，包括如下步骤：(1)探针的连接与外切酶处理。首先将padlock探针和待检测的目标DNA进行杂交，在TaqDNA连接酶的作用下，探针的两端通过与特定的检测靶标物的DNA序列互补而相结合，探针的5’末端和3’末端连成环状。采用核酸外切酶去除没有形成环状的探针和错配的探针。(2)探针的扩增。采用两条探针P-e.amy、P-e.pyr经地高辛标记的通用引物对连接产物进行扩增。(3)Macroaary多重检测。将扩增后的产物与固定在膜上的与探针上的ZipCode序列互补的探针(cZipcode探针)进行杂交。通过膜上的地高辛标记信号来判断检测样品中哪些病原物。
有益效果采用上述技术方案，突出的技术进步在于：
(1)本发明设计了分别适用于梨火疫病菌和亚洲梨火疫病菌检测的padlock探针。(2)本发明利用padlock探针结合Macroaary技术，实现了对梨火疫病菌和亚洲梨火疫病菌的多重检测，检测方法可靠、快速、灵敏度高、特异性强。(3)采用padlock探针作为分子检测工具，有效地避免传统PCR检测方法的假阳性现象。传统的基于PCR扩增的分子检测通常只能检测单种病原物，荧光定量PCR的出现在一定程度上解决了这一问题，通过在反应的体系中添加不同荧光染料，可以同时检测1种以上的病原物。但是由于荧光染料种类的限制和彼此之间的干扰，采用这种方法对多种病原物进行检测时候效果往往不好。采用padlock探针作为分子检测工具，结合Macroaary技术弥补了实时定量PCR检测因受到引物设计问题、荧光染料的种类和荧光定量PCR仪光源是单一光源等问题而不能同时检测非常多的病原物的不足。
(四)说明书附图
图1.Padlock探针结构示意图及检测原理。
图2.梨火疫病菌和亚州梨火疫病菌的多重检测结果。
A.Erwinia amylovora；B.Erwinia pyrifoliae；C.Erwinia amylovora and Erwiniapyrifoliae；D.Layout of multi-chamber universal tag array on nylon membrane.cZipcontrol＝TATGGTCGGCAATTCCCTGC.
结果表明，利用padlock探针结合Macroaary技术可以成功地对梨火疫病菌和亚州梨火疫病菌进行多重检测。
图3.利用padlock探针对人工接种发病的梨叶片及其检测结果。
(A)样品1：人工接种Erwinia amylovora发病的梨叶片；样品2：人工接种Erwiniapyrifoliae发病的梨叶片；样品3：接种灭菌水的梨叶片。(B)检测结果。A：样品1；B：样品2；C：菌株NCPPB1665；D：菌株EP28/96；E：样品3.
(五)具体实施方式
实施例1：一种利用padlock探针结合Macroaary技术的多重检测方法，用于同时检测梨火疫病菌和亚洲梨火疫病菌。
用于检测梨火疫病菌的padlock探针序列：
P-e.amy：GACTTCGCAGGCGCCTTGCTCATTACTTP_IP₂ATCGGCCTGTAATCGGATCGACACGGTGTGTCGC
用于检测亚洲梨火疫病菌的padlock探针序列：
P-e.pyr：TATGGCGTCCCCAAGGGGATTCGAACCCP_IP₂CCGACTCTAGGATCGTGGATCACTTCGTTACCGG
(1)将发病梨树叶片表面消毒后切成小段，然后用灭菌水浸泡30min，离心取上清，以此菌悬液为模板。连接反应液包括：20mM Tris-HCL，pH 9.0，25mMKCH₃COO，10mM Mg(CH₃COO)₂，10mM DTT，1mM NAD，0.1％Triton X-100，2.4U Taq DNA连接酶，1μl菌悬液，100pm探针P-e.amy、P-e.pyr。连接的反应程序为：95℃预变性5分钟；然后进入循环，95℃变性30秒，65℃连接5分钟，反应共进行20个循环；然后95℃灭活15分钟。采用核酸外切酶切除自连和错连的探针：在连接后的产物中加入2个单位的核酸外切酶I和2个单位的核酸外切酶III，37℃反应2个小时，然后将反应后的产物95℃灭活3小时。
(2)采用经地高辛标记的通用引物P1-F(5’-CTCGACCGTTAGCAGCATGA-3’)P2-R(5’-CCGAGATGTACCGCTATCGT-3’)对连接产物进行PCR扩增，反应液包括：0.5μMP1-F和P2-R，4种dNTP各50μM，2.5μl 10×PCR反应缓冲液，2mM Mg²⁺，2.5μl 1％BSA，1.25单位Taq酶(TaKaRa)，3μl经核酸外切酶处理后的连接产物。反应程序为：94℃预变性5min；然后进入循环，94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，共35个循环；最后72℃延伸7min。
(3)Macroaary多重检测。将1μL cZipcode探针点于尼龙膜上，每条cZipcode探针重复4次，经紫外交联30s固定。将固定好的膜放入杂交管中，加入预杂交液(0.02％SDS、5×SSC、50％去离子甲酰胺、0.1％N-laurysarosine、50mmol·L^-1磷酸钠、pH 7.02％封闭剂)于杂交炉中42℃预杂交1h，弃预杂交液，将扩增产物沸水浴中变性10min，迅速移至冰上，5分钟后加入预杂交液中，42℃杂交过夜后，用大量2×SSC、0.1％SDS室温洗膜2次，每次5min，再用0.5×SSC、0.1％SDS于68℃洗膜2次，每次15min。洗膜后把膜加入洗涤液(0.1mol·L^-1马来酸、0.15mol·L^-1NaCl，pH 7.5、0.3％吐温)中洗膜2min，弃去，用封闭液(1％封闭剂、0.1mol·L^-1马来酸、0.15mol·L^-1 NaCl，pH 7.5)封闭30min后，加入用封闭液稀释了5000倍的Anti-DIG-AP，轻摇30min。最后，将结合完抗体的膜用洗涤液洗膜2次，每次15min，加入检测液(0.1mol·L^-1Tris-HCl、0.1mol·L^-1NaCl、pH 9.5)平衡3min，再加入NBT/BCIP溶液，黑暗中静止显色2h，待观察到理想的显色后，用无菌水浸泡10min终止反应，进行拍照。通过膜上的地高辛标记信号来判断检测样品中哪些病原物。
实例1从人工接种发病的梨叶片检测梨火疫病菌和亚洲梨火疫病菌：
上述梨火疫病菌和亚洲梨火疫病菌的padlock检测探针及其多重检测方法用于检测人工接种发病的梨叶片，方法包括：
1)将发病梨叶片表面消毒后切碎，然后用灭菌水浸泡30min，离心取上清，以此菌悬液为模板。
2)参照上述技术方案利用padlock检测探针P-e.amy、P-e.pyr结合Macroaary检测样品。检测结果见图3。证明了上述技术方案能够应用于梨火疫病菌和亚洲梨火疫病菌的实际检测。