技术领域
本发明涉及一种新型植物乳杆菌及含该植物乳杆菌的组合物。更 具体地，涉及一种用于预防治疗肠道疾病及免疫疾病的新型植物乳杆 菌及含有该植物乳杆菌的组合物。
背景技术
泡菜等传统发酵食品中含有丰富的乳酸菌，所述乳酸菌在人体的 消化系统中共生，具有通过分解纤维质及复合蛋白质来制备重要的营 养成分的作用。将这种存活于包括人在内的动物的胃肠器官内，改善 宿主的肠道微生物环境，从而对宿主的健康有利的微生物统称为益生 菌。为了使益生菌具有效果，需要经口摄取到达小肠，附着于肠表面 并维持这种附着状态，因此至少需要具有优异的耐酸性、耐胆汁酸性， 以及附着于肠上皮细胞上的附着力。
在泡菜等传统发酵食品中所发现的具有代表性的益生菌有乳杆 菌属(Lactobacillus sp.)乳酸菌。乳杆菌属微生物作为同型或异型发 酵的乳酸杆菌，常见于包括人在内的动物的肠道及乳制品或蔬菜的发 酵过程中。乳杆菌属微生物将肠内pH值维持在酸性，从而抑制大肠 杆菌(E.coli)或梭菌(Clostridium)等有害菌的繁殖，不仅能够改善 腹泻和便秘，而且已知的作用还有合成维生素、抗癌、降低血清胆固 醇等。已知由乳酸杆菌产生的乳酸杆菌素(acidophillin)具有抑制痢 疾杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、大肠杆菌等生长的作用。并且能够抑 制引起腹泻的菌繁殖，使得肠道菌群正常，从而具有停止腹泻的作用。 (Michael和Philippe，益生菌与益生元：对腹泻的影响，营养学杂志， 第137卷，2007年3月，第803S-811S页；Roberfroid，益生元与益 生菌：它们是功能性食品吗？美国临床营养学杂志，第71卷，2000 年6月，第1682S-1687S页)(Michael and Philippe，Probiotics and prebiotics：Effects on diarrhea，The journal of nutrition，Volume 13 7，March 2007，pages 803S-811S；Roberfroid，Prebiotics and probi otics：Are they functional foods？，American journal of clinical nut rition，Volume 71，June 2000，pages 1682S-1687S)。
利用乳杆菌属微生物的上述特性来开发益生菌剂和家畜饲料的 研究正在活跃地展开。家畜的细菌性腹泻病会降低增重率，导致动物 死亡。因此，为了预防上述情况的发生，提高家畜产量，一般一直采 用的方法是在饲料中添加抗生素。但是，由于对抗生素的耐药菌的出 现和畜产内残留抗生素等问题，因此目前趋势是在饲料中限制使用抗 生素，强调有机的家畜饲养方法(韩国公开专利1998-78358)(McE wen和Fedorka-Cray，动物体内抗菌药物的应用以及耐药性，临床传 染病杂志，第34卷，2002年6月，第S93-S106页)(McEwen and Fedorka-Cray，Antimicrobial use and resistance in animals，Clinical infectious Diseases，Volume34，June 2002，pages S93-S106)。
并且，乳杆菌属微生物等乳酸菌还具有增强免疫力的效果。最近， 在世界范围内由于环境污染和速食食品摄入的增加等，其影响使得与 免疫调节异常有关的过敏性反应疾病和特异性反应疾病正在急剧增 加，在韩国这种疾病也同样呈增加趋势。最近在欧洲，作为微生物治 疗(bacteriotheraphy)的一个环节，通过口服乳酸菌来治疗疾病，正 在努力实现用乳酸菌来缓解或改善症状。将鼠李糖乳杆菌GG(Lact obacillus rhamnosus GG)对幼儿给药时发生特异性反应疾病的概率 减少到一半(等，益生菌在遗传性过敏性反应疾病中的主 要预防：一种随机安慰剂对照实验，柳叶刀杂志，第357卷，2001 年4月，第1076-1079页)(et.al.，Probiotics in primary prevention of atopic disease：a randomized placebo-controlled trial， Lancet，Volume 357，April 2001，pages 1076-1079)。有报道指出对 已经发生特异性反应湿疹的幼儿用鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rha mnosus)和罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)进行给药时，湿疹部位会变小 且湿疹症状会减轻(Rosenfeldt等，益生菌乳酸菌菌株对儿童的遗传 过敏性皮炎、皮肤病以及眼部疾病的影响，第111卷，2003年2月， 第389-395页)(Rosenfeldt et.al.，Effect of probiotic Lactobacillus strains in children with atopic dermatitis，Dermatologic and ocular d iseases，Volume 111，February 2003，pages 389-395)。
对这种乳酸菌的增强免疫效果的机理(mechanism)方面的研究 还在进行，虽然对具体的机理还不明确，但是大体上已知通过经口摄 入，并且在肠内栖息，从而影响肠道的免疫系统。例如，已知通过酸 奶的方式来摄取乳酸菌能够增强集合淋巴小结(Peyer’s patch)淋巴 细胞的抗菌活性，根据以实验动物和人为对象实施的部分研究，已知 乳酸菌能够强化IgA反应。此外，乳酸菌对先天免疫及适应性免疫都 有影响。已知在肠道免疫系统的先天免疫反应(innate immunity)中 通过吞噬病原菌来消灭病原菌，从而抗感染，起到维持健康的作用。 已知适应性免疫(adaptive immunity)是通过活化巨噬细胞来增加多 种细胞因子的产生，特别是增加白介素IL-12、IL-18的产生，这是由 于乳酸菌细胞壁的构成成分中的部分成分激活巨噬细胞中的NF-κB、 STAT信号通路，因此增加细胞因子的生成。所述巨噬细胞起到分解 抗原，从而提示给T淋巴细胞的作用。并且，已知的还有乳酸菌作为 专门的抗原呈递细胞，其不仅在淋巴结、消化系统中的粘膜上较多存 在的树突细胞(dendritic cell)中增加IL-12、IL-18、TNF-α的产生， 而且其还具有增加表面分子表达的作用，所述表面分子与MHC II， 以及B7-2一样具有活化T淋巴细胞的作用(Cross等，发酵食品的抗 过敏特性，乳酸菌的一个重要免疫调节机制？，国际免疫药理学杂志， 第1卷，2001年5月，第891-901页)(Cross et.al.，Anti-allergy pr operties of fermented foods：an important immunoregulatory mechan ism of lactic acid bacteria？，International Immunopharmacology，V olume 1，May 2001，pages 891-901)。
T淋巴细胞是适应性免疫(adaptive immunity)的核心细胞，适 应性免疫可分为细胞性免疫的Th1反应和抗体性免疫的Th2反应。 在Th1及Th2各自反应中抗原呈递细胞(Antigen Presenting Cell) 所产生的细胞因子相互不同，在Th1反应中IL-12、IL-18以及干扰 素(IFN)的产生占优势，而在Th2反应中PGE2、IL-4、IL-10的产 生占优势。这种Th1反应以及Th2反应要形成适当的均衡，当均衡 被破坏的情况下，会发生各种免疫疾病。Th1细胞主要与感染病症作 斗争，而与此相反，Th2细胞主要与过敏性反应疾病和炎性反应相关。 当它们正常发挥作用时，Th2细胞防止灰尘及其它不需要的物质侵入 身体，从而保护身体，但是如果这些细胞显示出过度的活性的情况下， 会增加IgE抗体的产生，从而使原本对人体没有威胁的蛋白质(例如： 花粉、食物等)诱发过敏反应。并且，Th1反应和Th2反应必须要维 持平衡，如果其中的一种过剩或另一种不足，就会诱发疾病。并且， 由于持续的压力，进而不断分离皮质醇，就会使得Th1反应减少，T h2反应增加，从而诱发癌症、特异性反应疾病、过敏性反应疾病、 以及自身免疫疾病(Elenkov和Chrousos，应激激素，Th1/Th2型模 型，促炎/抗炎细胞因子以及对疾病的敏感性，内分泌学与新陈代谢 趋势，第10卷，1999年11月，第359-368页)(Elenkov and Chrou sos，Stress hormones，Th1/Th2 patterns，pro/anti-inflammatory cytok ines and susceptibility to disease，Trends in Endocrinology and Met abolism，Volume 10，November 1999，pages 359-368)。
通过体内(In vivo)实验可知，乳酸菌能够增加T淋巴细胞中 作为Th1细胞因子的IFN-γ的生成，并且能够抑制作为Th2细胞因子 的IL-4、IL-5的生成(Matsuzaki等，口服干酪乳杆菌Shirota对生成 小鼠的免疫球蛋白E的作用，乳品科学杂志，第81卷，1998年1月， 第48-53页)(Matsuzaki et.al.，The effect of oral feeding of Lacto bacillus casei strain Shirota on immunoglobulin E production in mic e，Journal of Dairy Science，Volume 81，January 1998，pages 48- 53)。并且，在其它实验中，用乳酸菌对偏向于Th2反应的小鼠(ov albumin-primed mice)进行经口给药时，脾细胞(splenocyte)中的I NF-γ增加，IL-4、IL-5以及IgE减少，所述偏向于Th2反应的小鼠为 用作Th2反应动物模型的给药卵清蛋白的小鼠。并且已知用卵清蛋白 给药后，将由偏向于Th2反应的小鼠中提取的脾细胞和乳酸菌一起进 行培养时，细胞因子以及IgE的变化与经口给药的实验相同。但是， 仅将T淋巴细胞与乳酸菌进行培养时，IFN-γ的生成没有明显增加， 因此可以认为在T淋巴细胞的IFN-γ生成中巨噬细胞、树突细胞等抗 原呈递细胞是必需的(Kato等，乳酸菌通过小鼠脾细胞有效诱导白 介素12和γ-干扰素的产生，国际免疫药理学杂志，第21卷，1999 年2月，第121-131页)(Kato et.al.，Lactic acid bacterium potentl y induces the production of interleukin-12and interferon-gamma by mouse splenocytes，International Journal of Immunopharmacology， Volume 21，February 1999，pages 121-131)。另一方面，IL-12以及 IL-18是将Th0淋巴细胞分化为Th1淋巴细胞的重要细胞因子，其在 巨噬细胞或树突细胞中生成，已知在培养脾细胞或巨噬细胞时，采用 乳酸菌进行处理，随着浓度的增加，IL-12、IL-18以及IFN-α等的生 成会增加。由此可知乳酸菌在巨噬细胞中会增加IL-12、IL-18以及I FN-α等的生成，因此会促进向Th1细胞分化，并且诱导IFN-γ的生 成，因此在Th2占优势的情况下能够起到调节Th1/Th2平衡的作用(C ross等，发酵食品的抗过敏特性：乳酸菌的一个重要免疫机制，国际 免疫药理学，第1卷，2001年5月，第891-901页)(Cross et.al.， Anti-allergy properties of fermented foods：an important immunoreg ulatory mechanism of lactic acid bacteria？，International Immunoph armacology，Volume 1，May 2001，pages 891-901)。并且，已知乳 酸菌对预防和治疗由Th2反应过剩导致的Th1/Th2失衡而诱发的癌 症、特异性反应疾病、过敏性反应疾病以及自身免疫疾病有帮助。
发明内容
本发明要解决的技术问题
本发明的发明人研究开发出一种在调节由Th2反应过剩引起Th 1/Th2失衡方面效果大大优于现有乳酸菌的新型乳酸菌。研究结果为 从传统的发酵食品中分离并鉴定了一种新型乳杆菌属乳酸菌菌株，从 而完成了本发明。
本发明的目的在于，提供一种新型乳杆菌属乳酸菌菌株，其不仅 具有优异的作为益生菌基本性质的耐酸性、耐胆汁酸性、以及肠上皮 细胞上的附着力，而且增强免疫效果也优异，特别是调节由Th2反应 过剩引起的Th1/Th2失衡的效果优异。
本发明的另一目的在于，提供一种含有上述新型乳杆菌属乳酸菌 菌株的用于预防或治疗肠道疾病的组合物。
本发明的又另一目的在于，提供一种含有上述新型乳杆菌属乳酸 菌菌株的用于增强免疫力的组合物。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供植物乳杆菌CJLP55(Lactobacil lus plantarum CJLP55)(保藏单位：生命工学研究院基因银行，保藏 日期：2008.10.16，保藏编号：KCTC11401BP)。
并且，本发明提供一种含有上述植物乳杆菌CJLP55的用于预防 和治疗肠道疾病的组合物。
并且，本发明提供一种含有植物乳杆菌CJLP55的用于增强免疫 力的组合物。
下面，进一步详细说明本发明。
关于本发明的植物乳杆菌CJLP55(Lactobacillus plantarum CJL P55)的特征在于，是一种从传统发酵食品中分离并鉴定的植物乳杆 菌的新型菌株。所述传统发酵食品有泡菜、蔬菜发酵物、大酱、酱油、 清麴酱或盐渍海鲜等，但并不限于此。
为了对微生物进行鉴定和分类，对本发明的植物乳杆菌CJLP55 进行了有关16S rRNA碱基序列分析，结果为：与植物乳杆菌标准菌 株(Lactobacillus plantarum NBRC15891T，GenBank登录号AB326 351)显示出了最高的同源性(99.9％)，显示出了与植物乳杆菌最高 的分子系统学上的亲缘关系。并且，将上述微生物鉴定为植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)，并命名为植物乳杆菌CJLP55，于2008 年10月16日保藏于生命工学研究院基因银行(保藏编号为KCTC11 401BP)。植物乳杆菌CJLP55的16S rRNA基因的碱基序列如本说明 书附件中的碱基序列表SEQ ID NO.1所示。
本发明的植物乳杆菌CJLP55为革兰氏阳性杆菌，是在有氧条件 和厌氧条件下均能够生长的兼性厌氧菌(facultive anaerobe)，并且不 形成孢子，无运动性，细胞形态为杆菌。采用本技术领域常规方法对 植物乳杆菌CJLP55的更加具体的形态以及生理学特性进行分析的结 果如下表1所示。
表1
形态及生理、生物化学特性 结果 形态(Morphology) 杆菌(Rod) 运动性(Motility) - 孢子(Spore) - 过氧化氢酶 - 同型与异型发酵 兼性异型发酵 15℃下的繁殖 + 45℃下的繁殖 - 在3％NaCl中的繁殖 + 厌氧性繁殖 + 利用葡萄糖生成CO2 - 糖发酵特性 丙三醇 - 赤藓糖醇 -
D-阿拉伯糖 - L-阿拉伯糖 - 核糖 + D-木糖 - L-木糖 - 戊五醇 - 木糖苷 - 半乳糖 + D-葡萄糖 + D-果糖 + D-甘露糖 - L-山梨糖 - 鼠李糖 + 半乳糖醇 - 肌醇 - 甘露醇 + 山梨醇 + D-甘露糖苷 + D-葡萄糖苷 - 葡萄糖胺 + 苦杏仁苷 + 熊果苷 + 七叶苷 + 水杨苷 + 纤维二糖 + 麦芽糖 + 乳糖 + 蜜二糖 + 蔗糖 + 海藻糖 + 菊糖 + 松三糖(melizitose) + D-蜜三糖 + 美沙酮(amidon) - 糖原 - 木糖醇 - 龙胆二糖 + D-松二糖 - D-来苏糖 - D-塔格糖 - D-岩藻糖 - L-岩藻糖 -
D-阿拉伯糖醇 - L-阿拉伯糖醇 - 葡萄糖酸盐 - 2-葡萄糖酸盐 - 5-葡萄糖酸盐 -
+：阳性反应
-：阴性反应
为了长时间稳定地保存本发明的植物乳杆菌CJLP55，优选在混 合有一定量的丙三醇的水溶液的保存溶液中，使菌体散开，于-70℃ 条件下保存，或者将其悬浮在灭菌的10％脱脂乳中进行冷冻干燥。
此外，本发明的植物乳杆菌CJLP55作为益生菌，具有乳酸菌普 遍具有的整肠效果及增强免疫效果。
本发明中的益生菌(probiotics)理解为：存活于包括人在内的动 物的胃肠器官内，改善宿主的肠内微生物环境，从而对宿主的健康有 利的微生物。益生菌是一种具有益生菌活性的活的微生物，其具有单 一或复合菌株形态，当以干燥的细胞形态或发酵产物形态用于人或动 物的情况下，能够对宿主的肠道菌群产生有利的影响。为了确认是否 为这种益生菌的微生物，首先，需要确认其是否能够受胃液和胆汁的 影响较小且经过胃并存活于肠中，确认其是否能够停留在肠中并且存 活于肠道中，需要其能够对宿主的肠道菌群形成有利影响。因此，其 必须具有对胃酸的耐酸性，对胆汁酸的耐胆汁酸性，以及对肠上皮细 胞的附着性。第二点，为了确认是否为益生菌的微生物，需要所述微 生物在安全性方面没有问题，与此相关，一般进行明胶液化反应检测、 苯丙氨酸脱氨生成检测、氨生成检测、溶血性实验检测等。本发明的 植物乳杆菌CJLP55不仅具有优异的耐酸性、对胆汁酸的耐胆汁酸性、 以及对肠上皮细胞的附着性，而且在明胶液化反应检测、苯丙氨酸脱 氨生成检测、以及氨生成检测中显示出了阴性，在溶血性实验检测中 确认为与病原性无关的α-溶血，从而显示是安全的。
本发明的植物乳杆菌CJLP55的耐酸性、耐胆汁酸性、以及肠上 皮细胞的附着性非常优异，因此能够预测出具有整肠效果。由此，从 另一个侧面来说，本发明提供一种含有植物乳杆菌CJLP55的用于预 防或治疗肠道疾病的组合物。
上述含有本发明微生物的用于治疗肠道疾病的组合物能够用于 预防或治疗包括人在内的哺乳动物的肠道疾病，优选为包括牛、马、 猪等家畜。上述“肠道疾病”包括肠道危害细菌感染、以及炎症性肠 道疾病等，例如，包括由病原性微生物(大肠杆菌、沙门氏菌、梭菌 等)引起的感染性腹泻、肠胃炎、炎症性肠道疾病、神经性肠炎综合 症、小肠细菌过度生长、急性腹泻等，但是并不限于这些。上述用于 治疗肠道疾病的组合物中含有的植物乳杆菌CJLP55能够以活菌体或 死菌体方式存在，但是优选为以活菌体方式存在。一般活菌体具有治 疗并改善由肠道菌群的异常发酵而引起的诸多症状的效果，用于人以 及动物时，能够密集、停留在肠内的消化道壁上，从而起到使有害菌 不能够停留的作用，并且产生乳酸来降低肠内的pH值，抑制有害细 菌的繁殖。并且，所用的活菌体生成细菌素(bacteriocin)和过氧化 物，从而抑制病原菌的繁殖，对负责吸收营养成分的肠绒毛的活动起 到帮助作用。此外，生成帮助吸收、利用营养素的物质，对于动物来 说改善其饲料转化率，还产生一种中和病原菌产生的毒性物质的物 质。
对于上述本发明的用于预防或治疗肠道疾病的组合物的给药方 式没有特别限定，但是优选为经口给药。虽然给药量根据肠道疾病的 种类、疾病程度、年龄、性别、人种、治疗或预防目的等有所不同， 但是一般情况下以成人为基准，一天可以给药1千万-1000亿个。
除了具有整肠效果之外，本发明的植物乳杆菌CJLP55与现有的 乳酸菌相比，还具有显著优异的增强免疫力的效果。植物乳杆菌CJ LP55在脾细胞(splenocyte)中能够增加诱导Th1反应的IL-12的生 成，抑制诱导Th2反应的IL-4的生成。并且，所述植物乳杆菌CJLP 55通过刺激作为抗原呈递细胞调节T细胞免疫反应的巨噬细胞、以 及树突细胞等与调节免疫相关的细胞，从而促进诱导Th0淋巴细胞向 Th1淋巴细胞分化的细胞因子的生成，进而确认为其具有免疫调节能 力，能够调节由Th2反应过剩引起的Th1/Th2失衡。对植物乳杆菌C JLP55的增强免疫效果的具体说明如下。
与阴性对照组相比，用植物乳杆菌CJLP55对加入卵清蛋白(OV A)而偏向于Th2反应的小鼠脾细胞(splenocyte)进行处理时，产生 了高达12.4-12.7倍的诱导Th1反应的细胞因子IL-12，并且将诱导T h2反应的细胞因子IL-4的生成抑制到6.1～9.8％，能够确认这显著优 异于其它典型乳酸菌，如鼠李糖乳杆菌GG(KCTC5033)、干酪乳杆 菌(KCTC3109)、沙克乳杆菌CJLS118(KCTC13416)。植物乳杆菌 CJLP55能够抑制Th2反应，并且促进Th1反应，因此具有能够调节 由Th2反应过剩引起的Th1/Th2失衡的免疫调节能力。
用植物乳杆菌CJLP55(Lactobacillus plantarum CJLP55)对巨 噬细胞株RAW264.7、以及树突细胞JAWSII进行处理的结果，确认 了随着乳酸菌数量的增加，刺激巨噬细胞株，从而增强免疫反应。用 植物乳杆菌CJLP55对巨噬细胞株RAW264.7、以及树突细胞株JAW SII进行处理的结果，能够促进诱导Th1分化的细胞因子IL-12、IL- 18的生成，并且抑制诱导Th1分化的细胞因子IL-10比IL-12的生成 量相对少，因此确认植物乳杆菌CJLP55促进诱导Th1的分化。并且， 由该实验结果可知植物乳杆菌CJLP55抑制Th2反应，促进Th1反应， 从而具有调节由Th2反应过剩引起的Th1/Th2失衡的免疫调节能力。
IL-4来源于Th2细胞，特别起到细胞免疫反应的核心作用，抑制 Th1细胞的细胞因子IL-12的产生，从而具有抗炎性细胞因子(anti-i nflammatory cytokine)的功能。最近发现，在过敏性皮炎患者的外周 血液或皮肤病变处，主要产生IL-4、IL-5等的Th2细胞相对增加了 (Miraglia等，异位性皮炎的免疫调节异常，过敏症与哮喘会议录， 第27卷，2006年11月-12月，第451-455页)(Miraglia et.al，Im mune dysregulation in atopic dermatitis，Allergy and Asthma Procee dings，Volume 27，November-December 2006，pages 451-455)。并 且由于Th2反应过剩引起的Th1/Th2失衡会诱发特异性反应疾病等疾 病。并且，如前面所述，已知当Th1反应和Th2反应中只要一种过 剩或另一种不足就会引起疾病，当Th1反应减少，Th2反应增加时， 会引起癌症、特异性反应疾病、过敏性反应疾病、以及自身免疫疾病 (Elenkov和Chrousos，应激激素，Th1/Th2模式，促炎/抗炎细胞因 子和疾病的易感性，内分泌学和新陈代谢趋势，第10卷，1999年1 1月，第359-368页)(Elenkov and Chrousos，Stress hormones，Th 1/Th2 patterns，pro/anti-inflammatory cytokines and susceptibility to disease，Trends in Endocrinology and Metabolism，Volume 10，Nov ember 1999，pages 359-368)。本发明的植物乳杆菌CJLP55通过调 节与免疫调节有关的产生Th1细胞、Th2细胞、巨噬细胞、以及树突 细胞的细胞因子，从而调节由Th2反应过剩引起的Th1/Th2失衡，因 此其有望不仅对特异性反应疾病、过敏性反应疾病等疾病起到有效作 用，而且还对预防和治疗癌症，以及自身免疫疾病也具有效果。
本发明在另外一个侧面，提供一种含有植物乳杆菌CJLP55的用 于增强免疫力的组合物。本发明的用于增强免疫力的组合物中的植物 乳杆菌CJLP55作为乳酸菌，由于其具有上述现有技术中说明的一般 乳酸菌所具有的增强免疫力的作用，因此具有增强免疫力的效果。特 别地，如下述实施例的例证，由于本发明的上述用于增强免疫力的组 合物中的植物乳杆菌CJLP55具有促进Th1反应的效果，具有调节由 于Th2反应过剩引起的Th1/Th2失衡的效果，因此对预防或治疗由于 Th2反应过剩引起的Th1/Th2失衡而诱发的疾病具有效果。因此，本 发明的上述用于增强免疫力的组合物能够有效地用于预防或治疗特 异性反应疾病、过敏性反应疾病、癌症、以及自身免疫疾病。上述自 身免疫疾病包括哮喘、枯草热等，但并不限于这些。
对于上述本发明的用于增强免疫力的组合物的给药方式没有特 别限定，优选为经口给药。给药量根据增强免疫所需的疾病种类、疾 病程度、年龄、性别、人种、治疗或预防目的等有所不同，但是一般 情况下以成人为基准，一天可以给药1千万-1000亿个。
由于含有上述本发明的植物乳杆菌CJLP55的用于预防或治疗肠 道疾病的组合物、以及用于增强免疫力的组合物中含有安全性得到认 可的乳酸菌，因此不会有副作用等的顾虑，可以作为药品、食品、化 妆品、饲料或饲料添加剂来使用。
上述本发明的组合物作为药品使用的情况下，可以制备成本技术 领域中公知的常规药剂学剂型。上述药品优选为经口给药剂型。例如 可制成液体剂、悬浮剂、散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂或浸膏 剂等经口给药剂型。
制备成上述各个剂型时，可以加入制备各个剂型所需的并在药剂 学上允许的载体或添加剂。制备成具有典型的用于经口给药的剂型 时，上述载体可以使用选自稀释剂、润滑剂、粘结剂、崩解剂、甜味 剂、稳定剂以及防腐剂中的一种以上，作为添加剂可以使用选自香料、 维生素类以及抗氧化剂中的一种以上。
上述载体以及添加剂只要是药剂学上允许的均可，优选地，作为 稀释剂具体有乳糖、玉米淀粉、大豆油、微晶纤维素或甘露醇，作为 润滑剂有硬脂酸镁或滑石粉，作为粘结剂有聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基 纤维素。此外，优选地，作为崩解剂有羧甲基纤维素钙、羧基乙酸淀 粉钠、波拉克林钾或交联聚维酮，作为甜味剂有白糖、果糖、山梨醇 或阿斯巴甜，作为稳定剂有羧甲基纤维素钠、β-环糊精、白蜡或黄 原胶，作为防腐剂有对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸 钾。
此外，为了增加味觉，除了上述成分之外，作为公知的添加剂， 还可以混合使用梅花香、柠檬香、菠萝香、香草香等天然香料；天然 果汁、叶绿酸、类黄酮等天然色素；果糖、蜂蜜、糖醇、白糖等甜味 成分；或柠檬酸、柠檬酸钠等酸味剂。
关于这种制剂化方法以及制剂化时所需的载体以及添加剂在《雷 明顿的制药科学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)(第19版， 1995)中有详细记载。
上述本发明的组合物可以作为食品使用。上述食品不仅是保健功 能性食品，还包括人们每日经常摄取的一般的食品。用作保健功能性 食品的情况下，可以和食品学上允许的载体或添加剂一起制备成本技 术领域公知的常规保健功能性食品的剂型，作为所述保健功能性食品 例如可以制备成散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮剂、乳剂、糖浆 剂、液体剂、浸膏剂、茶、果冻或饮料等。上述食品学上允许的载体 或添加剂，根据需要制备的剂型可以选择使用在本技术领域允许使用 的公知的任一载体或添加剂。
由于上述本发明的组合物具有预防或治疗特异性反应疾病的效 果，因此可以用于化妆品上。当将上述本发明的组合物用于化妆品的 情况下，可以制备成现今化妆品技术领域公知的常规剂型的多种化妆 品。制备成上述各种剂型时，可以添加各个剂型制备所需的制备化妆 品时允许使用的载体或添加剂来制备。
上述本发明的组合物还可以作为饲料添加剂或饲料来使用。
作为饲料添加剂使用的情况下，可以将上述组合物制备成20-90 ％的高浓缩液或粉末、或者是颗粒形态。上述饲料添加剂还可以使用 包括选自柠檬酸、富马酸、己二酸、乳酸、苹果酸等有机酸；或磷酸 钠、磷酸钾、酸性焦磷酸盐、聚磷酸盐(聚合磷酸盐)等磷酸盐；或 多元酚、儿茶酸、α-生育酚、迷迭香提取物、维生素C、绿茶提取物、 甘草提取物、壳聚糖、鞣酸、植酸等天然抗氧化剂中的一种或多种。 作为饲料使用的情况下，可以将上述组合物制备成常规饲料形态，可 以包括常规饲料成分。
所述饲料添加剂以及饲料还可以包括谷类，例如有粉碎或破碎的 小麦、燕麦、大麦、玉米以及大米；植物性蛋白饲料，例如有以油菜、 大豆以及葵花籽为主要成分的饲料；动物性蛋白饲料，例如有血粉、 肉粉、骨粉以及海鲜粉；糖分以及乳制品，例如有由各种奶粉以及乳 清粉构成的干燥成分等，除此之外，还可以包括营养补充剂、消化吸 收提高剂以及生长促进剂等。
上述饲料添加剂可以单独喂养动物，或者是和食用载体中的其它 饲料添加剂组合喂养。并且，上述饲料添加剂可以作为追肥(topdre ssing)，和这些动物饲料直接混合，或者是不与饲料一起而另外制备 成经口剂型的方式容易地对动物进行喂养。将上述饲料添加剂不与动 物饲料一起喂养而制备成经口喂养剂型来喂养的情况下，可以和本技 术领域已知的药剂学上允许的食用载体组合使用，制备成能够立刻释 放或缓释的剂型。这些食用载体可以是固体或液体，例如有玉米淀粉、 乳糖、蔗糖、大豆碎片、花生油、橄榄油、芝麻油、以及丙二醇。当 使用固体载体的情况下，饲料添加剂可以是片剂、胶囊剂、散剂、糖 锭剂或含糖片剂或微分散性形态的追肥(topdressing)。当使用液体载 体的情况下，饲料添加剂可以是明胶软胶囊剂、糖浆剂、悬浮液、乳 液剂、或溶液剂等剂型。
上述饲料中可以包括任意满足动物食物需求的通常使用的含有 蛋白质的有机谷粉。这种含有蛋白质的谷粉通常主要由玉米、大豆谷 粉、或玉米/大豆谷粉混合物构成。
此外，上述饲料添加剂以及饲料还含有辅助剂，例如有保存剂、 稳定剂、润湿剂或乳化剂，溶液促进剂等。上述饲料添加剂可以以浸 透、喷雾或混合的方式来添加到动物饲料中使用。
本发明的饲料或饲料添加剂可以应用在包括哺乳类、家禽、以及 鱼类的多数动物的食物中。作为上述哺乳类，不仅可以用于猪、牛、 羊、山羊、实验用啮齿动物以及实验用啮齿动物，还可以用于宠物(例 如狗、猫)等。作为上述家禽类，可以用于鸡、火鸡、鸭、鹅、雉、 以及鹌鹑等，作为上述鱼类可以用于鳟鱼等，但并不限于这些。
有益效果
如上面所述，本发明的新型乳酸菌植物乳杆菌CJLP55作为益生 菌，其耐酸性、耐胆汁酸性，以及肠上皮细胞附着性非常优异，从而 具有整肠效果，并且具有促进Th1反应的效果，具有调节由于Th2 反应过剩引起的Th1/Th2失衡的效果。并且，本发明新型乳酸菌植物 乳杆菌CJLP55可以用在用于预防或治疗肠道疾病的组合物，以及用 于增强免疫力的组合物中，特别是对预防或治疗由于Th2反应过剩引 起的Th1/Th2失衡而诱发的疾病方面具有效果。
附图说明
图1为示出植物乳杆菌CJLP55的耐酸性实验结果的图表。
图2为示出植物乳杆菌CJLP55的耐胆汁酸性实验结果的图表。
图3为示出植物乳杆菌CJLP55的肠上皮细胞附着力实验结果的 图表。
图4为将植物乳杆菌CJLP55菌株对加入卵清蛋白而偏向于Th2 反应的小鼠脾细胞进行处理，然后对诱导Th1反应的细胞因子IL-12 的浓度进行测定的结果与其它乳酸菌进行比较的图表。
图5为将植物乳杆菌CJLP55菌株对加入卵清蛋白而偏向于Th2 反应的小鼠脾细胞进行处理，然后对诱导Th2反应的细胞因子IL-4 的浓度进行测定的结果与其它乳酸菌进行比较的图表。
图6为将植物乳杆菌CJLP55菌株对巨噬细胞株RAW264.7进行 处理后，用酶联免疫吸附法(ELISA)对IL-12以及IL-10的浓度进 行测定的结果与其它乳酸菌进行比较的图表。
图7为将植物乳杆菌CJLP55菌株对树突细胞株JAWSII进行处 理后，用ELISA法对IL-12以及IL-10的浓度进行测定的结果与其它 乳酸菌进行比较的图表。
图8为将植物乳杆菌CJLP55菌株对巨噬细胞株RAW264.7进行 处理后，用反转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)法对IL-12p40及I L-18mRNA的表达进行测定的结果与其它乳酸菌进行比较的图表。
图9为将植物乳杆菌CJLP55菌株对树突细胞株JAWSII进行处 理后，用RT-PCR法对IL-12p40及IL-18mRNA的表达进行测定的结 果与其它乳酸菌进行比较的图表。
具体实施方式
下面根据下述实施例更具体说明本发明。但是，这些实施例只是 为了有助于本发明的理解，本发明的范围并不能以任何方式由这些实 施例来限定。
实施例1：微生物植物乳杆菌CJLP55菌株的分离及鉴定
将由泡菜中分离的植物乳杆菌CJLP55菌株涂布在含有1.5％琼脂 (agar)的MRS固体培养基(Difco，USA)上，于37℃条件下培养 24小时后，用接种环(loop)挑取已经被确认为是纯分离的菌落，将 其在MRS液体培养基(Difco，USA)中，于37℃条件下培养18-24 小时。
然后，对CJLP55菌株的形态以及生理学特性采用Kim等(Kim 等，Leuconostoc inhae sp.nov，一种由泡菜中分离出的乳酸菌，国 际系统进化微生物学杂志，第53卷，2003年7月，第1123-1126页) (Kim et.al.，Leuconostoc inhae sp.nov，a lactic acid bacterium i solated from kimchi，International Journal of Systematic and Evoluti onal Microbiology，Volume53，July 2003，pages 1123-1126)的方法， 并且使用API50CH以及API50CHL试剂盒(生物梅里埃公司产品) 来进行了鉴定。将最后确认的CJLP55菌株的形态及生理学特性整理 在上述表1中。
并且，为了对乳酸菌进行鉴定及分类，分析了16S rRNA基因的 碱基序列。采用了Kim等(Kim等，泡菜乳酸菌新品种，来源于泡 菜的新品种，国际系统与进化微生物学杂志，第50卷，2000年9月， 第1915-1919页)(Kim et.al.，Leuconostoc kimchii sp.nov.，a ne w species from kimchi.International Journal of Systematic and Evo lutional Microbiology，Volume50，September 2000，pages 1915-191 9)的方法对16S rRNA基因的碱基序列进行确定及分析。将最后确 认的CJLP55的16S rRNA基因碱基序列记载于序列目录中(SEQ I D NO：1)。
对于16S rRNA碱基序列进行分析的结果，植物乳杆菌CJLP55 菌株与植物乳杆菌标准菌株(Lactobacillus plantarum NBRC15891T， GenBank accession number AB326351)显示出了最高的同源性(99. 9％)，从而被鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，并且将 其命名为植物乳杆菌CJLP55，于2008年10月16日保藏于生命工学 研究院基因银行(保藏编号为KCTC 11401BP)。
实施例2：植物乳杆菌CJLP55菌株在人工胃液中的耐酸性实验，以 及在人工胆汁中的耐胆汁性实验
在人工胃液中的耐酸性实验是通过使用将Kobayashi等(Kobaya shi等，乳酸菌生物学特性研究：多重抗生素耐药性菌株，干酪乳杆 菌PSR3002，对人工消化液的耐受性。日本微生物学杂志，第29卷， 1974年7月，第691-697页)(Kobayashi et.al.，Studies on biologic al characteristics of Lactobacillus：II.Tolerance of the multiple antibi otic resistance strain，L.casei PSR3002，to artificial digestive fluids. Japan Journal of Microbiology.Volume 29，July 1974，pages 691- 697)的实验进行改良后制备得到的人工胃液来进行的。具体地，人 工胃液是用1N HCl将MRS液体培养基调节为pH2.5后，以1000单 位/mL加入胃蛋白酶后，进行灭菌制备得到。
将上述实施例1中分离并鉴定的植物乳杆菌CJLP55在MRS液 体培养基中，对37℃条件下培养18小时的菌体进行离心分离，使得 乳酸菌株沉淀，然后再用灭菌食盐水(0.85％NaCl)清洗2次后， 将菌体悬浮液以约107cfu/mL分别接种于对照组培养基和人工胃液 中，在37℃条件下进行培养，并且在接种后的0以及3小时后测定 了活菌数。总菌数采用含有KH2PO4、Na2HPO、L-半胱氨酸、HCl、 吐温80等的磷酸缓冲溶液(pH6.8)稀释10倍后进行了测定。
在人工胆汁中的耐胆汁性实验是按照Casey等(Casey等，来源 于猪胃肠道的抗沙门氏乳酸菌的分离和鉴定，Letters in Applied Mi crobiology杂志，第39卷，2004年，第431-438页)(Casey et.al.， Isolation and characterization of anti-Salmonella lactic acid bacteria from the porcine gastrointestinal tract，Letters in Applied Microbiol ogy.Volume 39，2004，pages 431-438)的方法进行的。在上述耐酸 性评价中使用的MRS液体培养基中加入0.3％的黄牛胆汁，然后采用 和上述耐酸性评价方法相同的方法，在接种乳酸菌后的0小时、12 小时、24小时后测定了活菌数。
在上述耐酸性评价及耐胆汁酸性评价中，对典型的乳酸菌干酪乳 杆菌(KCTC3109)、沙克乳杆菌CJLS118(KCTC13416)、以及鼠李 糖乳杆菌GG(KCTC5033)也进行了相同的比较实验。
结果在图1及图2中示出。图1为示出植物乳杆菌CJLP55的耐 酸性实验结果的图表。图2为示出植物乳杆菌CJLP55的耐胆汁酸性 实验结果的图表。
根据图1及图2的结果，与比较实验中的其它乳酸菌相比，植物 乳杆菌CJLP55显示出了具有同等以上的耐酸性及耐胆汁酸性。这说 明本发明的新型菌株在体内不会受到胃液的影响，能够到达肠部，并 且在肠内不会受到胆汁的影响而存活。
实施例3：植物乳杆菌CJLP55菌株对于肠上皮细胞的附着力实验
作为用于肠上皮细胞附着力试验的动物细胞HT-29来源于韩国 细胞株银行(KCLB)，实验方法采用了金等(金等，由猪胃肠道分 离的乳酸杆菌和双歧杆菌的益生菌特性，应用微生物学和生物技术， 第74卷，2007年4月，第1103-1111页)(Kim et.al.，Probiotic pr operties of Lactobacillus and Bifidobacterium strains isolated from p orcine gastrointestinal tract，Applied Microbiology and Biotechnolog y，Volume 74，April 2007，pages 1103-1111)和Hirano等(Hirano 等，鼠李糖乳杆菌在体外对肠道细胞中肠出血性大肠杆菌感染的影 响，微生物学和免疫学，第47卷，2003年，第405-109页)(Hirano et.al.，The effect of Lactobacillus rhamnosus on enterohemorrhagic Escherichia coli infection of human intestinal cells in vitro，Microbi ology and Immunology，Volume 47，2003，pages 405-109)的方法。
利用添加了热灭活的10％胎牛血清(FBS)、1％L-谷氨酸盐、青 霉素G(100IU/mL)、以及链霉素(100mg/mL)的RPMI1640(Gibc o，USA)培养基，在有5％CO2的条件下，于37℃下培养HT-29细 胞。为了进行附着力实验和附着抑制力实验，将HT-29细胞以每孔1. 0×105细胞/mL的数量加入到24孔板上，然后每隔一天就更换培养 基，培养至完全形成单层(monolayer)，并用于实验。用25℃的PB S缓冲溶液对完全形成单层的HT-29细胞清洗5次，然后加入不含抗 生素的0.5mL的RPMI1640培养基。
将植物乳杆菌CJLP55分别以约1.0×109cfu/mL的浓度悬浮于RP MI后，然后接种到上述孔板上，然后在有5％CO2条件下，于37℃ 条件下培养2小时。培养结束后，为了去除没有附着的乳酸菌，以及 为了确定该菌对清洗的附着力，以200rpm转速分别搅拌3分钟，同 时用PBS缓冲溶液清洗3次。清洗结束后加入0.2％胰蛋白酶-EDTA， 从而除去附着的细胞，然后利用蛋白胨(peptone)水，采用连续稀 释法平板涂布于MRS-琼脂(agar)上，再于37℃下培养24小时后， 测定了菌数。
另外，为了确认一部分附着，在70％乙醇中浸泡1天后，将完全 灭菌的盖玻片附着在陪替氏培养皿的底面，对HT-29细胞进行培养， 然后加入和上述等量的乳酸菌进行了实验。将没有被清洗掉而附着于 HT-29细胞上的乳酸菌株干燥后进行革兰氏染色，在光学显微镜下观 察，测定菌数。对沙克乳杆菌CJLS118及鼠李糖乳杆菌GG(KCTC 5033)也做了同样的比较实验。
结果如图3所示。图3为示出植物乳杆菌CJLP55的肠上皮细胞 附着力实验结果的图表。
根据图3的结果，植物乳杆菌CJLP55与商业上熟知的益生菌鼠 李糖乳杆菌GG(KCTC5033)和沙克乳杆菌CJLS118相比，在经过 24小时后，显示出了优异的肠上皮细胞附着力，植物乳杆菌CJLP55 的肠上皮细胞附着力显著高于沙克乳杆菌CJLS118。这样的结果显示 出了本发明的新型菌株可以附着于肠上皮细胞上并改善肠内环境。
实施例4：植物乳杆菌CJLP55菌株的安全性评价
为了对实施例1中分离得到的菌株进行安全性评价，根据韩国生 物企业协会的组合标准中提出的安全性评价试验方法进行了溶血现 象检测、明胶液化反应检测、有害代谢产物(氨)生成确认、以及苯 丙氨酸脱氨检测。
结果如下表2所示。
表2植物乳杆菌CJLP55的安全性评价结果
菌株 项目 明胶液化反应检测 苯丙氨酸脱氨 溶血性实验结果 氨生成 CJLP55 阴性 阴性 α-溶血，安全 阴性
根据上述结果，确认了植物乳杆菌CJLP55(Lactobacillus plant arum CJLP55)对于明胶液化反应，有害代谢产物(氨)生成，苯丙 氨酸脱氨的生成为阴性，对于溶血现象检测中判定为与病原性无关的 α-溶血。并且还确认了植物乳杆菌CJLP55是能够用于人体的安全的 菌株。
实施例5：对小鼠脾细胞进行处理后的IL-12生成促进力的评价
用植物乳杆菌CJLP55(Lactobacillus plantarum CJLP55)菌株 对加入卵清蛋白而偏向于Th2反应的小鼠脾细胞进行处理时，为了对 诱导Th1反应的细胞因子IL-12的生成促进力进行评价，参考Fuiwa ra等(Fujiwara等，针对花粉过敏患者的免疫调节实施的副干酪乳杆 菌KW3110双盲试验，国际变态反应学，2005年，第54卷，第143 -149页)(Fujiwara et.al.A double-blind trial of Lactobacillus para casei strain KW3110 administration for immunomodulation in patien ts with pollen allergy，Allergology International，2005，volume 54， pages 143-149)和Fujiwara等(Fujiwara等，乳酸菌的抗过敏作用表 现为为对双Th1/Th2细胞因子表达和平衡造成影响的菌株依赖性以 及介导，国际变态反应学与免疫学文献，2004年，第135卷，第20 5-215页)(Fujiwara et.al.，The anti-allergic effects of lactic acid ba cteria are strain dependent and mediated by effects on both Th1/Th 2 cytokine expression and balance，International Archives of Allergy and Immunology，2004，Volume135，pages 205-215)的方法，进 行了如下实验。
免疫(immunization)方法如下：购入6周龄雌性Balb/c小鼠5 只，将13mg/mL的1.538mL羟化物(Sigma)溶液、10mg卵清蛋白、 以及0.4615mL的PBS混合均匀后，在常温下反应20分钟，将得到 的混合液按照每只小鼠0.2mL(1mg OVA+2mg明矾(alum))的用 量注射到小鼠腹腔内，在第6天按照相同的用量再次进行腹腔注射以 加强(boosting)。在第13天时将小鼠处死，取出脾脏，将由脾脏中 得到的100μL(4×106细胞/mL)脾细胞(splenocyte)和50μL试验 对象菌的死菌、以及50μL(4mg/mL)的卵清蛋白加到细胞培养孔板 (cell culture well plate)上，在DMEM-10培养基中，于10％CO2培养箱中培养7天。培养7天后，取上清液用IL-12ELISA试剂盒进 行了分析(Biosource)，从而测定了IL-12的浓度。
上述试验对象菌的死菌是按照下面的方法得到的。
试验对象菌是被接种到MRS液体培养基(Difco)中，于37℃条 件下培养24小时，然后将在13,000rpm转速下离心分离1分钟得到 的菌体用生理盐水清洗2次后，仅取了菌体。为了进行动物细胞株接 种试验，将回收的菌体放入到与原来培养液体积相同的灭菌蒸馏水 中，于100℃条件下加热10分钟，在13,000rpm转速下离心分离1 分钟后进行回收，然后以适当的量稀释到DMEM培养基内，从而得 到以细胞株培养液体积为基准的50μg/mL和5μg/mL浓度的菌体。作 为试验对象菌使用了植物乳杆菌CJLP55，对鼠李糖乳杆菌GG(KC TC5033)，干酪乳杆菌(KCTC3109)，沙克乳杆菌CJLS118(KCTC 13416)也进行了相同的实验，并且对其结果进行了比较。
利用上述IL-12ELISA试剂盒的IL-12分析是按照IL-12ELISA 试剂盒所提供的提示事项进行的实验，对ELISA reader中测定的O. D.值进行测定，根据对试剂盒所提供的IL-12对照样品的校准公式(c alibration equation)换算出了IL-12生成量。在图4中示出了得到的 测定结果。
图4为将植物乳杆菌CJLP55菌株对加入卵清蛋白而偏向于Th2 反应的小鼠脾细胞进行处理，然后对诱导Th1反应的细胞因子IL-12 的浓度进行测定的结果与其它乳酸菌进行比较而示出的图表。
根据图4的结果，显示出与其它乳酸菌相比，植物乳杆菌CJLP5 5对诱导Th1反应的细胞因子IL-12的生成具有显著的促进作用。并 且，能够确认本发明的植物乳杆菌CJLP55在偏向于Th2反应的小鼠 中，有效地诱导了Th1反应。
实施例6：对小鼠脾细胞进行处理后的IL-4的生成抑制力的评价
用植物乳杆菌CJLP55(Lactobacillus plantarum CJLP55)菌株 对加入卵清蛋白而偏向于Th2反应的小鼠脾细胞进行处理时，为了确 认对诱导Th2反应的细胞因子IL-4的生成的抑制效果，采用上述实 施例5的方法，除了用IL-4试剂盒(Biosource)代替IL-12试剂盒外， 其它条件均相同的条件下进行了实验。测定的结果如图5所示。
图5为将植物乳杆菌CJLP55菌株对加入卵清蛋白而偏向于Th2 反应的小鼠脾细胞进行处理，然后对诱导Th2反应的细胞因子IL-4 的浓度进行测定的结果与其它乳酸菌进行比较而示出的图表。
根据图5的结果，能够确认植物乳杆菌CJLP55通过抑制诱导T h2反应的细胞因子IL-4，从而在偏向于Th2反应的小鼠脾细胞中具 有抑制Th2反应的效果。
实施例7：确认在巨噬细胞以及树突细胞中诱导Th1淋巴细胞分化的 细胞因子IL-12p40以及IL-18的表达和抑制Th1淋巴细胞分化的细 胞因子IL-10的表达的实验
巨噬细胞和树突细胞等抗原呈递细胞(antigen presenting cell， APC)生成IL-12以及IL-18，从而诱导Th0淋巴细胞向Th1淋巴细 胞分化，另一方面，生成IL-10，从而抑制向Th1淋巴细胞分化的诱 导。为了评价本发明的乳酸菌对于巨噬细胞以及树突细胞的IL-12、I L-10、IL-18生成的影响，进行了下述实验。
将试验对象菌以5×107/mL的浓度对作为巨噬细胞株的RAW26 4.7进行了处理，在37℃、10％CO2的条件下培养48小时，然后取培 养基，采用ELISA方法测定IL-12p40以及IL-10的浓度。并且，对 于树突细胞株JAWSII也采用同样的方法，接种了试验对象菌并进行 了培养，然后取培养基测定了IL-12p40以及IL-10的生成量。
使用植物乳杆菌CJLP55作为上述试验对象菌，作为阳性对照组 使用了脂多糖，对于鼠李糖乳杆菌GG(KCTC5033)、干酪乳杆菌(K CTC3109)、沙克乳杆菌CJLS118(KCTC13416)也进行了相同的实 验，并且对其结果进行了比较。
根据上述ELISA方法的浓度测定采用了能够测定IL-12浓度的I L-12p40试剂盒(BD Biosciences，USA)、以及能够测定IL-10浓度 的IL-10试剂盒(BD Biosciences，USA)进行了测定，并且是按照 制造公司的指南而进行的。并且，图6和图7中分别示出了测定的结 果。
图6示出了将植物乳杆菌CJLP55菌株对巨噬细胞株RAW264.7 进行处理后，用ELISA对IL-12以及IL-10的浓度进行测定的结果与 其它乳酸菌进行比较的图表。
图7示出了将植物乳杆菌CJLP55菌株对树突细胞株JAWSII进 行处理后，用ELISA对IL-12以及IL-10的浓度进行测定的结果与其 它乳酸菌进行比较的图表。
根据图6及图7的结果可知，植物乳杆菌CJLP55生成诱导Th1 分化的细胞因子IL-12，并且确认抑制Th1分化的细胞因子IL-10的 生成与IL-12相比显著少，与其它乳酸菌相比显著增加IL-12的生成。
并且，为了确认在基因水平(level)上的IL-12及IL-18的生成， 将试验对象菌以5×107/mL的浓度对作为巨噬细胞株的RAW264.7进 行了处理，在37℃、10％CO2的条件下培养6小时，然后提取总RN A，采用RT-PCR法测定了IL-12和IL-18mRNA的生成量。对作为树 突细胞株的JAWSII也采用了同样的方法将试验对象菌进行接种及培 养后，提取RNA，采用RT-PCR法测定了IL-12和IL-18mRNA的生 成量。
然后分别在图8及图9中示出了测定的结果。
图8示出了将植物乳杆菌CJLP55菌株对巨噬细胞株RAW264.7 进行处理后，用RT-PCR法对IL-12p40及IL-18mRNA的表达进行测 定的结果与其它乳酸菌进行比较的图表。
图9示出了将植物乳杆菌CJLP55菌株对树突细胞株JAWSII进 行处理后，用RT-PCR法对IL-12p40及IL-18mRNA的表达进行测定 的结果与其它乳酸菌进行比较的图表。
根据图8及图9的结果，可知植物乳杆菌CJLP55会促进mRNA 的生成，所述mRNA对诱导Th1分化的细胞因子IL-12及IL-18的生 成进行指示。
实施例8：制备合有植物乳杆菌CJLP55(Lactobacillus plantarum CJLP55)的益生菌剂
为了将上述实施例1中鉴定的益生菌植物乳杆菌CJLP55(Lacto bacillus plantarum CJLP55)适用于药品、食品、饲料、饲料添加剂 或化妆品的原料中，并且大量生产，因此将其经冷冻干燥后制成了益 生菌剂。
为了生产菌，使用25％NaOH溶液将MRS液体培养基(Difco) 的pH值调节为6.0，并且于37℃条件下培养约18小时，然后离心分 离回收了菌体。使用5％的糊精和10％的脱脂牛奶作为冷冻保护剂， 将回收的菌体于-40℃条件下进行冷冻后，在37℃条件下将干燥的菌 体用搅拌器研磨后将其打碎，并且将打碎的活菌配成目标菌数，为了 保管，将其和适量的葡萄糖、乳糖、脱脂牛奶等赋形剂进行混合放入 密封的铝袋中进行了包装。
这样制备的益生菌剂可以和作为饲料原料的谷粉进行混合用作 饲料用益生菌剂，或者是与载体或添加剂等混合，用作片剂、胶囊等 的药品，以及用作食品用益生菌剂，或者在用于化妆品的原料中混合 一定量，从而可以根据本技术领域常规方法，应用于药品、食品、饲 料、化妆品等多种领域。