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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610143513.7 (22)申请日 2016.03.14 C12M 1/42(2006.01) C12M 1/40(2006.01) G01N 33/53(2006.01) C12N 5/0783(2010.01) (71)申请人 海狸纳米科技 （苏州） 有限公司 地址 215000 江苏省苏州市苏州工业园区星 湖街 218 号生物纳米园 A6 楼 101 室 (72)发明人 任辉 孙大鹏 (74)专利代理机构 苏州华博知识产权代理有限 公司 32232 代理人 何蔚 (54) 发明名称 一种细胞特异性分选体系和细胞特异性分选 。
2、方法 (57) 摘要 本发明涉及一种细胞特异性分选体系， 包括 磁珠、 核酸酶、 核酸链、 特异性抗体 ； 所述磁珠表 面修饰NHS基团或环氧基团 ； 所述核酸酶通过NHS 基团或环氧基团与磁珠连接， 形成磁珠 - 核酸酶 复合物 ； 所述核酸链通过 NHS 基团或环氧基团与 磁珠连接， 特异性抗体通过交联剂与核酸链连接， 形成磁珠 - 核酸链 - 特异性抗体复合物。本发明 还提供一种细胞特异性分选方法， 本发明方法可 以将核酸酶和磁珠与目标细胞完全分离， 避免了 酶对细胞污染， 提高细胞的得率和存活率。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利。
3、要求书1页 说明书3页 附图1页 CN 105695326 A 2016.06.22 CN 105695326 A 1.一种细胞特异性分选体系， 其特征在于： 所述细胞特异性分选体系包括磁珠、 核酸 酶、 核酸链、 特异性抗体； 所述磁珠表面修饰NHS基团或环氧基团； 所述核酸酶通过NHS基团 或环氧基团与磁珠连接， 形成磁珠-核酸酶复合物； 所述核酸链通过NHS基团或环氧基团与 磁珠连接， 特异性抗体通过交联剂与核酸链连接， 形成磁珠-核酸链-特异性抗体复合物。 2.如权利要求1所述的细胞特异性分选体系， 其特征在于， 所述核酸链一端修饰有氨 基， 另一端修饰有巯基； 或者两端均修饰有氨基和。
4、/或巯基。 3.如权利要求1所述的细胞特异性分选体系， 其特征在于， 所述核酸酶为限制性内切 酶、 脱氧核糖核酸酶I。 4.如权利要求1所述的细胞特异性分选体系， 其特征在于， 所述交联剂为Sulfo-SMCC。 5.一种细胞特异性分选方法， 其特征在于， 所述方法包括以下步骤： 1)对磁珠表面进行NHS或环氧基团修饰； 2)将核酸酶通过NHS基团或环氧基团链接到磁珠表面， 形成磁珠-核酸酶复合物； 3)将核酸链通过磁珠上的NHS基团或环氧基团连接到磁珠表面， 形成核酸链-磁珠复合 物； 4)将核酸链通过交联剂和特异性抗体链接， 形成磁珠磁珠-核酸链-特异性抗体复合 物； 5)在细胞样品中加入。
5、磁珠-核酸链-特异性抗体复合物， 细胞被磁珠特异性捕获后形成 磁珠-核酸链-特异性抗体-细胞复合物； 6)通过外加磁场的作用， 磁吸收集目的细胞， 去除非目的细胞； 7)在收集的磁珠与目标细胞复合物的样品中加入磁珠-核酸酶复合物， 剪切核酸链， 使 得目的细胞被释放； 8)通过外加磁场的作用， 去除磁珠-核酸酶复合物和核酸链剪切后的磁珠， 得到目的细 胞。 6.如权利要求5所述的细胞特异性分选方法， 其特征在于， 所述核酸链一端修饰有氨 基， 另一端修饰有巯基； 或者两端均修饰有氨基或巯基。 7.如权利要求5所述的细胞特异性分选方法， 其特征在于， 所述核酸酶为限制性内切 酶、 脱氧核糖核酸酶。
6、I。 8.如权利要求5所述的细胞特异性分选方法， 其特征在于， 所述交联剂为Sulfo-SMCC。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105695326 A 2 一种细胞特异性分选体系和细胞特异性分选方法 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 具体涉及一种细胞特异性分选体系和细胞分选方法。 背景技术 0002 传统的磁珠法细胞分选技术是采用粒径很小的磁珠(如50nm)， 在其表面偶联抗 体， 该抗体能够与细胞表面特定的抗原特异性结合， 从而使得细胞表面结合大量磁珠， 然后 通过磁吸的办法将目的细胞与其他细胞分离开来。 在该细胞分选的方法中， 当磁珠表面的 抗体与细胞表面的对应抗原结合形。
7、成磁珠-抗体-细胞复合体， 并利用磁场将磁珠-抗体-细 胞复合体从各种细胞中筛选出来后， 磁珠会附着在细胞表面， 不能被解离释放， 所筛选出的 细胞是一个磁珠-抗体-细胞复合体， 虽然磁珠的粒径很小， 但仍然会对细胞的生长、 分化等 产生一定的影响， 从而会对实验结果造成一定的影响， 尤其是涉及到药物的输送与释放领 域。 0003 在此基础上， 很多研究针对于磁珠的成分展开， 如利用可降解的生物材料与氧化 铁复合， 得到磁性分离介质等。 这类方法理论上能够避免磁珠在细胞生长过程中产生的影 响， 但是实际操作过程中， 需要添加特定的酶或其他试剂促进生物材料的降解、 核酸链的断 裂， 在这一过程中。
8、， 新引进的酶或者试剂仍然会对细胞的生长、 分化等会产生一定的影响。 0004 如何能够在获得目的细胞后将载体及酶彻底分离， 成为相关领域研究人员的研究 重点。 发明内容 0005 针对以上问题， 本发明提供一种新的细胞特异性分选体系和分选方法， 能够利用 磁珠对细胞进行筛选， 并使得所添加酶或试剂能被完全回收的情况下， 完成目的细胞的分 离， 避免了酶或其他添加试剂对细胞污染以及磁珠对细胞的后续影响。 0006 为达到上述目的， 本发明的技术方案是： 一种细胞特异性分选体系， 包括磁珠、 核 酸酶、 核酸链、 特异性抗体； 所述磁珠表面修饰有NHS基团或环氧基团； 所述核酸酶通过NHS 基团。
9、或环氧基团与磁珠链接， 形成磁珠-核酸酶复合物； 所述核酸链通过NHS基团或环氧基 团与磁珠链接， 所述特异性抗体通过交联剂与核酸链连接， 形成磁珠-核酸链-特异性抗体 复合物。 0007 所述的核酸链一端修饰有氨基基团(NH2)， 另一端修饰有巯基基团(SH)； 或者两端 均修饰有氨基和/或巯基。 核酸通过一端的氨基基团与NHS磁珠偶联。 所述核酸酶为限制性 内切酶、 脱氧核糖核酸酶I。 0008 所述交联剂为Sulfo-SMCC。 0009 通过交联剂Sulfo-SMCC(琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯)两端 的NHS基团和马来酰亚胺基团分别与特异性抗体的氨基基团和。
10、磁珠表面核酸链的巯基基团 偶联， 从而实现磁珠、 核酸链、 特异性抗体之间的偶联， 形成磁珠-核酸链-特异性抗体复合 物。 说明书 1/3 页 3 CN 105695326 A 3 0010 本发明还提供一种细胞特异性分选方法， 所述方法包括以下步骤： 0011 1)对磁珠表面进行NHS或环氧基团修饰； 0012 2)将核酸酶通过NHS基团或环氧基团链接到磁珠表面， 形成磁珠-核酸酶复合物； 0013 3)将核酸链通过磁珠上的NHS基团或环氧基团连接到磁珠表面， 形成核酸链-磁珠 复合物； 0014 4)将核酸链通过交联剂与特异性抗体偶联， 形成磁珠-核酸链-特异性抗体复合 物； 0015 5。
11、)在细胞样品中加入磁珠-核酸链-特异性抗体复合物， 形成磁珠-核酸链-特异性 抗体-细胞复合物； 0016 6)通过外加磁场的作用， 磁吸收集吸附在磁珠表面的目的细胞， 去除非目的细胞； 0017 7)在收集的磁珠与目标细胞复合物的样品中加入磁珠-核酸酶复合物， 剪切核酸 链， 使目的细胞释放出来； 0018 8)通过外加磁场的作用， 去除磁珠-核酸酶复合物和核酸链剪切后的磁珠， 使得细 胞与磁珠分离， 磁吸后所获得上清液即为目的细胞悬液。 0019 本发明可同时去除细胞分离磁珠及磁珠-核酸酶复合物， 获得高质量无核酸酶污 染的目的细胞悬液。 0020 本发明采用NHS基团或环氧基团修饰磁珠，。
12、 只需简单地将含伯氨基或巯基的生物 配体溶解于偶联缓冲液中， 室温下将样品与经NHS或环氧基团修饰的磁珠混合12h便可将 生物配体共价偶联到磁珠上， 具有操作简单、 偶联条件温和、 生物配体偶联快速高效的优 点。 0021 将核酸酶与磁珠链接， 可在获得目的细胞后完全去除， 避免核酸酶对细胞生长、 分 化等影响， 从而可以获得高质量的目的细胞悬液。 0022 本发明可以将核酸酶和磁珠与目标细胞完全分离， 避免酶对细胞污染以及磁珠对 细胞的后续影响， 提高细胞的得率和存活率。 附图说明 0023 图1是本发明的原理和流程示意图。 具体实施方式 0024 下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的。
13、说明。 0025 实施例1 0026 实现本发明技术的步骤： 0027 1.对磁珠表面进行NHS修饰； 0028 2.将核酸酶通过NHS基团链接到磁珠磁珠表面， 形成磁珠-核酸酶复合物； 0029 取1mL磁珠于1.5mLEP管中， 加入250 L核酸酶液； 室温垂直混合。 0030 磁吸去除上清液， 加入1mL50mMTris缓冲液， 磁吸去除上清液， 然后继续向EP管 中加入1mL50mMTris缓冲液， 室温继续孵育， 待用。 0031 图1中， 第2步示意表明了这一过程， 将核酸酶偶联到磁珠。 0032 3.将磁珠与核酸链偶联， 形成核酸链-磁珠复合物； 说明书 2/3 页 4 CN 。
14、105695326 A 4 0033 将2nmol的20bp核酸片段， 用100mM2-吗啉乙磺酸在EP管中定容到500 L-1000 L， 制备成核酸偶联缓冲溶液； 取磁珠1mL， 用500 L100mM2-吗啉乙磺酸快速洗涤， 磁吸分离后 去掉上清， 然后将核酸偶联缓冲溶液加入到磁珠中混匀； 25反应2h， 磁吸， 将上清转移到 新的EP管中留做电泳检测。 将偶联后的磁珠用1M乙醇胺封闭2h， 然后用PBS对磁珠进行洗 涤， 得到核酸链-磁珠复合物， 待用。 0034 4.交联剂活化抗体， 形成磁珠-核酸链-特异性抗体复合物 0035 取0.334mgs lfo-SMCC交联剂溶解到1ml。
15、PBS中配制成交联剂溶液， 将配制好的 交联剂溶液加入到步骤3所得到的核酸链-磁珠复合物中， 垂直混匀， 室温反应1h； 磁吸收集 磁珠并用1mlPBS快速清洗3次； 取0.25mgCD3抗体加入到0.5mlPBS中配制成0.5mg/ml的 抗体偶联液， 加入到上述磁珠中， 轻轻混合均匀， 室温垂直混合反应2h， 磁吸去上清， 用PBS 清洗磁珠3次， 形成磁珠-核酸链-抗体复合物， 0.1MPBS保存待用。 0036 图1中， 第4步显示了这一过程。 0037 5.细胞分选 0038 用淋巴分离液分离获得外周血淋巴细胞(PBMC)(按照淋巴分离液提供的使用说明 操作)， 收集外周血淋巴细胞约。
16、107个细胞， 然后5mlPBS重悬细胞配制成2106细胞/ml PBS， 根据实验设计分成相应的实验组， 每组实验1ml细胞悬液， 然后在该细胞悬液中加入磁 珠-核酸链-特异性抗体复合物， 室温孵育20min， 形成磁珠-核酸链-特异性抗体-细胞复合 物； 0039 图1中， 第5步显示了这一过程。 0040 6.去除非目的细胞 0041 将孵育完的磁珠-核酸链-特异性抗体-细胞复合物置入磁场中， 通过外加磁场的 作用进行磁性分离， 吸弃上清液， 加入1mLPBS， 轻轻吹打混匀， 进行磁性分离， 吸弃上清液 并重复洗涤三次， 去除非目的细胞； 0042 7.释放目的细胞 0043 将磁珠-。
17、核酸酶复合物加入到清洗后的磁珠-核酸链-特异性抗体-细胞复合物中， 室温孵育， 剪切核酸链， 使得目的细胞被释放； 0044 图1中， 第7、 8步示意了磁珠-核酸酶复合物加入到磁珠-核酸链-特异性抗体-细胞 复合物中， 核酸链被剪切， 细胞被释放的过程。 0045 8.去除磁珠 0046 将孵育后的混合物置入磁场中， 进行磁性分离， 通过外加磁场的作用， 去除磁珠- 核酸酶复合物和核酸链剪切后的磁性微球， 保留上清液， 即获得目的细胞。 如图1的第8步所 示， 核酸酶、 磁珠与目标细胞实现了分离， 同时避免了酶对细胞污染， 提高细胞的得率和存 活率。 0047 以上所述的仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本领域的普通技术人员 来说， 在不脱离本发明创造构思的前提下， 还可以做出若干变形和改进， 这些都属于本发明 的保护范围。 说明书 3/3 页 5 CN 105695326 A 5 图1 说明书附图 1/1 页 6 CN 105695326 A 6 。