用于反相色谱的掺杂材料.pdf

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1、10申请公布号CN104220158A43申请公布日20141217CN104220158A21申请号201380016645822申请日20130321439/1220120328CHB01J20/287200601B01D15/32200601B01J20/288200601B01J20/32200601C07K1/2020060171申请人奇奥凯姆股份公司地址瑞士维提孔安塞72发明人N弗雷M艾德曼D格塔兹M莫尔比代利S伯纳迪R卡拉夫74专利代理机构上海专利商标事务所有限公司31100代理人郭辉54发明名称用于反相色谱的掺杂材料57摘要一种用于反相色谱的材料，其包括结合到固体支持物的表面改。

2、性非极性基团和带电基团，所述带电基团约以02522的表面改性基团的量存在，或者对于表面改性基团总量为36微摩尔/平方米的材料而言参考固体支持物的表面约以00108微摩尔/平方米的量存在。可通过下述来评估这种材料和用于活性药物成分API如肽的合适的条件A测定感兴趣的API的等电位点PI，B选择固相材料稳定的PH范围，C测定PIPH之差，和D如果PIPH之差是正的，选择阴离子交换AIEX材料，或者，如果PIPH之差是负的，选择阳离子交换CIEX材料。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014092586PCT国际申请的申请数据PCT/CH2013/0000502013032187PCT。

3、国际申请的公布数据WO2013/143012EN2013100351INTCL权利要求书2页说明书10页附图10页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书10页附图10页10申请公布号CN104220158ACN104220158A1/2页21一种用于反相色谱的材料，其包括结合到固体支持物的表面改性基团，所述表面改性基团不是水平聚合的，所述表面改性基团包括非极性未带电基团和极性基团，其特征在于，所述极性基团是带电基团，所述带电基团是带正电的或带负电的，且所述带电基团约以02522的表面改性基团的量存在，或者对于表面改性基团总量为36微摩尔/平方米的材料而言参考固体支。

4、持物的表面约以00108微摩尔/平方米的量存在。2如权利要求1所述的材料，其特征在于，所述非极性未带电基团是直链C4C18烷基基团，优选地是C8基团，且所述带电基团是脂肪族C1C18基团例如C3基团的末端取代基。3如权利要求1或2所述的材料，其特征在于，带电基团的脂肪族基团长度小于或类似于非极性基团的长度，例如将带电的C3基团和非极性的C8基团组合。4如上述权利要求中任一项所述的材料，其特征在于，带电基团选自下组NR3，优选地为NR3且R是氢或C1C2烷基如甲基，或者SO3。5如上述权利要求中任一项所述的材料，其特征在于，所述固体支持物是硅胶，优选地是高纯度硅胶，其孔隙率为50300埃，优选地。

5、约100埃，且粒度为5100微米，优选地为1020微米。6一种用于反相色谱分离活性药物成分API优选为肽的方法，所述方法包括通过下述来评估合适的反相材料，特别是权利要求15中任一项所述的反相材料，和评估API纯化条件A测定感兴趣的API的等电位点PI，B选定固相材料稳定的PH范围，C测定PIPH之差，和D如果PIPH之差是正的PIPH，选择阴离子交换AIEX材料，或者如果PIPH之差是负的PIPH，选择阳离子交换CIEX材料。7如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还包含以下步骤E通过调节洗脱条件来评估所需的保留时间。8如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述洗脱条件包括测定缓冲剂的离子。

6、浓度。9如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述洗脱条件包括测定洗脱系统、初始洗脱剂组成和梯度。10如权利要求69中任一项所述的方法，其特征在于，洗脱剂是水性缓冲剂和乙腈。11如权利要求610中任一项所述的方法，其特征在于将PH选择为39，优选地为47。12用于反相色谱的材料的应用，所述材料包括结合到固体支持物的表面改性基团，所述表面改性基团包括非极性未带电基团和极性基团，其特征在于，所述极性基团是带正电基团，特别是权利要求15中任一项所述的用于在PIPH条件下反相纯化蛋白质的带正电材料。13用于反相色谱的材料的应用，所述材料包括结合到固体支持物的表面改性基团，所述表面改性基团包括非极性未。

7、带电基团和极性基团，其特征在于，所述极性基团是带负电基团，特别是权利要求15中任一项所述的用于在PIPH条件下反相纯化API的带负电材料。14一种用来制备如权利要求15中任一项所述的用于反相色谱的材料的方法，所述权利要求书CN104220158A2/2页3方法包括从含非极性基团和极性带电基团的液体溶液同时连接所有的表面改性基团，并任选地测定连接的非极性基团和离子基团的量。15一种用来制备如权利要求15中任一项所述的用于反相色谱的材料的方法，所述方法包括连接非极性基团的第一步和随后连接带电基团的第二步，或者包括连接带电基团的第一步和随后连接非极性基团的第二步，其特征在于，进行第一步从而一些有效硅。

8、烷醇基团不反应，且其中任选地测定实际连接的离子基团。权利要求书CN104220158A1/10页4用于反相色谱的掺杂材料0001相关申请的交叉引用0002本申请要求2012年3月28日提交的瑞士专利申请号0439/12的优先权，该文的全部内容通过引用纳入本文。技术领域0003本发明涉及用色谱纯化活性药物成分如肽领域，具体涉及用于反相色谱的基于硅胶的材料。背景技术0004反相色谱是广泛使用的肽纯化方法。在液相色谱中用作固定相的几种材料包括支持物或载体，其上连接了官能团。这种材料也称为结合相。通常使用的载体是硅胶，其可通过合适的硅烷进行适当的表面改性。硅烷和各种表面的化学已进行了充分研究。硅烷和含。

9、硅色谱支持材料表面反应的一般讨论参见HPLC柱理论技术和实践HPLCCOLUMNSTHEORYTECHNOLOGY,ANDPRACTICE,UD尼优尔UDNEUE,威力公司WILEYVCH，纽约1997。硅烷和多孔二氧化硅的反应的其它细节参见二氧化硅表面的表征和化学改性CHARACTERIZATIONANDCHEMICALMODICATIONOFTHESILICASURFACE,EF范萨特EFVANSANT等，爱斯韦尔公司ELSEVIERSCIENCEBV，纽约1995。硅烷和各种材料的反应的更全面的描述参见硅胶和结合相，它们的制备，性质和在LC中的应用SILICAGELANDBONDEDPH。

10、ASES,THEIRPRODUCTION,PROPERTIESANDUSEINLC,RPW斯考特RPWSCOTT,威利父子公司JOHNWILEYSONS，纽约1993。0005可使用单官能度、双官能度和三官能度硅烷来制备结合相，得到强度不同的结合层。0006因为平衡反应和空间位阻，不管使用的是单官能度、双官能度还是三官能度硅烷，都不可能使所有的硅烷醇基团和甲硅烷基化试剂反应。只有甲硅烷基化试剂水平聚合时，才有可能实现几乎完全的覆盖。报道了即使使用最活泼的甲硅烷基化反应，只可将不大于50的硅烷醇基团转化成甲硅烷基化衍生物。0007因为使用双官能度和三官能度硅烷制备的结合相难以重现，大多数市售结合。

11、相都基于单官能度硅烷。0008因为仍然存在大量原始硅烷醇基团，除非被屏蔽，否则它们可能与亲硅烷醇分析物发生相互作用。减少这种相互作用的常用方法是所谓的封端。这里使少量的单官能度硅烷例如，三甲基氯硅烷与硅胶表面反应，来为硅胶表面提供额外的覆盖。0009US7,125,488B2教导了通过提供极性改性的固定相材料来解决目前存在的问题，所述材料包括无机支持物，例如用提供极性改性的特殊硅烷改性的硅胶。极性改性包括基团如O、CONH、OCONH和CH2CH2ON。0010最近，高度集中在开发具有双模化学表面特征的固定相。反相/离子交换RP/IEX混合模式的固定相是已知的，且因为用于保留和分离各种带电极性。

12、化合物，以及更多说明书CN104220158A2/10页5的非极性的、离子和非离子分析物的多功能性和能力而前景广阔。根据官能团的排布，可将RP/IEX双模柱分成四类。一种类型材料是RP和IEX小珠的混合物。另一种类型材料包括以类似量连接到相同小珠的非极性基团和极性基团例如胺和羧酸，第三类型材料包括极性基团封端的非极性链，第四种类型的混合模式材料包括嵌入在非极性链之内的阴离子或阳离子带电基团。0011GB2074892A描述了具有混合表面的材料，其中一种配体选自离子或反相配体，且第二种是亲水基团如二醇、二醇前体或酰胺。0012此外，GB2431399A还揭示了含结合到表面的2种不同甲硅烷基部分的。

13、混合表面。这些甲硅烷基部分各自包括2种C1C6烷基链和1种其它基团。在优选地实施方式中，所述其它基团是在甲硅烷基之一上的非极性基团，和在嵌入在另一甲硅烷基上的非极性链之内的极性基团。0013还熟知的是基于纳米聚合物二氧化硅混合技术的三模式柱。这种柱包括迪奥耐斯公司DIONEX的TRINITYTMP1。这种材料由高纯度多孔球形硅胶组成，该硅胶用带电的例如，从而具有阳离子交换功能纳米聚合物颗粒涂覆，且用提供RP和IEX性质的有机层改性硅胶的内部孔面积。0014已开发了其它混合模式材料，且用商标KROMASILTM属于阿克苏诺贝尔公司AKZONOBEL表示。据描述，这种一种颗粒多种树脂固定相包括50。

14、或25的不同官能团如极性官能团CN、NH2、二醇。尽管在某些情况下，这些相提供更好的分离，但对于大量应用它们仍然不能令人满意。0015CN101829551A揭示了与非极性配体和离子配体结合的色谱材料，其用于从牛奶样品分离三聚氰胺和分离几种植物激素。所揭示的阴离子基团密度为3366。0016还已知的是因为水平聚合而具有增强配体密度的材料。已发现与仅仅接枝的材料相比，这些材料具有高得多的配体密度。水平聚合的材料首先由费尔班克FAIRBANK和维尔士WIRTH描述，表面吸附的水在三氯硅烷水平聚合中的作用ROLEOFSURFACEADSORBEDWATERINTHEHORIZONTALPOLYMER。

15、IZATIONOFTRICHLOROSILANES,JOURNALOFCHROMATOGRAPHYA,8301999285291,，并且由李LI,卡尔CARR和伊凡斯EVANS进一步研究,用于反相液相色谱的水平聚合结合相的保留和稳定性研究STUDIESOFRETENTIONANDSTABILITYOFAHORIZONTALLYPOLYMERIZEDBONDEDPHASEFORREVERSEDPHASELIQUIDCHROMATOGRAPHY,JOURNALOFCHROMATOGRAPHYA,8682000153167。将该技术应用于不同的配体即非极性和极性配体或者非极性和离子配体的描述参见WO。

16、2011/012019，和韦WEI等，一种基于极性共聚方法的新型反相/强力阴离子交换混合模式固定相，和它在马兜铃酸富集中的应用ANEWREVERSEDPHASE/STRONGANIONEXCHANGEMIXEDMODESTATIONARYPHASEBASEDONPOLARCOPOLYMERIZEDAPPROACHANDITSAPPLICATIONINTHEENRICHMENTOFARISTOLOCHICACIDS,JOURNALOFCHROMATOGRAPHYA,12462012129136。0017这种水平聚合材料的问题在于成功的制备取决于吸附的水，因此必须使用非常复杂的步骤来制备它们，使它。

17、们变得昂贵并由此不适于制备性应用。此外，尽管这种材料成功的应用于特殊马兜铃酸的分析富集，但它们在制备性应用中是失败的韦WEI等。0018因为最尖端的材料要么就分离质量而言和/或就保留时间而言和/或特别是期说明书CN104220158A3/10页6望用于制备性应用时就它们的制造成本而言是不令人满意的，所以存在对改进的材料的需求。发明内容0019因此，本发明的总体目标是提供用于反相色谱的固定相材料，其可用于纯化或者分离特殊活性药物成分API，特别是适于制备性纯化或者分离特殊API。0020本发明的另一目标是提供一种方法，其使得能为通过反相色谱的API纯化提供合适的固定相材料和/或合适的洗脱条件。0。

18、021现在，为了实施本发明的这些和将在下文中变得更加明显的其它目的，用于反相色谱的材料特征在于，所述材料包括结合到固体支持物的表面改性基团，所述表面改性基团不是水平聚合的且包括非极性未带电基团和极性基团，其中所述极性基团是带电基团，所述带电基团是带正电的或带负电的，且所述带电基团约以02522的表面改性基团的量存在，或者对于表面改性基团即非极性未带电基团和带电基团总量为36微摩尔/平方米的材料而言参考固体支持物的表面约以00108微摩尔/平方米的量存在。0022通过标准技术如元素分析来测定表面改性基团的总量，且可通过离子滴定来测定带电基团的量。0023还将根据本发明的用于反相色谱的材料称为掺杂。

19、材料、或者用于反相色谱的掺杂材料或者掺杂的反相材料，因为其包括少量掺杂的带电基团，带电基团的量最多为22，优选地最多为20或15或10。0024当非极性基团和带电基团的总表面覆盖率不太高，即没有使用水平聚合获得的那么高时，掺杂效果似乎最佳。假定使用水平聚合获得的高表面覆盖率可能是在韦WEI等报道的制备性分离实验中的不良结果的原因。0025本文所用术语API指具有非极性基团和带电基团的分子，特别是肽，优选地为最多具有约50氨基酸AA的肽。0026因为固体支持物本身是基本上屏蔽的，所以可使用用于色谱目的的任意固体支持物。但是，优选地是硅胶，因为表面上的硅烷醇基团允许通过与例如硅烷反应方便地连接改性。

20、基团。合适的硅烷是例如单官能度硅烷如单氯取代的硅烷或者三官能度硅烷如三甲氧基硅烷。目前，三甲氧基硅烷是优选的，因为它们最多能与3个相邻的硅烷醇基团反应，由此屏蔽硅烷醇基团并同时强化改性取代基的锚定。此外，已证明即使使用三官能度硅烷，表面也被足量的取代基/表面改性基团覆盖。此外，到目前为止，没有观察到用于三官能度硅烷的最新技术中报道的重现性问题。0027合适的硅胶是高纯度硅胶，其孔隙率为50300埃，优选地约100埃，且粒度为5100微米，优选地为1020微米。0028优选地非极性未带电基团是直链C4C18烷基基团，特别是C8烷基基团，尽管也可使用烯基和炔基基团。烷基基团是优选的，因为它们具有最。

21、大的运动自由度。0029优选地将带电基团置于更短或长度类似于非极性基团的脂肪链上，从而确保带电基团不主导未带电的非极性基团。更短的链可例如最多短6CH2基团，通常最多短5CH2基团，优选地35CH2基团。因此，携带带电基团的烃链可为C1C18链。尽管已知将带电基团嵌入烃链之内，目前优选的是末端位置或者在烃链的末梢的位置。说明书CN104220158A4/10页70030带电的取代基具有下述效果排斥相同电荷的氨基酸和吸引相反电荷的氨基酸。虽然带电取代基的电荷不重要，目前单电荷取代基如NR3且R氢或C1C2烷基，或者SO3优于多电荷取代基。少量的单电荷取代基已经具有足够的效果。0031取决于待纯化。

22、的API和分离条件，不同的掺杂的反相材料可以是合适的。可通过下述来选定最佳的材料和API纯化条件0032A测定感兴趣的API的等电位点PI，0033B选定固相材料稳定的PH范围，0034C测定PIPH之差和0035D如果PIPH之差是正的PIPH，选择阴离子交换AIEX材料，或者0036如果PIPH之差是负的PIPH，选择阳离子交换CIEX材料。0037因此，本发明还包括0038I用于反相色谱的材料的应用，所述材料包括结合到固体支持物的表面改性基团，所述表面改性基团包括非极性未带电基团和极性基团，其中所述极性基团是带正电基团，具体来说，是如上所定义的用于反相纯化API特别是在PIPH条件下纯化。

23、蛋白质的带正电材料，和0039II用于反相色谱的材料的应用，所述材料包括结合到固体支持物的表面改性基团，所述表面改性基团包括非极性未带电基团和极性基团，其中所述极性基团是带负电基团，具体来说，是如上所定义的用于反相纯化API特别是在PIPH条件下纯化蛋白质的带负电材料。0040测定等电位点包括实验测定、从氨基酸AA序列计算，还包括在文献或含个体知识的其它来源中搜索各信息。0041应选定PH，使材料的寿命不受影响。对于硅胶而言，PH为39是优选的，甚至更优选地PH为47。0042如果已选定了材料，可固定所需的保留时间，然后可通过测定缓冲剂的离子浓度和/或通过测定流动相洗脱系统的溶剂系统和梯度，来。

24、调节洗脱条件。0043可能的洗脱系统包括或者由下述组成至少一种极性溶剂，优选水如具有特殊PH的水和极性低于水的极性的至少一种其它极性溶剂的组合。这种极性更小的溶剂可例如包括或由下述组成甲醇、乙醇、异丙醇、四氢呋喃THF、乙腈及其组合。在一种优选的实施方式中，使用的是缓冲的水溶液而不仅仅是有特殊PH的水。0044已证明适于不同分离应用的洗脱系统之一是水性缓冲剂和乙腈。可通过常规方法来发现洗脱系统的起始组成和最终组成以及梯度。0045附图简要说明0046当考虑下述本发明的详细描述时，将更好理解本发明，且除了上述目的以外的其它目的将变得明显。这种描述参考了附图，其中0047图1显示了反应混合物中的阴。

25、离子官能团SO3和连接至硅胶的阴离子官能团之间的相互关系。0048图2显示了反应混合物中的阳离子官能团NR3和连接至硅胶的阳离子官能团之间的相互关系。0049图3显示了缓冲剂浓度图3A表示300MM醋酸盐，图3B表示500MM醋酸盐，图3C说明书CN104220158A5/10页8表示800MM醋酸盐对带正电API在不同柱上的保留时间的影响。0050图4显示了改性的乙腈梯度对保留时间的影响，其中图4A显示了使用相同洗脱条件时具体柱的保留时间，而图4B显示了可通过改变初始组成和/或梯度将停留时间汇聚在一起。0051图5显示了不同柱材料上和两种不同PH下，用于分离胰岛素/脱酰胺胰岛素胰岛素PI53。

26、的选择性。0052图6显示了根据实施例5的合成肽1的制备性纯化。0053图7显示了根据实施例6的合成肽2的制备性纯化。0054图8显示了根据实施例7的合成肽3的制备性纯化。0055实施本发明的方式0056根据目前优选的用于表面改性的方法，同时从含非极性基团和极性带电基团的液体溶液中连接所有的表面改性基团。取决于所用的取代基，已发现反应可能或多或少有利于带电基团或者非极性基团。因此，必须通过例如离子滴定来测定实际获得的材料。0057还可在多个步骤中进行反应，即首先连接非极性基团，然后连接带电基团，反之亦可。但是，在该方法中必须选定反应条件，从而在第一步骤中一些有效的硅烷醇基团不发生反应。在任何情。

27、况下，以及在两或更多步骤方法中，必须通过例如离子滴定来测定实际连接的离子基团。0058带电基团的优选的和/或可获得的范围可能随带电基团的不同而不同。对于SO3，常用范围是001微摩尔/平方米004微摩尔/平方米，对于NR3，常用范围是001微摩尔/平方米08微摩尔/平方米，尽管可方便的形成更高的量参见下文实施例。但是，已发现NR3例如，RCH3掺杂更高的材料不那么好见图3和4。离子基团量的下限是出于肉眼可见效果必须存在的掺杂离子基团的最小数目。分别通过吸附的强或弱来给出上限。因此，可使用高于表示量的离子基团，但可能会有更差的分离和/或不足的停留时间。0059掺杂的影响是在API带正电的等电位点。

28、PIPH正的，或者PIPH情况下，其在AIEX材料如NR3掺杂材料上的吸附是弱的排斥，而在CIEX材料如SO3掺杂材料上的吸附是强的吸引，反之亦然。0060如上所述，非极性基团优选的为至少C4基团，且通常不大于C18基团，目前优选的是C8基团。带电基团包括任意带电取代基，优选地包括连接至C1C8烃的带电取代基，更优选地包括连接至长度略小于或约等于非极性链长度的烃的带电取代基。因为取代基大于氢的事实，携带带电取代基的基团通常和优选地具有稍微更短的链，例如为C3，与非极性基团的C8相比较。无意于通过任意解释来缩小本发明的范围，发明人假设通过更短的烃链来连接离子基团导致更弱的离子基团屏蔽，并因此导致。

29、分析物中分子更低的吸引或排斥。0061现在通过下面的实施例来进一步描述本发明0062实施例10063通过根据标准技术，将几种CIEX和AIEX材料暴露于含C8化合物辛基三甲氧基硅烷和0,5,10,15或50的带SO3电荷的或者带NR3电荷的C3化合物的组合物，来制备它们。0064可通过混合所需量的硅胶、辛基三甲氧基硅烷、N三甲氧基甲硅烷基丙说明书CN104220158A6/10页9基N,N,N氯化三甲基铵和对甲苯磺酸催化剂，并在甲苯中沸腾回流6小时，来制备NR3材料R甲基。0065所需的量如下0066辛基三甲氧基硅烷的浓度为00671X56106MOL/M2SMMWT,其中0068X是所需的N。

30、R3基团的重量百分数，0069S是硅胶的比表面积M2/G，0070M是所用硅胶的质量G和0071MWT是辛基三甲氧基硅烷的分子量G/MOL。0072N三甲氧基甲硅烷基丙基N,N,N氯化三甲基铵作为50重量硅烷在甲醇中的溶液使用，且所用溶液的量为0073X2G/GMX2M，其中0074X是如上所述的NR3基团的百分数，和0075M是硅胶的质量G。0076对甲苯磺酸催化剂的浓度为86103G/G的辛基三甲氧基硅烷和N三甲氧基甲硅烷基丙基N,N,N氯化三甲基铵。0077在6小时之后，对材料进行封端，即通过标准技术使未反应的仍然可接近的硅烷醇基团与三甲基氯硅烷反应，并用不同极性的一系列溶剂洗涤。007。

31、8通过混合所需量的硅胶、辛基三甲氧基硅烷、巯基丙基三甲氧基硅烷、和对甲苯磺酸，并在甲苯中沸腾回流6小时来制备SO3材料。0079所需的量如下0080辛基三甲氧基硅烷的浓度为00811X56106摩尔/M2SMMWT,其中0082X是所需的SO3基团的重量百分数，0083S是硅胶的比表面积M2/G，0084M是所用硅胶的质量G和0085MWT是硅烷的分子量G/MOL。0086所用巯基丙基三甲氧基硅烷的浓度为0087X56106MOL/M2SMMWT,其中0088X是所需的SO3基团的重量百分数，0089S是硅胶的比表面积M2/G，0090M是所用硅胶的质量G和0091MWT是硅烷的分子量G/MO。

32、L。0092对甲苯磺酸的浓度为86103G/G的所用辛基三甲氧基硅烷和巯基丙基三甲氧基硅烷总量。0093然后，使用标准技术对材料进行封端，并用不同极性的一系列溶剂洗涤。0094通过如下所述的氧化巯基基团来形成SO3基团将材料置于30体积丙酮在H2O230重量，在水中中的溶液中，并将溶液在室温下保持12小时。最后，用水和甲醇洗涤材料。说明书CN104220158A7/10页100095通过离子滴定测定的连接的带电基团的量随溶液中浓度的函数见图1用于阴离子官能团SO3和图2用于阳离子官能团NR3。0096将这样制备的CIEX柱称为C55阴离子基团在溶液中,C1010阴离子基团在溶液中,C1515阴。

33、离子基团在溶液中,C5050阴离子基团在溶液中,和C100100阴离子基团在溶液中,中性柱RP0离子基团在溶液中,和AIEX柱A55阳离子基团在溶液中,A1010阳离子基团在溶液中,A1515阳离子基团在溶液中和A5050阳离子基团在溶液中。连接的带电基团通过滴定测定的量可来源于图1和2。0097实施例20098使用不同的柱和所用PH为48的醋酸盐缓冲液的不同的离子强度，但相同的乙腈ACN梯度为051体积/分钟，对PI为1112的肽合成肽1进行分离，起始于约19ACN。0099从图3A3C各自可知，带正电的肽在NR3/C8材料上的吸附较低排斥，而在SO3/C8材料上的吸附较强吸引。在相同的条件。

34、下测试了几种柱，且相互比较停留时间。可知，柱A15分别具有几乎无吸附或者强排斥，而材料C15具有强吸附并因此有长停留时间。A15材料是不可用的，因为感兴趣的肽不吸附，而C15材料从经济角度看也不是太好，因为纯化过程太慢，需要大量的溶剂。0100从图3A到3C的比较可知，具有约1微摩尔/平方米的柱A15不仅保留时间短小于5分钟，还对离子浓度缓冲液浓度的改变不起反应。这是该材料不适于预期应用的另一个证据。0101与之相反的是，掺杂更少的材料对改变的反应条件反应非常敏感，使得它们全部成为有价值的反相材料。通过将缓冲液浓度从300MM醋酸盐增加到800MM醋酸盐，可将C15上的停留时间从大于30分钟减。

35、少到小于25分钟。此外，在高缓冲液浓度下，所有柱的停留时间变得更接近，表明盐醋酸盐屏蔽了电荷，从而掺杂材料的性能类似于未掺杂的RP材料。0102如上所述，只有A15没有发现效果。无意于通过任意解释来限制本发明，发明人假设这种意料之外的性能可表明该材料排斥太强以至于所用的缓冲液浓度不足于克服这种排斥。0103实施例30104在本实施例中，研究了改变的起始浓度和梯度对不同柱的保留时间的影响。为了最小化缓冲盐的影响，只使用了100MM醋酸盐缓冲液。在本实施例中，API也是PI为1112的合成肽1。0105ACN梯度为025体积/分钟。0106在一实验中，ACN初始浓度是22ACN参见图4A，在第二实。

36、验中改变ACN初始浓度来确保保留时间TR303分钟图4B。0107从图4A和4B的比较可知，停留时间高度取决于初始ACN浓度。0108对于所有柱而言，得到图4B所示结果的条件如下文表1所列0109表10110说明书CN104220158A108/10页110111实施例40112研究了PH为48和PH为68时，不同柱在分离胰岛素/脱酰胺胰岛素胰岛素PI53时的选择性。结果示于图5。0113实验条件是0114洗脱剂240MM醋酸盐PH分别为48或68且ACN的量确保胰岛素的停留时间TR为约32分钟；和0115等度洗脱。0116PH为48时胰岛素/脱酰胺胰岛素选择性为0117S1，在RP上0119。

37、S1，在CIEXRP材料上0120S1，在AIEXRP材料上0121从图5可知，PH为48时，NR3/C8材料显示比纯C8材料显示增强得多的选择性。在更高PH下，选择性增强趋势相反。因此，排斥材料比吸引材料即SO3/C8好得多。0122实施例50123本实施例描述了选择的合成肽1的纯化，其PI为1112。流动相的PH在肽PI以下，即肽是带正电的。0124流动相是PH48，500MM醋酸盐缓冲液乙腈。0125起始浓度和梯度信息见表20126表20127说明书CN104220158A119/10页120128结果从图6可知，通过使用AIEXRP材料A10，在固定纯度为94时，可将产率提高25。01。

38、29实施例60130本实施例描述了选择的合成肽2的纯化，其PI为910。流动相的PH在肽PI以下，即肽是带正电的。0131流动相是PH48，120MM醋酸钠缓冲液乙腈。0132起始浓度和梯度信息见表3。0133表301340135结果从图7可知，通过使用AIEXRP材料A10，在固定纯度为94时，可将产率提高74。0136实施例70137本实施例描述了选择的合成肽3的纯化，其PI为4555。流动相的PH在肽PI以上，即肽是带负电的。0138流动相是PH65，100MM醋酸铵缓冲液乙腈。0139起始浓度和梯度信息见表4。0140表40141说明书CN104220158A1210/10页13014。

39、2结果从图8可知，在这种情况下因为API的负电荷，SO3/C8材料显示更好的性能。此外，这里也是排斥材料更好。通过使用CIEXRP材料C10，在固定纯度为87时，可将产率提高59。0143结论0144所有的实验表明排斥掺杂的材料具有改善的性能。这与为了改善性能必须形成额外的吸附位置的普通观点是相反的。本发明表明通过形成排斥位置改善材料的性能。0145虽然这里显示和描述了本发明的目前优选的实施方式，但应清楚地理解本发明不限于这些，还可在下述权利要求的范围之内以其它方式多方面地实施和实践本发明。说明书CN104220158A131/10页14图1说明书附图CN104220158A142/10页15图2说明书附图CN104220158A153/10页16图3A说明书附图CN104220158A164/10页17图3B说明书附图CN104220158A175/10页18图3C说明书附图CN104220158A186/10页19图4A说明书附图CN104220158A197/10页20图4B说明书附图CN104220158A208/10页21图5说明书附图CN104220158A219/10页22图6图7说明书附图CN104220158A2210/10页23图8说明书附图CN104220158A23。