副鸡禽杆菌抗体的检测方法和试剂盒.pdf

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1、10申请公布号CN102007414A43申请公布日20110406CN102007414ACN102007414A21申请号200980113170822申请日20090206200802958920080208JPG01N33/569200601C07K14/195200601C07K16/1220060171申请人一般财团法人化学及血清疗法研究所地址日本熊本县72发明人牛岛稔大今村孝坂元隆一坂口正士74专利代理机构中国专利代理香港有限公司72001代理人吴娟郭文洁54发明名称副鸡禽杆菌抗体的检测方法和试剂盒57摘要本发明提供副鸡禽杆菌抗体的检测方法和试剂盒。具体而言，本发明提供副鸡禽杆菌。

2、抗体的检测方法，该方法包含通过ELISA法检测由副鸡禽杆菌A型菌或/和C型菌的菌体外膜蛋白诱导的抗体，其中，所述ELISA法是以含有该外膜蛋白的非同源区域或其一部分的氨基酸序列的肽作为抗原；以及该方法中使用的检测试剂盒。30优先权数据85PCT申请进入国家阶段日2010100886PCT申请的申请数据PCT/JP2009/0520912009020687PCT申请的公布数据WO2009/099204JA2009081351INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书13页序列表10页附图4页CN102007427A1/2页21副鸡禽杆菌抗体的检测方法，其特征在。

3、于，该方法包含使下述的肽A或B的至少一种抗原与检体反应的抗体测定方法肽A为SEQIDNO1所示的氨基酸序列的一部分，含有6个氨基酸以上的肽链且不含有SEQIDNO1所示的氨基酸序列第243273号氨基酸序列的肽；肽B为SEQIDNO2所示的氨基酸序列的一部分，含有6个氨基酸以上的肽链且不含有SEQIDNO2所示的氨基酸序列第3868号氨基酸序列的肽。2权利要求1所述的检测方法，其特征在于肽A或B是10个氨基酸以上的肽链。3权利要求1所述的检测方法，其特征在于肽A或B是20个氨基酸以上的肽链。4权利要求1所述的检测方法，其特征在于，肽A或B是下述的肽链肽A为SEQIDNO1所示的氨基酸序列的一部。

4、分，含有SEQIDNO1所示的氨基酸序列第8236号氨基酸序列且不含有SEQIDNO1所示的氨基酸序列第243273号氨基酸序列的肽；肽B为SEQIDNO2所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQIDNO2所示的氨基酸序列第69452号氨基酸序列且不含有SEQIDNO2所示的氨基酸序列第3868号氨基酸序列的肽。5权利要求1所述的检测方法，其特征在于，肽A或B是下述的肽链肽A为含有SEQIDNO1所示的氨基酸序列第8236号氨基酸序列的肽；肽B为含有SEQIDNO2所示的氨基酸序列第69452号氨基酸序列的肽。6权利要求4所述的检测方法，其特征在于，肽A是下述的肽链肽A为SEQIDNO1所示的氨基。

5、酸序列的一部分，含有SEQIDNO1所示的氨基酸序列第274445号氨基酸序列且不含有SEQIDNO1所示的氨基酸序列第243273号氨基酸序列的肽。7权利要求5所述的检测方法，其特征在于，肽A是下述的肽链肽A为含有SEQIDNO1所示的氨基酸序列第274445号氨基酸序列的肽。8权利要求17中任一项所述的检测方法，其特征在于肽A或B是具有1或多个氨基酸残基缺失、添加、或取代的氨基酸序列的肽。9权利要求18中任一项所述的检测方法，其特征在于抗体测定方法选自ELISA法、蛋白质印迹法和斑点杂交法。10权利要求19中任一项所述的检测方法，其特征在于检体是感染了副鸡禽杆菌的鸡血清或给予了副鸡禽杆菌疫。

6、苗的鸡血清。11副鸡禽杆菌抗体测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒使用下述肽A或B的至少一种权利要求书CN102007414ACN102007427A2/2页3作为抗原肽A为SEQIDNO1所示的氨基酸序列的一部分，含有6个氨基酸以上的肽链且不含有SEQIDNO1所示的氨基酸序列第243273号氨基酸序列的肽；肽B为SEQIDNO2所示的氨基酸序列的一部分、含有6个氨基酸以上的肽链且不含有SEQIDNO2所示的氨基酸序列第3868号氨基酸序列的肽。12权利要求11所述的抗体测定试剂盒，其特征在于，肽A或B是10个氨基酸以上的肽链。13权利要求11所述的抗体测定试剂盒，其特征在于肽A或B是20个氨基。

7、酸以上的肽链。14权利要求11所述的抗体测定试剂盒，其特征在于，肽A或B是下述的肽链肽A为SEQIDNO1所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQIDNO1所示的氨基酸序列第8236号氨基酸序列且不含有SEQIDNO1所示的氨基酸序列第243273号氨基酸序列的肽；肽B为SEQIDNO2所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQIDNO2所示的氨基酸序列第69452号氨基酸序列且不含有SEQIDNO2所示的氨基酸序列第3868号氨基酸序列的肽。15权利要求11所述的抗体测定试剂盒，其特征在于，肽A或B是下述的肽链肽A为含有SEQIDNO1所示的氨基酸序列第8236号氨基酸序列的肽；肽B为含有SEQIDN。

8、O2所示的氨基酸序列第69452号氨基酸序列的肽。16权利要求14所述的抗体测定试剂盒，其特征在于，肽A是下述的肽链肽A为SEQIDNO1所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQIDNO1所示的氨基酸序列第274445号氨基酸序列且不含有SEQIDNO1所示的氨基酸序列第243273号氨基酸序列的肽。17权利要求15所述的抗体测定试剂盒，其特征在于，肽A是下述的肽链肽A为含有SEQIDNO1所示的氨基酸序列第274445号氨基酸序列的肽。18权利要求1117中任一项所述的抗体测定试剂盒，其特征在于肽A或B是具有1或多个氨基酸残基缺失、添加、或取代的氨基酸序列的肽。19权利要求1118中任一项所述的。

9、抗体测定试剂盒，其特征在于抗体测定方法选自ELISA法、蛋白质印迹法和斑点杂交法。20权利要求1119中任一项所述的抗体测定试剂盒，其特征在于检体是感染了副鸡禽杆菌的鸡血清或给予了副鸡禽杆菌疫苗的鸡血清。权利要求书CN102007414ACN102007427A1/13页4副鸡禽杆菌抗体的检测方法和试剂盒技术领域0001本发明涉及副鸡禽杆菌抗体的检测方法和检测试剂盒。具体来说，本发明涉及副鸡禽杆菌抗体的检测方法，该方法包含通过ELISA法检测由副鸡禽杆菌AVIBACTERIUMPARAGALLINARUM，以下也称为APG。旧名为副鸡嗜血杆菌HEMPHILUSPARAGALLINARUMA型菌。

10、和/或C型菌的菌体外膜蛋白以下也称为“HMTP210多肽”诱导的抗体，其中，所述ELISA法以含有该外膜蛋白的非同源区域或其一部分氨基酸序列的肽作为固相抗原；以及该方法中使用的检测试剂盒。根据构成该肽的氨基酸残基数，肽以二肽、三肽、寡肽、多肽等名称称呼，本发明中不对它们进行区别，均定义为肽。背景技术0002由于感染APG而发病的鸡传染性鼻炎是鸡的重要的呼吸系统疾病。鸡传染性鼻炎发病鸡的主要症状是鼻液流出、呈现颜面肿胀或者流泪。鸡传染性鼻炎导致鸡的生长率降低、产蛋开始的延迟、产蛋率降低或产蛋停止，其经济损失较大。0003PAGE等人将APG分类为A、B和C型三种型非专利文献1，SAWATA等人将。

11、其分类为1型和2型两种型非专利文献2。之后，KUME等人报道PAGE等人的A型相当于SAWATA等人的1型，PAGE等人的C型相当于SAWATA等人的2型非专利文献3和4。目前，APG的A型1型菌以下也称为“APGA型菌”和C型2型菌以下也称为“APGC型菌”成为鸡传染性鼻炎的主要病因菌。0004关于鸡传染性鼻炎的预防，以往广泛使用将APGA型菌或APGC型菌的菌体用福尔马林、硫柳汞THIMEROSAL等灭活得到的疫苗。但是，在给予这些疫苗时，存在在接种鸡的局部形成坏死病灶非专利文献5等的副作用的问题，人们强烈期望开发安全性高的疫苗。0005在上述状况下，人们开发了以下的疫苗等组分疫苗COMP。

12、ONENTVACCINE，只从菌体或培养上清中取出保护性抗原PROTECTIVEANTIGEN，感染防御抗原即有效成分COMPONENT，组分，制成疫苗；重组疫苗，通过基因重组技术克隆编码保护性抗原的基因，使该基因在细菌、酵母、动物细胞、植物细胞、昆虫细胞等中表达，纯化大量表达的表达产物，将其作为疫苗；或者是载体疫苗，将编码保护性抗原的基因插入到病毒载体等中。0006例如德永等人从APGA型菌的培养液中诱导生成红细胞凝集抑制抗体HI抗体，成功地纯化了可防御APGA型菌引起的鸡传染性鼻炎的、来自该A型菌的分子量约130KDA的多肽专利文献1。并发现，克隆编码该130KDA多肽的DNA片段并在大肠。

13、杆菌中表达的该重组蛋白可以防御副鸡禽杆菌A型菌引起的鸡传染性鼻炎的感染。进一步以编码130KDA多肽的DNA片段作为探针，鉴定了HMTP210基因，该基因编码含有2,042个氨基酸的A型HMTP210多肽具有红细胞凝集活性的菌体外膜蛋白。还同样地从C型菌中克隆了与该DNA片段杂交的DNA片段，获得了来自C型菌的C型HMTP210基因专利文献2。还有报道称，将A型菌和C型菌的HMTP210基因的开放阅读框ORF，OPENREADINGFRAME的核苷酸序列进行比较，两者的同源性占全体的80，5一侧的约34KBP的区域以下称说明书CN102007414ACN102007427A2/13页5为区域1。

14、和3一侧的约12KBP的区域以下称为区域3具有非常高的同源性，由两个区域夹持的约15KBP的区域以下称为区域2则同源性低专利文献2。0007据野吕等人的报道，德永等人发现的HMTP210基因作为型特异性的疫苗的靶区域是很重要的。野吕等人还报道通过将编码APGA型HMTP210多肽的HMTP210基因的一部分即由4,801BP5,157BP的DNA片段所编码的肽免疫鸡，则该肽具有诱导对APGA型菌的HI抗体以及疫苗的效果专利文献3。另外，野吕等人在第143回日本兽医学会2007年4月35日举办，日本上报道通过将编码C型HMTP210多肽的HMTP210基因的一部分即由55KBP的DNA片段HPC。

15、55所编码的肽免疫鸡，同样具有诱导对APGC型菌的HI抗体和疫苗的效果。0008感染了APG的鸡有急性的过程，并且在发病后也难以诱导抗体生成，因此以往并未进行鸡传染性鼻炎的血清诊断。而给予了疫苗的鸡中，诱导出存在于APG菌体表面的对红细胞凝集素HEMAGGLUTININ，以下称为“HA”的抗体，在体外评价疫苗效果时，可进行利用抗HA抗体的红细胞凝集抑制试验以下也称为“HI试验”。HI试验中使用了新鲜鸡红细胞或戊二醛固定的鸡红细胞，但也被认为有以下的缺点1在APGA型菌的疫苗效果的评价中必须采用新鲜的鸡红细胞，因此需要确保供血用鸡在与病原体隔离的状态下的饲养管理、采血和血液处理等烦杂且较为费事；。

16、2受到鸡红细胞批次的影响，并且抗体效价的判定是根据测定者主观进行判定，难以获得稳定的成绩等。0009另一方面，SUN等人报道了利用型特异性单克隆抗体的封闭ELISABELISA，以此作为代替HI试验的血清诊断法非专利文献6。BELISA是以将A型菌或C型菌体超声波破碎所得的破碎物作为抗原，使用与各血清型反应的单克隆抗体，竞争性检测血清中的抗体的ELISA法。本方法与HI试验相比，灵敏度高，具有可以对应多检体优点。但是必须进行血清的添加、单克隆抗体的添加、抗小鼠IGGHRP标记抗体的添加和显色底物的添加这四个步骤，与常规的ELISA方式比较多一个步骤，操作烦杂。另外，为了采用本方法，还必须确保型。

17、特异性单克隆抗体。在制备试剂盒方面，除抗原固相化板、参照血清之外还必须制备单克隆抗体并附在试剂盒中。并且，该BELISA是在各血清中检测仅与一个单克隆抗体所识别的抗原表位相对的抗体的系统。在检测与一个表位相对的抗体的系统中，由于菌体的变异而失去该表位时，则无法检测菌体感染或疫苗接种抗体的危险性更高。0010专利文献1日本特开平10849690011专利文献2WO98/123310012专利文献3日本特开20052184140013非专利文献1AMJVETRES，238595，19620014非专利文献2JPNJVETSCI，40645652，19780015非专利文献3AMJVETRES，41。

18、757760，19800016非专利文献4AMJVETRES，4119011904，19800017非专利文献5AVIANDIS，15109117，19710018非专利文献6INTASSBIOIABS35317320，2007发明内容0019发明所要解决的课题说明书CN102007414ACN102007427A3/13页60020本发明的课题在于提供可分别区别对APG的A型菌和C型菌的抗体的抗体检测方法。具体来说，提供一种抗体检测方法，其特征在于该方法使用可分别区别对APG的A型菌和C型菌的抗体的重组抗原肽。更具体地说，提供一种抗体检测方法，其特征在于使用含有在APG的A型菌和C型菌的外膜。

19、蛋白之间同源性低的区域内的氨基酸序列的重组抗原肽。0021解决课题的方法0022本发明人等为了实现上述目的进行了深入的研究，结果发现在作为疫苗抗原很重要的HMTP210基因所编码的P210多肽的偏离区域2的氨基酸序列的位置，含有在APGA型菌和APGC型菌之间同源的氨基酸序列SEQIDNO1所述的APGA型菌第243273号氨基酸序列和SEQIDNO2所述的APGC型菌第3868号氨基酸序列的31个氨基酸中，29个氨基酸一致，参照图3，并且发现该氨基酸序列形成表位。并且本发明人等还发现在由德永等人定义的区域2的C末端区域的一部分含有在APGA型菌和APGC型菌之间同源性高的氨基酸序列。因此，在。

20、APGA型菌和APGC型菌的各HMTP210多肽中，制备不含有上述两个同源的氨基酸序列的肽，使用所得肽，通过在微量板上固相化的ELISA法进行抗体测定。结果确认可分别特异性识别由来自APGA型菌的疫苗和来自APGC型菌的疫苗所诱导的抗体，从而完成了本发明。因此，本申请发明如下所述。00231副鸡禽杆菌抗体的检测方法，其特征在于，该方法包含使下述肽A或B的至少一种抗原与检体反应的抗体测定方法0024肽A0025为SEQIDNO1所示的氨基酸序列的一部分，含有6个氨基酸以上的肽链且不含有SEQIDNO1所示的氨基酸序列第243273号氨基酸序列的肽；0026肽B0027为SEQIDNO2所示的氨基。

21、酸序列的一部分，含有6个氨基酸以上的肽链且不含有SEQIDNO2所示的氨基酸序列第3868号氨基酸序列的肽。00282上述1所述的检测方法，其特征在于肽A或B是10个氨基酸以上的肽链。00293上述1所述的检测方法，其特征在于肽A或B是20个氨基酸以上的肽链。00304上述1所述的检测方法，其特征在于，肽A或B是下述的肽链0031肽A0032为SEQIDNO1所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQIDNO1所示的氨基酸序列第8236号氨基酸序列且不含有SEQIDNO1所示的氨基酸序列第243273号氨基酸序列的肽；0033肽B0034为SEQIDNO2所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQIDNO。

22、2所示的氨基酸序列第69452号氨基酸序列且不含有SEQIDNO2所示的氨基酸序列第3868号氨基酸序列的肽。00355上述1所述的检测方法，其特征在于，肽A或B是下述的肽链0036肽A0037为含有SEQIDNO1所示的氨基酸序列第8236号氨基酸序列的肽；0038肽B说明书CN102007414ACN102007427A4/13页70039为含有SEQIDNO2所示的氨基酸序列第69452号氨基酸序列的肽。00406上述4所述的检测方法，其特征在于，肽A是下述的肽链0041肽A0042为SEQIDNO1所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQIDNO1所示的氨基酸序列第274445号氨基酸序列。

23、且不含有SEQIDNO1所示的氨基酸序列第243273号氨基酸序列的肽。00437上述5所述的检测方法，其特征在于，肽A是下述的肽链0044肽A0045为含有SEQIDNO1所示的氨基酸序列第274445号氨基酸序列的肽。00468上述17中任一项所述的检测方法，其特征在于肽A或B是具有1或多个氨基酸残基缺失、添加、或取代的氨基酸序列的肽。00479上述18中任一项所述的检测方法，其特征在于抗体测定方法选自ELISA法、蛋白质印迹法和斑点杂交法。004810上述19中任一项所述的检测方法，其特征在于检体是感染了副鸡禽杆菌的鸡血清或给予了副鸡禽杆菌疫苗的鸡血清。004911副鸡禽杆菌抗体测定试剂。

24、盒，其特征在于，该试剂盒使用下述肽A或B的至少一种作为抗原0050肽A0051为SEQIDNO1所示的氨基酸序列的一部分，含有6个氨基酸以上的肽链且不含有SEQIDNO1所示的氨基酸序列第243273号氨基酸序列的肽；0052肽B0053为SEQIDNO2所示的氨基酸序列的一部分、含有6个氨基酸以上的肽链且不含有SEQIDNO2所示的氨基酸序列第3868号氨基酸序列的肽。005412上述11所述的抗体测定试剂盒，其特征在于，肽A或B是10个氨基酸以上的肽链。005513上述11所述的抗体测定试剂盒，其特征在于肽A或B是20个氨基酸以上的肽链。005614上述11所述的抗体测定试剂盒，其特征在于。

25、，肽A或B是下述的肽链0057肽A0058为SEQIDNO1所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQIDNO1所示的氨基酸序列第8236号氨基酸序列且不含有SEQIDNO1所示的氨基酸序列第243273号氨基酸序列的肽；0059肽B0060为SEQIDNO2所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQIDNO2所示的氨基酸序列第69452号氨基酸序列且不含有SEQIDNO2所示的氨基酸序列第3868号氨基酸序列的肽。006115上述11所述的抗体测定试剂盒，其特征在于，肽A或B是下述的肽链0062肽A0063为含有SEQIDNO1所示的氨基酸序列第8236号氨基酸序列的肽；说明书CN102007414AC。

26、N102007427A5/13页80064肽B0065为含有SEQIDNO2所示的氨基酸序列第69452号氨基酸序列的肽。006616上述14所述的抗体测定试剂盒，其特征在于，肽A是下述的肽链0067肽A0068为SEQIDNO1所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQIDNO1所示的氨基酸序列第274445号氨基酸序列且不含有SEQIDNO1所示的氨基酸序列第243273号氨基酸序列的肽。006917上述15所述的抗体测定试剂盒，其特征在于，肽A是下述的肽链0070肽A0071为含有SEQIDNO1所示的氨基酸序列第274445号氨基酸序列的肽。007218上述1117中任一项所述的抗体测定试剂。

27、盒，其特征在于肽A或B是具有1或多个氨基酸残基缺失、添加、或取代的氨基酸序列的肽。007319上述1118中任一项所述的抗体测定试剂盒，其特征在于抗体测定方法选自ELISA法、蛋白质印迹法和斑点杂交法。007420上述1119中任一项所述的抗体测定试剂盒，其特征在于检体是感染了副鸡禽杆菌的鸡血清或给予了副鸡禽杆菌疫苗的鸡血清。0075发明效果0076根据本发明，可以提供副鸡禽杆菌抗体的检测方法和试剂盒。本发明中使用的来自APGA型菌和APGC型菌的肽互相不含有同源的氨基酸序列，因此与由来自APGA型菌的疫苗和APGC型菌的疫苗所诱导的抗体分别特异性结合。因此，本发明的检测方法和试剂盒不仅是在单。

28、独将各疫苗给予鸡时，在给予将两者混合的疫苗时也可以分别识别并测定存在于鸡血清中的各个菌体的抗体效价。0077另外，根据本发明，使用纯化重组抗原的结果，与使用APG菌体破碎物的以往的技术相比，可以使更高浓度的抗原固相化，因此可以构建抗体的检测灵敏度更高的抗体测定系统。另外，本申请发明的抗体的检测方法对于抗原肽具有识别APG的血清型的能力，因此与使用型特异性单克隆抗体的BELISA相比更为简便，且从菌体的抗原变异的角度考虑，可以更确实地检测出对APG的抗体。0078并且，通过本发明的检测方法，不仅可以识别给予疫苗后的鸡血清，也可以识别APG感染鸡血清中的抗体。附图说明0079图1是表示HMTP21。

29、0多肽及其片段以及各片段的位置关系的图。涂黑部分表示区域2内的同源序列，网格部分表示区域2的C末端同源区域。图中所述的氨基酸SEQIDNO相当于专利文献2的序列表SEQIDNO1A型菌和序列表SEQIDNO5C型菌中公开的氨基酸SEQIDNO。0080图2是表示由大肠杆菌纯化的各多肽的SDSPAGE结果的图。M标志物，泳道1PA6B1B，泳道2PC6B1B0081图3是表示由HMTP210基因编码的氨基酸序列的非同源区域中同源的氨基酸序列及其位置的图。图中所述的氨基酸SEQIDNO相当于专利文献2序列表SEQIDNO1A说明书CN102007414ACN102007427A6/13页9型菌和序。

30、列表SEQIDNO5C型菌中公开的氨基酸SEQIDNO。0082图4是观察以A型菌攻击前血清的多肽PA6B2作为抗原的ELISA值与A型菌攻击后的防御发病的相关性的图。图中的“”表示未发病的鸡，“”表示发病的鸡。0083图5是观察以C型菌攻击前血清的多肽PC6B1B作为抗原的ELISA值与C型菌攻击后的防御发病的相关性的图。图中的“”表示未发病的鸡，“”表示发病的鸡。具体实施方式0084本申请发明的特征在于通过以下述的肽作为抗原的抗体测定方法的副鸡禽杆菌抗体的检测方法和试剂盒，所述肽是将由来自APG的HMTP210基因所编码的氨基酸序列中的少许存在于非同源区域中的APGA型菌和APGC型菌之间。

31、的同源的氨基酸序列除去而得到的肽。0085本申请发明的副鸡禽杆菌抗体的检测方法中，使用由来自APGA型菌和/或APGC型菌的HMTP210基因所编码的氨基酸序列的非同源区域或其一部分作为抗原。这里，非同源区域定义为从夹持在5一侧的约34KBP的DNA区域所编码的氨基酸序列区域1和3一侧的约12KBP的DNA区域所编码的氨基酸序列区域3的两个区域的、约15KBP的DNA区域区域2所编码的氨基酸序列中除去C末端一侧的同源序列而得到的约13KBP的区域SEQIDNO1A型菌和SEQIDNO2C型菌参照图1。以下，将编码该非同源区域的氨基酸序列的基因称为“APG13基因”，在对A型菌和C型菌的两者进行。

32、区别时，分别称为“APGA13基因”、“APGC13基因”。0086从APG感染鸡中分离的3株A型菌221株、O53株和W株的相当于HMTP210基因的非同源区域的核苷酸序列在O53株和W株之间完全一致，在两株和221株之间仅有一个碱基发生变异。而3株C型菌5347株、MODEST株和NK1株之间的同源区域的核苷酸序列只是MODEST株和NK1株相对于5347株有3个碱基1个氨基酸缺失。因此，可以说同一血清型之间的非同源区域高度保守，本申请发明中，可以使用同一血清型内的任何菌株。0087APGA13基因以及含有该基因的DNA片段可通过以下方法获得。APG的增殖可以使用适当含有聚胨、葡萄糖、酪蛋。

33、白氨基酸、谷氨酸钠、酵母提取物、氯化钠、鸡汤、NAD、鸡血清等的培养基。本申请发明中，为了进行小、中容量的菌体增殖，使用含鸡血清的鸡肉汤培养基1000ML培养基中含有5G聚胨S、1G酪蛋白氨基酸、5G氯化钠、5GL谷氨酸钠、1G葡萄糖、10G酵母提取物、175ML鸡汤、25ML鸡血清、0025烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD。培养条件通常在温度37、时间1624小时的范围内设定，这可根据使用目的、培养形态、接种的菌量、培养基规模等适当调节。0088培养液中的菌体通过离心8,000RPM，20分钟回收在沉淀物中。HMTP210基因可按照SAMBROOK等人叙述的常规的基因重组技术MOLECULARCL。

34、ONING，ALABORATORYMANUALSECONDEDITIONCOLDSPRINGHARBORLABORATORYPRESS，NY，1989，以由菌体提取的总RNA、MRNA或基因组DNA作为起始材料来制备。实际中可使用市售的试剂盒。例如RNA的提取可以使用TRIZOL试剂公司、ISOGEN一公司、STRATAPREPTOTALRNAPURIFICATIONKITSTRATAPREP总RNA纯化试剂盒东洋纺等的试剂，染色体DNA的提取可以使用一试剂盒三光纯药、ISOPLANT和说明书CN102007414ACN102007427A7/13页10光纯药，MRNA的纯化可以使用MRNAP。

35、URIFICATIONKITMRNA纯化试剂盒公司、POLYAQUICKMRNAISOLATIONKITPOLYAQUICKMRNA分离试剂盒东洋纺、MRNASEPARATORKITMRNA分离试剂盒公司等的试剂盒，转换为CDNA可以使用SUPERSCRIPTPLASMIDSYSTEMFORCDNASYNTHESISANDPLASMIDCLONING公司、CDNASYNTHESISKITCDNA合成试剂盒宝酒造、SMARTPCRCDNASYNTHESISLIBRARYCONSTRUCTIONKITSSMARTPCRCDNA合成和文库构建试剂盒公司、DIRECTIONARYCDNA文库构建系统公。

36、司、GENEAMPPCRGOLD公司等。0089更具体来说，使用一试剂盒三光纯药等，从通过离心回收的菌体中提取的染色体DNA，将其用适当的限制酶优选使用ECORI切断，插入到市售的克隆载体中例如，GT11；一NEB公司，制备DNA文库。以所得DNA片段为模板，使用LATAQ株式会社，按照所附的流程，通过PCR法扩增各种大小的DNA片段。PCR中使用的引物可根据德永等人公开的来自APGA型菌和APGC型菌的HMTP210基因的核苷酸序列专利文献1设计。PCR用引物如果委托DNA合成受托机构例如，公司等，则可以容易地获得。此时，在上游侧引物的5末端和下游侧引物的5可以附加适当的限制酶切位点的核苷酸。

37、序列。PCR扩增产物克隆到基因克隆载体、PCRXLTOPO株式会社中，可获得插入了各种DNA片段的质粒PCRDNT。所得DNA片段的核苷酸序列先克隆到PBLUESCRIPTIISK一公司或PCR21TOPO公司中，然后由DNA测序仪ABIPRISM377公司确定。0090如后所述，只要不会导致灵敏度降低或非特异性反应的增大，一部分中导入了氨基酸变异的肽也可以作为本申请发明的抗体测定方法中的抗原使用。在肽的特定的氨基酸中导入变异时，通常是采用向编码该肽的DNA片段的核苷酸序列中导入变异的位点定向诱变法SITEDIRECTEDMUTAGENESIS。实际中可以使用应用了该技术的TAKARA公司的位。

38、点定向诱变系统SITEDIRECTEDMUTAGENESISSYSTEMMUTANSUPEREXPRESSKM、MUTANEXPRESSKM、MUTANK等、STRATAGENE公司的QUICKCHANGEMULTI位点定向诱变试剂盒、QUICKCHANGEXL位点定向诱变试剂盒、INVITROGEN公司的GENETAILOR位点定向诱变系统等市售的试剂盒，按照所附的流程来进行。0091在获得编码在APGA型菌和APGC型菌之间不含有同源氨基酸序列的各种肽的氨基酸序列的DNA片段时，可以从非同源区域分别为SEQIDNO3所示的核苷酸序列A型菌和SEQIDNO4所示的核苷酸序列C型菌中设计引物，。

39、使其不含有上述同源序列，以上述APG13基因以及含有该基因的DNA片段作为模板，通过常规的PCR法进行。如果是较短的氨基酸序列，则也可以通过人工合成制备该DNA片段。本申请发明中，表1显示了制备的DNA片段和引物。0092将这样得到的DNA片段插入适当的表达载体中，将其导入宿主，由此可以进行各DNA片段的表达。表达载体例如可以使用PQE30公司或PET22B公司或株式会社制备等，也可以适当选择。外源蛋白或肽的表达常用细菌、酵母、动物细胞、植物细胞和昆虫细胞等，可以结合使用目的进行选择。在转化宿主细胞时可以利用公知的方法。例如可以利用磷酸钙法、DEAE葡聚糖法、使用脂转染系统的脂质体说明书CN1。

40、02007414ACN102007427A8/13页11的方法、原生质体的聚乙二醇融合法、电穿孔法等，可根据所使用的宿主细胞选择适当的方法。在表达本申请发明的各DNA片段时，可以使用可大量表达的大肠杆菌。关于大肠杆菌表达用，已经开发并销售具有TRP启动子、T7启动子、CSPA启动子等的各种表达载体，因此可以从中适当选择使用。根据表达载体，可选择适当的大肠杆菌、例如BL21、HMS174、DH5、HB101、JM109等作为宿主。大肠杆菌的转化可以使用市售的感受态细胞，按照所附的方法进行。这样，可以获得生产目标多肽的重组大肠杆菌。在大肠杆菌的培养中所使用的培养基例如，LB、SOC、SOB等、转化。

41、体的选择所使用的试剂例如氨苄青霉素等以及诱导表达所使用的试剂例如，吲哚乙酸IAA、异丙基硫代D半乳糖苷IPTG通常可以使用市售商品。培养基的PH在适合大肠杆菌增殖的范围PH68内使用。0093表达目标肽目标产物的重组大肠杆菌的筛选如下进行。在表达诱导剂本发明中使用的表达系统中使用IPTG存在下、通过离心10,000RPM，5分钟回收培养、增殖的菌体，向其中加入一定量的蒸馏水，使其悬浮，然后通过超声波处理或者弗氏压碎器FRENCHPRESS、MANTONGOLIN等的匀浆器破碎菌体，通过离心15,000RPM，15分钟分离、回收在沉淀或上清中。蒸馏水中可以添加适当的表面活性剂例如，TRITONX。

42、100、螯合剂例如，EDTA、溶菌酶等。对一定量的回收到上清和沉淀中的表达产物进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，用考马斯亮蓝染色，然后确认分子大小以及由染色图像确认目标产物的表达。关于目标产物的确认或检测除基于上述的分子大小的方法之外，还可以采取基于ELISA法、蛋白质印迹法、斑点杂交法等抗原抗体反应的方法。这均是检测在任何大肠杆菌中表达的外源蛋白或多肽时的常规方法，可以根据目标适当选择。0094由重组大肠杆菌纯化目标产物时，通常采用将蛋白质化学中使用的纯化方法、例如离心、盐析法、超滤法、等电点沉淀法、电泳法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法、亲和层析法、疏水层析法、羟基磷灰石法等方法组合的方法。所。

43、得蛋白质或多肽的量可使用BCA蛋白质测定试剂盒PIERCEBIOTECHNOLOGY，INC、蛋白质测定试剂盒BIORAD，INC等蛋白测定试剂进行测定。0095为了使目标物的纯化容易进行，还可以以与其它多肽或肽融合的形式表达。表达上述融合蛋白的载体可以例举可附加寡组氨酸的HISTAG表达系统公司、可表达附加了FLAG标志的融合蛋白的系统公司、可制备与谷胱甘肽S转移酶GST的融合蛋白的GST融合蛋白质纯化系统公司、MAGNEHIS蛋白质纯化系统公司等。例如如在本发明的实施例中进行的，以与寡组胺酸的融合蛋白的形式表达后，使用镍亲和柱GE公司可以特异性纯化目标多肽。0096如此得到的不含有APGA。

44、型菌和APGC型菌之间的同源氨基酸序列的区域的各种肽可用于鸡传染性鼻炎疫苗抗体的检测或用于进行APG感染鸡的血清学诊断的抗体测定。具体来说可以适用ELISA法、蛋白质印迹法、斑点杂交法等的抗体测定方法。需要应对多个检体时，优选采用使肽固相化的微量板法的ELISA法。0097微量板中固相化的肽可以使用含有由APG13基因所编码的氨基酸序列中的非同源区域的肽及其一部分。通常由610个左右的氨基酸可以形成被抗体识别的表位在线上HTTP/WWWGENOSYSJP/PRODUCTS/SPOTS/SPOTS_FAQHTML公开了被抗体识别的说明书CN102007414ACN102007427A9/13页1。

45、2表位有36个氨基酸即足够，因此本申请发明中可以使用非同源区域的一部分、含有连续的6个氨基酸以上的氨基酸序列的肽。为了提高特异性，优选由含有非同源区域中的连续的10个氨基酸以上的肽，进一步优选由含有连续的20个氨基酸以上的肽形成表位。0098最优选使用由A6B2编码的多肽PA6B2、由C6B1B编码的多肽PC6B1B、以及由A7B1B编码的多肽PA7B1B、以及含有由包含它们的APG13基因编码的氨基酸序列中的非同源区域的肽的一部分。只要不会导致在抗体检测方面出现障碍的灵敏度降低或非特异性反应增大，也可以使用这些肽的一部分中导入了氨基酸变异的变异肽。这些肽可以根据目的将两种以上的肽分别组合使用。

46、。例如确定鸡传染性鼻炎的病因菌时，优选单独使用各肽，或者分别独立使用将来自APGA型菌的肽之间或者来自APGC型菌的肽之间混合得到的混合物。如果只是要调查鸡传染性鼻炎感染的流行病学或鸡传染性鼻炎疫苗的效果，也可以进一步将来自APGA型菌和APGC型菌的混合物混合使用。0099给予疫苗后的免疫血清通常可以以13次、24周的间隔将上述的肽与佐剂的混合物给予适当的动物皮下、皮内、腹腔内等，然后将采集的血液进行离心14,000RPM，5分钟获得。佐剂可以使用弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、氢氧化铝例如，IMJECTALUM一公司等。0100副鸡禽杆菌感染动物的血清也可以同样地将血液离心获得。0101更具。

47、体来说，可以进行各种方法的ELISA，可以是任何方法。例如首先将检体免疫血清或APG感染血清添加到将肽固相化的微量板中，清洗后添加标记的抗鸡抗体作为二次抗体。还可以通过与抗肽特异性抗体组合，通过竞争法的ELISA来实施，该竞争法的ELISA是将检体和标记抗肽固相抗原抗体同时或分别添加到使肽固相化的微量板中，或者，抗肽抗体未标记时，添加对抗肽抗体的标记二次抗体。0102肽在微量板上的固相化通常通过以抗原量110G/ML、在室温25左右下放置30分钟2小时，或在低温4左右下放置1224小时来进行。用于抑制非特异性反应的封闭试剂例如有一雪印公司、ELISA用封闭试剂公司、牛血清白蛋白溶液、脱脂乳溶液。

48、等，可以适当选择使用。各反应后的清洗可使用PBS、TBS或其中含有POLYSORBATETWEEN20或防腐剂叠氮化钠等的试剂，反应终止可以使用23MOL的硫酸进行。作为二次抗体，用HRP、荧光标记、RI、生物素化标记的抗鸡IGG单克隆抗体，例如抗鸡IGGHRP公司等市场有销售，因此可以使用上述抗体。例如HRP的底物有OPD邻苯二胺和TMBZ3，3，5，5四甲基联苯胺，分别以492NM、450NM测定吸光度。0103首先，可以在微量板上固定肽的抗体，采用使上述肽与该抗体结合的双抗体夹层的ELISA法。这种情况下，肽的抗体可以使用多克隆抗体和单克隆抗体的任意一种。多克隆抗体可通过与上述免疫血清同样的方法获得，免疫所使用的动物例如有鸡、大鼠、豚鼠、仓鼠、狗、猴等。单克隆抗体可以是从用APG菌体或多肽免疫的动物中采集脾细胞或淋巴细胞等抗体生成细胞，按照MILSTEIN等人的方法METHODENZYMOL，73，346，1981，与骨髓瘤细胞株等融合，通过制备生成本申请发明中使用的肽的抗体的杂交瘤来获得。还可以通过利用噬菌体展示技术的抗体制备技术PHAGEDISPLAYOFPEPTIDESANDPROTEINSALABORATORYMANUALEDITEDBYBRIANKKAY等人、ANTIBODYENGINEERIN。