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一种多顺反子表达载体构建方法，利用商品化T-载体作为中间载体，设计两对引物，在引物中引入NheI和SpeI酶切位点及核糖体结合位点(RBS)，将扩增产物与T-载体相连，所得重组T-载体用NdeI+NheI、NdeI+SpeI双酶切，得到的DNA片段用DNA连接酶连接，就能使单个异源基因以2n-1(n为上一步重组T-载体含目的基因个数)的方式在T-载体上递增。最后将含多个异源基因的DNA片段，通过对应于其两端酶切位点的限制性内切酶切下，亚克隆到表达载体启动子下游，即可得到多顺反子表达载体。本发明操作简单，适用范围广，适用于所有蛋白，特别是小肽的表达。构建的表达载体可直接转化原核宿主细胞，可为解决蛋白质原核基因工程表达中表达量低的瓶颈问题提供技术平台。

1、  一种多顺反子表达载体构建方法，其特征在于：利用T-载体作为中间载体，设计两对引物，在引物中引入NheI和SpeI酶切位点及核糖体结合位点(RBS)，以含目的基因的DNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物重组到T-载体上，将得到的重组T-载体用NdeI+NheI、NdeI+SpeI双酶切，所得DNA片段用DNA连接酶连接，就能使单个异源基因以2n-1(n为上一步重组T-载体含目的基因个数)的方式在T-载体上递增；最后将含多个异源基因的DNA片段，通过对应于其两端酶切位点的限制性内切酶切下，亚克隆到表达载体启动子下游，即可得到多顺反子表达载体。

2、  按权利要求1所述的多顺反子表达载体构建方法，其特征在于：该构建方法的具体步骤如下：
1)设计引物
a、根据待扩增的目的基因序列，设计两对引物，在第一对引物的下游引物P_1下5′端引入NheI酶切位点，在第二对引物的上游引物P_2上5′端引入NheI酶切位点，在第二对引物的下游引物P_2下5′端引入SpeI酶切位点；
b、根据T-载体和表达载体多克隆位点结构特点，在引物中引入亚克隆用酶切位点；
c、根据表达载体的特点，在引物中引入起始密码子、终止密码子的反义密码子和核糖体结合位点；
2)分别以含目的基因的DNA为模板，用上述两对引物和DNA聚合酶进行PCR扩增，得到扩增产物；
3)将扩增产物与商品化的T-载体混合，按照T-载体使用说明书上介绍的方法进行操作，通过转化子菌落颜色，筛选出菌落呈白色的阳性克隆，提取质粒，测序或酶切鉴定阳性重组子，得到含1个目的基因的重组T-载体；
4)将步骤3)得到的两种含1个目的基因的重组T-载体，用NheI和NdeI酶切，分别回收重组载体片段和目的基因片段，用DNA连接酶连接，转化克隆宿主菌，提取转化子质粒，测序或酶切鉴定阳性重组子，得到含有2个目的基因的重组T-载体；
5)将步骤4)得到的含2个目的基因的重组T-载体，分别用NdeI+SpeI和NdeI+NheI进行酶切，分别回收重组载体片段和目的基因片段，用DNA连接酶连接，转化克隆宿主菌，提取转化子质粒，测序或酶切鉴定阳性重组子，得到含有3个目的基因的重组T-载体；
6)将步骤5)得到的含3个目的基因的重组T-载体，分别用NdeI+SpeI和NdeI+NheI进行酶切，分别回收重组载体片段和目的基因片段，用DNA连接酶连接，转化克隆宿主菌，提取转化子质粒，测序或酶切鉴定阳性重组子，得到含有5个目的基因的重组T-载体；
7)按上述步骤6)进行操作，可得到含2n-1个目的基因的重组T-载体，其中n为前一步目的基因的个数；
8)将得到的含2n-1个目的基因的重组T-载体，用对应于其两侧酶切位点的限制性内切酶切割，回收含2n-1个目的基因的DNA片段，与用相应限制性内切酶切割的表达载体相连，得到多顺反子表达载体，转化表达宿主菌，进行表达。

3、  按权利要求2所述的多顺反子表达载体构建方法，其特征为：NheI和SpeI为同尾酶。

4、  按权利要求2所述的多顺反子表达载体构建方法，其特征为：引物中引入核糖体结合位点，及核糖体结合位点(RBS)与其下游起始密码子之间7-12个碱基，以使第2至第2n-1个目的基因上游7-12个碱基处有RBS。

5、  按权利要求2所述的多顺反子表达载体构建方法，其特征为：步骤3)用T-载体作为中间介导载体；

6、  按权利要求2所述的多顺反子表达载体构建方法，其特征为：步骤4)、5)、6)和7)利用了T-载体上多克隆位点外的一个限制性内切酶位点NdeI酶切位点。

7、  按权利要求2所述的多顺反子表达载体构建方法，其特征为：步骤5)、6)和7)利用了同尾酶的特点，使T-重组载体经NheI和SpeI酶切后产生的粘性末端可以互补，连接后酶切位点消失。

8、  按权利要求2所述的多顺反子表达载体的构建方法，其特征为：步骤8)利用T-载体多克隆位点或引入的酶切位点，可以将多拷贝的目的基因亚克隆到表达载体上。

9、  按权利要求2所述的多顺反子表达载体的构建方法，其特征为：步骤4)、5)、6)中所加入的DNA连接酶为T4DNA连接酶。

一种多顺反子表达载体构建方法
技术领域
本发明涉及表达载体的构建方法，特别涉及一种多顺反子表达载体的构建方法。
背景技术
通常蛋白质的表达方法是将待克隆的目的基因与载体连接，将该重组子转化到受体菌中，筛选鉴定正确的克隆进行扩增，再将其转入宿主细胞中表达。这是目前蛋白质表达研究中运用最多的方法，但表达量低一直是蛋白质表达研究的一个瓶颈问题。为提高表达量，科学家采取了不同的改进措施，如串联表达(Dai，et al.Mar Biotechnol，DOI 10.1007/s10126-008-9125-6)和多顺反子表达(杨利军，等.中国生物工程杂志，2006，26 11：45～47)等。在上述构建表达载体的方法中，需要合成的引物多，要求PCR扩增的次数多，涉及的限制性内切酶多，涉及的实验步骤多，繁琐费时。另外，采用串联表达，表达产物多以多聚体形式存在。如果表达产物为药用蛋白质，可能会妨碍蛋白质在体内的运输，或多聚体形式影响蛋白质功能的发挥。因此，从目的蛋白功能发挥方面考虑，不如多顺反子表达。
发明内容
本发明的目的旨在克服现有技术存在的上述缺陷。提供一种生产成本低，操作简便快捷的多顺反子表达载体构建方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：本发明的多顺反子表达载体构建方法，是利用T-载体作为中间载体，设计两对引物，在引物中引入NheI和SpeI酶切位点及核糖体结合位点(RBS)，以含目的基因的DNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物重组到T-载体上，将得到的重组T-载体用NdeI+NheI、NdeI+SpeI双酶切，所得DNA片段用DNA连接酶连接，就能使单个异源基因以2n-1(n为上一步重组T-载体含目的基因个数)的方式在T-载体上递增；最后将含多个异源基因的DNA片段，通过对应于其两端酶切位点的限制性内切酶切下，亚克隆到表达载体启动子下游，即可得到多顺反子表达载体。
其构建方法的具体步骤如下：
1)设计引物(在设计引物时，引入NheI和SpeI两种限制性内切酶位点。利用两种限制性内切酶是同尾酶的特点，经NheI和SpeI酶切的DNA片段可以用DNA连接酶连接，连接后的DNA片段，两种限制性内切酶的酶切位点消失，以利于后续NheI和SpeI酶切操作。)
a、根据待扩增的目的基因序列，设计两对引物，在第一对引物的下游引物P_1下5′端引入NheI酶切位点，在第二对引物的上游引物P_2上5′端引入NheI酶切位点，在第二对引物的下游引物P_2下5′端引入SpeI酶切位点；
b、根据T-载体和表达载体多克隆位点结构特点，在引物中引入亚克隆用酶切位点；
为便于亚克隆到表达载体中，可以在第一对引物的上游引物P_1上5′端引入合适的酶切位点，在第二对引物的下游引物P_2下的SpeI酶切位点5′端引入另一个合适的酶切位点，如果选用T-载体多克隆位点处的限制性内切酶位点进行亚克隆操作，就不必在引物中另外引入限制性内切酶位点；
c、根据表达载体的特点，在引物中引入起始密码子、终止密码子的反义密码子和核糖体结合位点(RBS)或RBS的互补序列；
如果表达载体是分泌表达载体，由于载体启动子下游存在信号肽序列，设计的上游引物中不用引入起始密码子，下游引物中酶切位点3′端与目的基因的互补序列5′端之间需引入终止密码子的反义密码子，同时第二对引物的上游引物NheI酶切位点3′端与目的基因序列5′端之间需引入核糖体结合位点和信号肽序列；
如果表达载体不是分泌型表达载体，且亚克隆时，酶切位点处可产生起始密码子，如NdeI酶切位点，则第一对引物的上游引物不用引入起始密码子，第一对引物的下游引物需在NheI酶切位点3′端和目的基因互补序列5′端之间依次引入1～6个任意额外碱基，核糖体结合位点的互补序列和终止密码子的反义密码子序列；在第二对引物的上游引物NheI酶切位点3′端与目的基因序列5′端之间引入起始密码子，第二对引物的下游引物SpeI酶切位点3′端与目的基因的互补序列5′端之间引入终止密码子的反义密码子。
如果表达载体不是分泌表达载体，且亚克隆时，酶切位点处不能产生起始密码子，则在两对引物的上游引物酶切位点3′端与目的基因序列5′端之间需引入起始密码子，下游引物紧邻目的基因的互补序列5′端引入终止密码子的反义密码子，同时在第一对引物的下游引物中，需在NheI酶切位点3′端和终止密码子的反义密码子序列5′端之间依次引入1～6个任意额外碱基和核糖体结合位点的互补序列；
2)分别以含目的基因的DNA为模板，用上述两对引物和DNA聚合酶进行PCR扩增，得到扩增产物；
3)T-载体是一个广泛使用的便于亚克隆操作的商品化载体，是一个具有T粘性末端的线性载体，可与具有A末端的PCR产物连接，通过对应于目的基因两侧酶切位点的限制性内切酶切割，可直接亚克隆到其他载体上。
将扩增产物与商品化的T-载体混合，按照T-载体使用说明书上介绍的方法进行操作，通过转化子菌落颜色，筛选出菌落呈白色的阳性克隆，提取质粒，测序或酶切鉴定阳性重组子，得到含1个目的基因的重组T-载体；
4)在T-载体185bp处(不在T-载体的多克隆位点)有一个NdeI酶切位点。将步骤3)得到的两种含1个目的基因的重组T-载体，用NheI和NdeI酶切，分别回收重组载体片段和目的基因片段，用DNA连接酶连接，转化克隆宿主菌，提取转化子质粒，测序或酶切鉴定阳性重组子，得到含有2个目的基因的重组T-载体；
5)将步骤4)得到的含2个目的基因的重组T-载体，分别用NdeI+SpeI和NdeI+NheI进行酶切，分别回收重组载体片段和目的基因片段，用DNA连接酶连接，转化克隆宿主菌，提取转化子质粒，测序或酶切鉴定阳性重组子，得到含有3个目的基因的重组T-载体；
6)将步骤5)得到的含3个目的基因的重组T-载体，分别用NdeI+SpeI和NdeI+NheI进行酶切，分别回收重组载体片段和目的基因片段，用DNA连接酶连接，转化克隆宿主菌，提取转化子质粒，测序或酶切鉴定阳性重组子，得到含有5个目的基因的重组T-载体；
7)按上述步骤6)进行操作，可得到含2n-1个目的基因的重组T-载体，其中n为前一步目的基因的个数；
8)将得到的含2n-1个目的基因的重组T-载体，用对应于其两侧酶切位点的限制性内切酶切割，回收含2n-1个目的基因的DNA片段，与用相应限制性内切酶切割的表达载体相连，得到多顺反子表达载体，转化表达宿主菌，进行表达。
在本发明中，NheI和SpeI为同尾酶。
引物中引入核糖体结合位点，及核糖体结合位点(RBS)与起始密码子之间7-12个碱基，以使第2至第2n-1个目的基因上游7-12个碱基处有RBS。(即引入核糖体结合位点(RBS)，RBS与6个碱基的NheI酶切位点之间引入1～6个额外碱基，或RBS与信号肽序列，以保证第2至第2n-1个目的基因上游7-12个碱基处有RBS)
步骤3)用T-载体作为中间介导载体；
步骤4)、5)、6)和7)利用了T-载体上多克隆位点外的一个限制性内切酶位点NdeI酶切位点。
步骤5)、6)和7)利用了同尾酶的特点，使T-重组载体经NheI和SpeI酶切后产生的粘性末端可以互补，连接后酶切位点消失。
步骤8)利用T-载体多克隆位点或引入的酶切位点，可以将多拷贝的目的基因亚克隆到表达载体上。
本发明所加入的DNA连接酶为T4 DNA连接酶。
本发明提供的构建多顺反子表达载体的方法具有以下特点：
1)适用基因范围广。既适用于原核基因，也适用于真核基因cDNA序列。
2)用的限制性内切酶种类少。利用现有技术构建一个多顺反子表达载体，需要2n种限制性内切酶(n为顺反子个数)；而利用本方法，不管顺反子个数是多少，构建一个多顺反子表达载体，仅用5种限制性内切酶。
3)设计引物少。利用现有技术构建一个多顺反子表达载体，需要n对引物(n为顺反子个数)；而利用本方法，不管顺反子个数是多少，构建一个多顺反子表达载体，仅需要两对引物。
4)操作步骤少。如构建1个9顺反子表达载体，利用现有技术，需要9次PCR反应，9次酶切连接；而利用本方法，仅需要2次PCR反应，5次酶切连接。顺反子个数越多，该发明可简化操作步骤的优点越能得到体现。
5)多顺反子个数不受限制。利用现有技术构建多顺反子表达载体，多顺反子个数受表达载体MCS处限制性内切酶位点的个数限制；而利用本方法，多顺反子个数不受限制。
附图说明
图1为多顺反子表达载体构建示意图。
图2为实施例1 PCR扩增示意图
图3为实施例1构建重组T-载体示意图
图4为实施例1构建多顺反子表达载体示意图
图5为实施例2 PCR扩增示意图
图6为实施例2构建重组T-载体示意图
图7为实施例2构建多顺反子表达载体示意图
具体实施方式
本发明以下结合(附图)实施例作进一步描述，但并不限制本发明。
具体实施例1
利用三顺反子表达载体在枯草芽孢杆菌中分泌表达嗜铬粒蛋白A(CGA)抗真菌衍生肽CGA-N46。
以下所述步骤中所使用的限制性内切酶均购自NEB公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成，T-载体pMD18-T为TAKARA公司产品，DNA测序由上海英骏生物技术有限公司完成。
(1)两对引物的合成：
由于实施实例使用的T-载体pMD18-T有多克隆位点(MCS)，表达载体pSBPTQ(李瑞芳，等.微生物学报，2006，46(5)：714-719.)是发明人构建的枯草芽孢杆菌分泌表达载体，载体上有枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)启动子和信号肽序列，启动子下游的MCS处的限制性内切酶位点与pMD18-T上MCS处的限制性内切酶位点顺序相反。为便于亚克隆，第一对引物根据cga-N46基因序列(Genbank编号：GQ169789)设计，第二对引物的上游引物P_2上根据枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因启动子序列(王红革，等.微生物学报，1997，37(2)：101-106)中核糖体结合位点(RBS)序列设计，下游引物P_2下根据cga-N46基因序列设计，并引入KpnI酶切位点。
P_1上：5′ccc atg cct gtc agc aag3′
P_1下：ctg ctg atg tgc cct ctc 3′
P_2上：ccg cta aca cag ta ata 3′
P_2下：ctg ctg atg tgc cct ctc 3′
下划线“_ _ _ _ _”表示引入的NheI酶切位点，下划线“..........”表示引入的KpnI酶切位点，下划线“”表示引入的SpeI酶切位点，下划线“________”表示引入的终止密码子UAA的反义密码子，斜体字母表示目的基因序列；
考虑到将要用到的表达载体是分泌型枯草芽孢杆菌表达载体，载体上具有sac Bps，因此，P_1上中不用引入起始密码子，P_1下引入终止密码子，P_2上根据sacB基因RBS序列设计，P_2下引入终止密码子UAA的反义密码子。
(2)PCR扩增：参照图2，以含sac Bps和cga-N46基因的pSC31-76质粒(李瑞芳，等.中山大学学报，2006，45(2)：64-67)为模板，第一对引物合成出148bp的cga-N46基因片段；第二对引物合成出大约300bp的sac Bs-cga-N46基因片段。
(3)含1个cga-N46基因重组T-载体的构建：参照图3，将PCR产物回收后，分别与pMD18-T连接，按使用说明书进行操作，转化大肠杆菌DH5α后，涂布含X-gal的LB平板，通过转化子呈现的蓝白颜色筛选，白斑为阳性转化子。提取质粒，测序正确。得到含cga-N46基因片段的重组T-载体和含sac Bs-cga-N46基因片段的重组T-载体，分别命名为pT-N46和pT-SN46
(4)含2个cga-N46基因重组T-载体的构建：参照图3，用NheI+NdeI双酶切pT-N46得到2602bpDNA片段，用NheI+NdeI双酶切pT-SN46得到545bpDNA片段，两个DNA片段以1∶3的摩尔比于16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α。转化子质粒经酶切鉴定，得到含2个cga-N46基因重组T-载体，命名为pT-N46-SN46。
(5)含3个cga-N46基因重组T-载体的构建：参照图3，用NdeI+SpeI双酶切pT-N46-SN46得到3147bpDNA片段，用NdeI+NheI双酶切pT-N46-SN46得到545bpDNA片段，两个DNA片段以1∶3的摩尔比于16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α。转化子质粒经酶切鉴定，得到含3个cga-N46基因重组T-载体，命名为pT-N46-2SN46。
(6)cga-N46基因多顺反子枯草芽孢杆菌分泌型表达载体的构建：参照图4，将构建好的pT-N46、pT-N46-SN46和pT-N46-2SN46用KpnI和XbaI双酶切后，与经同样双酶切的质粒pSBPTQ连接，转化大肠杆菌DH5α。转化子质粒经酶切鉴定，分别得到cga-N46基因单顺反子、二顺反子和三顺反子枯草芽孢杆菌分泌型表达载体pSBPTQ-N46、pSBPTQ-2N46和pSBPTQ-3N46。
(7)cga-N46基因多顺反子枯草芽孢杆菌工程菌的构建：将构建好的pSBPTQ-N46、pSBPTQ-2N46和pSBPTQ-3N46转化枯草芽孢杆菌DB1342，成功构建了三株cga-N46异源表达工程菌。
(8)由于cga-N46基因在载体中处在sac B基因启动子下，因此采用使宿主菌生长至一定数量，再使用蔗糖诱导表达的策略。将三株抗菌肽异源表达菌株37℃摇床培养3小时，至OD₆₀₀约为0.4～0.6时，加入终浓度为2％的蔗糖诱导，继续培养24h，SDS-PAGE检测及Western印迹分析，在5kD左右检测到目的条带。对三株抗菌肽异源表达菌株表达量进行比较，发现目的蛋白CGA-N46的表达量分别为5mg/L，9mg/L和13mg/L，说明多顺反子表达可以有效提高异源蛋白表达量。
具体实施例2
利用三顺反子表达载体在大肠杆菌中表达钙网蛋白(CRT)衍生的抗癌多肽CRT-N58
以下所述步骤中所使用的限制性内切酶均购自NEB公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成，T-载体pMD18-T为TAKARA公司产品，DNA测序由上海英骏生物技术有限公司完成。
(1)两对引物的合成：
实施实例使用的T-载体pMD18-T有多克隆位点(MCS)，表达载体为商品化pET-3c，pET-3c为大肠杆菌表达载体，载体上仅有T7 lac启动子，不能分泌表达外源蛋白。第一对引物根据CRT cDNA设计，其上游引物5′端引入起始密码子atg，下游引物NheI位点3′端和目的基因互补序列5′端之间依次引入1个额外碱基a、大肠杆菌核糖体结合位点aggagg的互补序列cctcct和终止密码子UAA的反义密码子序列TTA；第二对引物的上游引物P_2上和下游引物P_2下根据CRT cDNA序列设计，其上游引物5′端引入NheI位点和起始密码子atg，下游引物P_2下5′端引入引入BamH I酶切位点、SpeI酶切位点、终止密码子UAA的反义密码子序列TTA。
P_1上：cac gga gac tca gaa tac 3′
P_1下：gtt gtc tgg cgg cac aat cag 3′
P_2上：cac gga gac tca gaa tac 3′
P_2下：gtt gtc tgg cgg cac aat cag 3′
下划线“_____”表示引入的起始密码子和终止密码子UAA的反义密码子，下划线“_ _ _ _ _”表示引入的NheI酶切位点，下划线“_______”表示引入的附加碱基，下划线“”表示引入的RBS位点，下划线“..........”表示引入的BamH I酶切位点，下划线“”表示引入的SpeI酶切位点，斜体字母表示目的基因序列；
(2)PCR扩增：参照图5，以CRT cDNA为模板，第一对引物合成出194bp的DNA片段；第二对引物合成出大约198bp的DNA片段。
(3)含1个crt-N58基因重组T-载体的构建：参照图6，将PCR产物回收后，分别与pMD18-T连接，按使用说明书进行操作，转化大肠杆菌DH5α后，涂布含X-gal的LB平板，通过转化子呈现的蓝白颜色筛选，白斑为阳性转化子。提取质粒，测序正确。得到含crt-N58基因片段与RBS序列的重组T-载体和含crt-N58基因片段的重组T-载体，分别命名为pT-N58R和pT-N58
(4)含2个crt-N58基因重组T-载体的构建：参照图6，用NheI+NdeI双酶切pT-N58R得到2648bpDNA片段，用NheI+NdeI双酶切pT-N58得到436bpDNA片段，两个DNA片段以1∶3的摩尔比于16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α。转化子质粒经酶切鉴定，得到含2个crt-N58基因重组T-载体，命名为pT-2N58。
(5)含3个crt-N58基因重组T-载体的构建：参照图6，用NdeI+SpeI双酶切pT-2N58得到2834bpDNA片段，用NdeI+NheI双酶切pT-2N58得到436bpDNA片段，两个DNA片段以1∶3的摩尔比于16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α。转化子质粒经酶切鉴定，得到含3个crt-N58基因重组T-载体，命名为pT-3N58。
(6)crt-N58基因多顺反子大肠杆菌表达载体的构建：参照图7，将构建好的pT-N58、pT-2N58和pT-3N58用XbaI和BamH I双酶切后，与经同样双酶切的质粒pET-3c连接，转化大肠杆菌DH5α。转化子质粒经酶切鉴定，分别得到crt-N58基因单顺反子、二顺反子和三顺反子大肠杆菌表达载体pET-N58、pET-2N58和pET-3N58。
(7)crt-N58基因多顺反子大肠杆菌工程菌的构建：将构建好的pET-N58、pET-2N58和pET-3N58转化大肠杆菌BL21(DE3)，成功构建了三株crt-N58异源表达工程菌。
(8)由于crt-N58基因在载体中处在lac启动子下，因此采用使宿主菌生长至一定数量，再使用IPTG诱导表达的策略。将三株抗癌多肽异源表达菌株37℃摇床培养至OD₆₀₀约为0.4～0.6时，加入终浓度为0.4mmol/L IPTG诱导，继续培养6h，SDS-PAGE检测及Western印迹分析，在6.2kD左右检测到目的条带。对三株抗癌多肽异源表达菌株表达量进行比较，发现CRT-N58在总蛋白中的百分含量分别为20.6％，35.4％和53.1％，说明多顺反子表达可以有效提高异源蛋白表达量。