检测三种/三种以下侵袭性念珠菌的快速诊断试剂盒及其应用方法.pdf

本发明涉及检测三种/三种以下侵袭性念珠菌的快速诊断试剂盒，包括盒体，其特征是：1)在试剂盒内设荧光定量PCR反应液、1～3种侵袭性念珠菌阳性质控品和阴性质控品；2)荧光定量PCR反应液含有特异性引物和荧光探针；3)阳性质控品由前述念珠菌的标准菌株中的一种、任意二种组合或任意三种组合，经“煮沸法”获得的DNA样品，阴性质控品为灭菌三蒸水。其应用方法如下：1)从待测标本中提取DNA；2)将DNA和同样量的阳性质控品加入到含有荧光定量反应液的PCR反应体系；3)用荧光定量PCR检测仪进行检测，根据反应结果的Ct值，对检测结果进行判断。本发明可同步对1～3种侵袭性念珠菌进行检测，为临床侵袭性念珠菌病的早期病原体诊断提供依据，可减少死亡率和后遗症。

1、  检测三种/三种以下侵袭性念珠菌的快速诊断试剂盒，包括盒体，其特征是：
1)在所述试剂盒内设有荧光定量PCR反应液、1～3种念珠菌的阳性质控品和阴性质控品；
2)所述荧光定量PCR反应液含有特异性引物和1～3种念珠菌相对应的荧光探针，所述特异性引物序列如序列表SEQ ID№：1所示；
3)所述侵袭性念珠菌的阳性质控品是由白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌和热带念珠菌的标准菌株中的一种、任意二种组合或任意三种组合，经“煮沸法”获得的DNA样品，所述侵袭性念珠菌的阴性质控品为灭菌三蒸水。

2、  如权利要求1所述的检测三种/三种以下侵袭性念珠菌的快速诊断试剂盒，其特征是：所述侵袭性念珠菌的阳性质控品是由白色念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌的标准菌株，经“煮沸法”获得的DNA样品；与白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌相对应的荧光探针序列如序列表SEQID№：2所示。

3、  如权利要求1所述的检测三种/三种以下侵袭性念珠菌的快速诊断试剂盒，其特征是：所述侵袭性念珠菌的阳性质控品是由白色念珠菌、克柔念珠菌和热带念珠菌的标准菌株，经“煮沸法”获得的DNA样品；与白色念珠菌、克柔念珠菌和热带念珠菌相对应的荧光探针序列如序列表SEQ ID№：3所示。

4、  检测三种/三种以下侵袭性念珠菌的快速诊断试剂盒的应用方法，其特征在于包括以下步骤：
1)用“煮沸法”从待测标本中提取DNA；
2)分别取第1)步中待测标本的DNA和与所述DNA同样量的阳性质控品，加入到含有荧光定量反应液的PCR反应体系中；
3)用荧光定量PCR检测仪进行检测，根据反应结果的Ct值，对检测结果进行判断。
4)所述结果判断方法是：检测样品Ct值≤35.0者，且出现典型的扩增曲线判为阳性；无Ct值，且无典型的扩增曲线者判为阴性；若Ct值＞35.0，且出现典型的扩增曲线的样本，按前述步骤重做。重做结果出现Ct值和典型的扩增曲线者为阳性，否则为阴性。

5、  如权利要求4所述检测三种/三种以下侵袭性念珠菌的快速诊断试剂盒的应用方法，其特征在于：荧光定量PCR反应体系的反应条件是95℃变性10min，95℃30s，59℃1min，59℃1min，扩增50个循环。

6、  如权利要求4所述检测三种/三种以下侵袭性念珠菌的快速诊断试剂盒的应用方法，其特征在于：所述Ct值指荧光信号在每次循环的延伸阶段收集，荧光信号阈值以刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点为准，扩增产物的荧光信号达到阈值时所需的扩增循环次数。

检测三种/三种以下侵袭性念珠菌的快速诊断试剂盒及其应用方法
技术领域
本发明涉及一种快速诊断试剂盒及其应用方法，尤其涉及一种检测三种/三种以下侵袭性念珠菌的荧光定量PCR快速诊断试剂盒及其应用方法。属于真菌核酸检测技术领域，适用于临床及科研中对白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌及其他侵袭性念珠菌的快速检测。
背景技术
近年来，随着器官移植、骨髓移植的广泛开展，艾滋病和肿瘤患者的增多以及皮质类固醇激素、广谱抗生素、免疫抑制剂的大量应用，侵袭性念珠菌感染的发病率明显增高。美国的一项前瞻性研究显示，真菌感染占医院血行感染的9.5％。念珠菌感染对免疫抑制和免疫缺陷病人的危害性大，死亡率高达45％，已成为威胁患者生命最严重的并发症之一。研究表明，尽管白色念珠菌仍是侵袭性念珠菌感染最主要的病原菌，但其在临床分离菌中所占的比例逐年下降，而热带念珠菌等非白色念珠菌(non-albicans Candida，NAC)感染比例呈上升趋势，且克柔念珠菌对氟康唑天然耐药，光滑念珠菌对此药不敏感，给临床的治疗带来一定的困难。既往研究发现，早期有效的抗念珠菌治疗可以显著改善预后。因此，早期确诊侵袭性感染念珠菌菌种，对其实施针对性治疗，及时救治生命具有重要意义。
然而，侵袭性念珠菌感染的临床表现缺乏特异性，不同病原菌之间在毒力、感染部位、药物敏感性以及临床预后等方面均有差异，对其做出诊断常需结合实验室诊断结果。目前侵袭性念珠菌的实验室诊断方法包括真菌培养和表型检测法、血清学检测法、组织病理切片鉴定法与分子生物学鉴定技术等。真菌培养受取材时间、取材部位、样本因素、培养条件等因素的影响，阳性率一直很低，且费时费力，常规培养需要3天，不能发挥指导临床早期针对性治疗的作用。血清学方法虽然因操作过程简便而广受实验室欢迎，但该方法应用范围窄，又存在交叉抗原，易出现假阳性或假阴性，且无法鉴定到种，无法满足诊断需要。组织病理鉴定法是临床侵袭性念珠菌病的确诊方法，但因该法是有创性检查，患者较难接受，且重症侵袭性真菌感染患者，常常伴有血小板减少，凝血功能差，一般不宜采用组织活检方法。该方法阳性率低。因此，前述的实验室诊断方法限制了其在临床诊断中的运用。
由于分子生物学方法特异性和敏感性高，并且可快速诊断，是目前真菌感染诊断研究中最活跃的一种方法；荧光定量PCR(fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)技术具有自动化程度高、操作过程全封闭、无污染、实时性、能实现多重反应等优点，已广泛用于病毒、细菌等病原体的检测；因此，本发明基于分子生物学方法，研究一种检测侵袭性念珠菌的快速诊断试剂盒及其应用方法。
发明内容
本发明的第一个目的，是为了克服现有技术中的不足，提供一种检测三种/三种以下侵袭性念珠菌的快速诊断试剂盒。
本发明的第二个目的，是为了提供检测三种/三种以上侵袭性念珠菌快速诊断试剂盒的应用方法。
本发明的第一个目的可以通过采取如下技术方案达到：
检测三种/三种以下侵袭性念珠菌的快速诊断试剂盒，包括盒体，其特征是：
1)在所述试剂盒内设有荧光定量PCR反应液、1～3种念珠菌的阳性质控品和阴性质控品；
2)所述荧光定量PCR反应液含有特异性引物和1～3种念珠菌相对应的荧光探针，所述特异性引物序列如序列表SEQ ID№：1所示；
3)所述侵袭性念珠菌的阳性质控品是由白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌和热带念珠菌的标准菌株中的一种、任意二种组合或任意三种组合，经“煮沸法”获得的DNA样品，所述侵袭性念珠菌的阴性质控品为灭菌三蒸水。
本发明的第一个目的还以通过采取如下技术方案达到：
本发明的一种实施方式是：所述侵袭性念珠菌的阳性质控品是由白色念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌的标准菌株，经“煮沸法”获得的DNA样品；与白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌相对应的荧光探针序列如序列表SEQ ID№：2所示。
本发明的一种实施方式是：所述侵袭性念珠菌的阳性质控品是由白色念珠菌、克柔念珠菌和热带念珠菌的标准菌株，经“煮沸法”获得的DNA样品；与白色念珠菌、克柔念珠菌和热带念珠菌相对应的荧光探针序列如序列表SEQ ID№：3所示。
本发明的一种实施方式是：所述荧光定量PCR反应液包括：25μl反应体系包括Brilliant QPCR Master mixII 12.5μl，通用引物(0.1mmol/l)各0.5μl，四条探针(0.1mmol/l)各0.25μl，DNA模板1μl，补DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)水至25μl。
本发明的第二个的可以通过采取以下技术方案实现：
检测三种/三种以下侵袭性念珠菌的快速诊断试剂盒的应用方法，其特征在于包括以下步骤：
1)用“煮沸法”从待测标本中提取DNA；
2)分别取第1)步中待测标本的DNA和与所述DNA同样量的阳性质控品，加入到含有荧光定量反应液的PCR反应体系中；
3)用荧光定量PCR检测仪进行检测，根据反应结果的Ct值，对检测结果进行判断。
4)所述结果判断方法是：检测样品Ct值≤35.0者，且出现典型的扩增曲线判为阳性；无Ct值，且无典型的扩增曲线者判为阴性；若Ct值＞35.0，且出现典型的扩增曲线的样本，按前述步骤重做。重做结果出现Ct值和典型的扩增曲线者为阳性，否则为阴性。
本发明的第二个目的还可以通过采取如下技术方案达到：
所述荧光定量PCR反应体系的反应条件是95℃变性10min，95℃30s，59℃1min，59℃1min，扩增50个循环。
所述Ct值指荧光信号在每次循环的延伸阶段收集，荧光信号阈值以刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点为准，扩增产物的荧光信号达到阈值时所需的扩增循环次数。
本发明的作用原理：利用Taq酶的5’-3’外切酶活性，在PCR反应系统中加入不同荧光(例如FAM、HEX、CY5、ROX)标记的四条探针，分别和四种念珠菌的保守基因序列相对应，四条探针的5’端标以荧光发射基团FAM(或HEX、CY5、ROX)，靠近3’端标以荧光淬灭基团BHQ1(或BHQ3)。反应体系中的每种探针可以与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交，每种探针对应每种碱基序列。当探针保持完整时，淬灭基团抑制发射基团的荧光发射。发射基团一旦与淬灭基团发生分离，抑制作用被解除，检测波长处光密度增加而被荧光探测系统检测到。复性期探针与模板DNA发生杂交，延伸期Taq酶随引物延伸沿着DNA模板移动，当移动到探针结合处切断探针，淬灭作用被解除，荧光信号释放出来。模板每复制一次，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放，结果中被检测到的荧光信号所标记的探针，对应于检测区域的基因类型。
本发明具有的有益效果如下：
1、本发明结合荧光定量PCR技术，采用通用引物和白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌的任意1～3种特异探针，开发研制出用于检测四种对氟康唑等临床一线抗真菌药敏感性不同的侵袭性念珠菌的试剂盒，可同步对1～3种侵袭性念珠菌进行检测，能够为临床侵袭性念珠菌病的早期病原体诊断提供依据，以便早期及时制定治疗方案，减少死亡率和后遗症。
2、本发明的试剂合的特异性好，通过引物高特异扩增和荧光探针的高特异杂交双重控制，具有很高的准确性，假阳性低；能简便、快速、特异、灵敏地同时检测四种对氟康唑等临床一线抗真菌药敏感性不同的侵袭性念珠菌，为临床侵袭性念珠菌病的早期病原体诊断提供依据。
3、本发明试剂盒具有灵敏度高，反应过程由荧光检测系统实时监控，荧光检测系统对荧光信号具有很高的检测灵敏度；检测速度快，仅2.5小时，加上样品DNA的提取制备，共需3小时；步骤简单，可重复性高；所有试剂均是一次性扩增，没有后处理，毋需开盖，不产生污染。
具体实施方式
本发明所用试剂：Brilliant QPCR Master mix II，购自美国Stratagene公司；PCR通用引物和荧光探针，购自上海超世生物技术有限公司。
具体实施例1
本实施例1构成检测三种念珠菌的快速诊断试剂盒。
包括盒体和设置在盒体内的荧光定量PCR反应液、三种念珠菌的阳性质控品和阴性质控品；所述荧光定量PCR反应液含有特异性引物和三种念珠菌相对应的荧光探针；所述侵袭性念珠菌的阳性质控品由白色念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌的标准菌株经“煮沸法”获得的DNA样品，所述侵袭性念珠菌的阴性质控品为灭菌三蒸水。
所述三种物质的制备方法如下：
1)荧光定量PCR反应液的配制：Brilliant QPCR Master mix II 12.5μl，通用引物(0.1mmol/l)
各0.5μl，三条探针(0.1mmol/l)各0.25μl，DNA模板1μl，补DEPC水至25μl。
其中通用引物包括正向引物、反向引物两种，分别是：
正向引物(P1)：5′～GGCATGCCTGTTTGAGCGT～3′；
反向引物(P2)：5′～TCCTCCGCTTATTGATATGC～3′；
所述三条探针如表1所述：
表1：三种特异性荧光定量PCR探针序列及荧光标记

2)白色念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌阳性质控品：三种念珠菌经“煮沸法”获得的DNA样品，-20℃保存。
3)阴性质控品：灭菌三蒸水。
本发明特异检测三种念珠菌的快速诊断试剂盒的使用方法如下：
1)模板DNA的制备
取含菌悬液1ml，13,000rpm离心10min。弃上清，沉淀中加入1mL灭菌生理盐水，振荡悬浮，13,000rpm离心10min。弃上清，向沉淀加入灭菌三蒸水100μl，再放入100℃水浴18min，13,000rpm离心10min，取上清，置-20℃冰箱中保存备用。
2)荧光定量PCR反应
取荧光定量PCR反应液14.5μl，加入第一步所取得的DNA模板1μl，补DEPC水至25μl。循环条件为：95℃变性10min，95℃30s，59℃1min，59℃1min，扩增50个循环。荧光信号在每次循环的延伸阶段收集。
3)结果判断
循环结束后，运用仪器自带软件分析检测结果。循环域值(Ct值)设定原则根据仪器噪声情况调整，以Ct值刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点为准；阴性结果判定：无Ct值，且无典型的扩增曲线；阳性结果判定：Ct值≤35.0，且出现典型的扩增曲线；实验灰区：Ct值＞35.0，且出现典型的扩增曲线的样本建议重做。重做结果出现Ct值和典型的扩增曲线者为阳性，否则为阴性。
本实施例提供检测三种侵袭性念珠菌的多重荧光定量PCR试剂盒，主要针对三种念珠菌检测中的特殊性，对不同的靶片断进行反应体系，如引物和探针浓度、退火温度等的优化，建立了多重荧光定量PCR检测三种侵袭性念珠菌的方法，是一种特异检测三种侵袭性念珠菌的荧光定量PCR快速诊断试剂盒。
具体实施例2
本具体实施例2的特点是：所述三条探针如下所述：

2)白色念珠菌、克柔念珠菌和热带念珠菌阳性质控品：三种念珠菌经“煮沸法”获得的DNA样品，-20℃保存。
结合表2、表3所示，用本发明试剂盒扩增13种94株临床上常见的致病性真菌、5种细菌和人全血细胞DNA，白色念珠菌、克柔念珠菌热带念珠菌的Ct值均≤35.0，鉴定结果为阳性，而其它念珠菌、细菌、曲霉菌、新生隐球菌、人类基因组DNA等Ct值无读数，呈阴性结果。
由表2、表3数据结果充分证明本发明试剂盒具有很好的特异性。
其余同具体实施例1。
具体实施例3
将白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌悬液的任意两种或三种按10倍倍比稀释为：5×10⁸、5×10⁷、5×10⁶、5×10⁵、5×10⁴、5×10³、5×10²、5×10¹CFU/ml。按上述方法提取DNA后进行荧光定量PCR扩增，结果在5×10³CFU/ml均仍能观察到“S”型曲线，表明荧光定量PCR法最低可检出5×10³CFU/ml的上述四种念珠菌，本发明的试剂盒具有很强的灵敏性。
具体实施例4
随机抽取的10份样品，经多重荧光定量PCR法进行4次重复实验，结果均与常规真菌培养结果相符，证明本发明试剂盒具有很好的重复性。
表2多重荧光定量PCR法检测标准菌株结果


表3多重荧光定量PCR法检测临床分离菌株结果

通过上述具体实施例可知，念珠菌核糖体RNA基因(rDNA)为串连重复序列，由编码18S rRNA、5.8S rRNA、28SrRNA的基因和相互之间的转录间隔区(internally transcribedspacers，ITS)构成。编码rRNA的基因在生物进化过程中相对保守，一定程度上反映了各物种间的进化关系和种间差异，可作为研究生物系统进化和分类的可靠参照物，设计通用引物。ITS区进化速率较快，具有一定的种间变异性和种内保守性，可用于区分同属不同种乃至种内水平的变异。其中，ITSII区有较高的种间变异性和种内特异性，可用来设计种特异核酸探针。根据保守区设计的通用引物和针对可变区设计的种特异核酸探针，不仅可以把真菌跟其他病原菌区分开来，而且可将其鉴定到种。
序列表
<110>广州医学院第一附属医院、广州呼吸病研究所、呼吸疾病国家重点实验室
<120>检测三种/三种以下侵袭性念珠菌的快速诊断试剂盒及其应用方法
<160>1
<210>1
<211>
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为了用于病毒、细菌等病原体的检测而设计的引物，用作荧光定量PCR扩增
<400>3
正向引物(P1)：5′～GGCATGCCTGTTTGAGCGT～3′
反向引物(P2)：5′～TCCTCCGCTTATTGATATGC～3′
<210>2
<211>
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为了用于病毒、细菌等病原体的检测而设计的三种特异性荧光定量PCR探针序列及荧光标记序列，用作荧光定量PCR扩增
<400>3
白色念珠菌FAM-CCTAAGCCATTGTCAAAGCGATCCCG-BHQ1
克柔念珠菌HEX-TCGGAGCTGCGACTCGCCTGA-BHQ1
光滑念珠菌CY5-TTAATCTGCTGCTCGTTTGCGCGA-BHQ3
<210>3
<211>
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>为了用于病毒、细菌等病原体的检测而设计的三种特异性荧光定量PCR探针序列及荧光标记序列，用作荧光定量PCR扩增
<400>3
白色念珠菌FAM-CCTAAGCCATTGTCAAAGCGATCCCG-BHQ1
克柔念珠菌HEX-TCGGAGCTGCGACTCGCCTGA-BHQ1
热带念珠菌ROX-CGCTTATTTTGCTAGTGGCCACCACA-BHQ1