食品中金黄色葡萄球菌毒素基因的检测试剂盒及检测方法.pdf

食品中金黄色葡萄球菌毒素基因的检测试剂盒及检测方法，该试剂盒中包括检测溶液A和检测溶液B：检测溶液A和B中均含10mM Tris·Cl、50mM KCl、25mM MgCl2、dNTP各2.5mM、Taq DNA聚合酶5U/μL，还分别含有ETA、SEB、SEC、SEE、SEI和SEA六种毒素基因引物对各10μM或SEJ、ETB、TSST、SED、SEH和SEG六种毒素基因引物对各10μM。使用本发明的检测试剂盒及检测方法，可以高灵敏度地检测食品中12种金黄色葡萄球菌毒素基因，并且检侧耗时短，操作简捷，可以节省大量的劳力和财力，适合快速检测的要求。

1、  食品中金黄色葡萄球菌毒素基因的检测试剂盒，其特征在于包括检测溶液A和检测溶液B：
检测溶液A中含10mM Tris·Cl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP各2.5mM、Taq DNA聚合酶5U/μL及ETA、SEB、SEC、SEE、SEI和SEA六种毒素基因引物对各10μM；
检测溶液B中含10mM Tris·Cl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP各2.5mM、Taq DNA聚合酶5U/μL及SEJ、ETB、TSST、SED、SEH和SEG六种毒素基因引物对各10μM；
其中，检测溶液A中6种毒素基因的特异性引物序列如下：

检测溶液B中6种毒素基因的特异性引物序列如下：


2、  食品中金黄色葡萄球菌毒素基因的检测方法，其特征在于使用权利要求1所述的试剂盒，包括如下步骤：
①PCR反应：取1ul待测样品DNA溶液，加入10ul试剂盒中的检测溶液A和14ul灭菌超纯水，总体积25ul；另取1ul待测样品DNA溶液，加入10ul试剂盒中的检测溶液B和14ul灭菌超纯水，总体积25ul；两个反应体积分别在5000r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR扩增：
预变性：94℃，3min；
进入循环：94℃变性60s，60℃退火60s，72℃延伸60s，35次循环；
终止延伸：72℃，7min；
②将PCR扩增产物进行DHPLC分析：
色谱柱：PS-DVB & C18 DNASep色谱柱，4.6mm×50mm，粒度3μm；
柱温：50℃；
流动相(体积比)：0.0min，55.0％缓冲溶液A，45.0％缓冲溶液B；
                0.5min，50.2％缓冲溶液A，49.8％缓冲溶液B；
                2.8min，40.9％缓冲溶液A，59.1％缓冲溶液B；
                5.0min，37.3％缓冲溶液A，62.7％缓冲溶液B；

7.  3min，35.5％缓冲溶液A，64.5％缓冲溶液B；

9.  5min，34.3％缓冲溶液A，65.7％缓冲溶液B；
其中，缓冲溶液A是浓度0.1mM的TEAA水溶液；缓冲溶液B是浓度为0.1M TEAA水溶液与乙腈按体积比3∶1的混合溶液；
流速：0.9mL/min；
检测器：荧光检测器，光源：150W Xenon灯；激发谱带宽：15nm；发射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s；
上样量：PCR产物5μL。

食品中金黄色葡萄球菌毒素基因的检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及用于食品中金黄色葡萄球菌毒素基因的检测试剂盒及检测方法，尤其涉及基于PCR-DHPLC的快速检测试剂盒和检测方法。
背景技术
金黄色葡萄球菌在不同食物、不同温度和pH值的条件下，产生的肠毒素是不同的。金黄色葡萄球菌肠毒素(SE)有12个血清型，分别为剥脱毒素ETA(exfoliative toxin A)、SEB、SEC、SEE、SEI、SEA、SEJ、ETB、中毒休克毒素TSST(toxic shock syndrome toxin)、SED、SEH、SEG。
金黄色葡萄球菌在pH值低于5的条件下很少产生肠毒素，当pH值高于9.8时，无论何型葡萄球菌肠毒素都不能产生。葡萄球菌在牛奶和谷粉粥上，于20℃～37℃下经4h～8h产生毒素，在5℃～6℃低温下18d产生毒素或不产生毒素。在含水分、蛋白质和淀粉较多的食品中，葡萄球菌较易繁殖并产生毒素，如带菌的生肉馅，于37℃下经18h～19h产生毒素，若在肉馅中加入少量馒头碎屑，在同样温度下只经过8h就能产生毒素，可见淀粉对形成毒素有促进作用。
引起金黄色葡萄球菌肠毒素中毒的食品：主要为肉、奶、鱼、蛋类及其制品等动物性食品。糕、凉拌切粉、剩大米饭和米酒等也曾引起过中毒；熟肉类如在熟后污染了致病葡萄球菌，又在20℃～30℃的环境下放置较长时间，则极易引起中毒；奶和奶制品以及用奶制作的冷饮(冰激凌、冰棍)和奶油糕点常是引起中毒的食品；油煎鸡蛋、熏鱼、油浸鱼罐头等含油脂较多的食品，在污染上致病性葡萄球菌以后也能产生毒素。金黄色葡萄球菌在空气中氧分低时较易产生肠毒素，因此带有此菌的食品，在通风不良的高温下放置，极有利此菌生长并产生毒素。当食品污染了葡萄球菌并同时污染了其他微生物时，葡萄球菌的繁殖则受到抑制。如食品经加热，原有的各种微生物已被杀死，拮抗微生物也不复存在，熟后再一次被葡萄球菌污染，则将会促进葡萄球菌的生长并形成毒素。金黄色葡萄球菌引起的食物中毒在世界各地均有发现。常发生于夏秋季节，这是因为气温较高，有利于细菌繁殖。但在冬季，如受到污染的食品在温度较高的室内保存，葡萄球菌也可繁殖并产生毒素。当此细菌数＞10⁶个/克时，产生的肠毒素可引起食物中毒等病症。
因此，建立对金黄色葡萄球菌12种毒素基因，即ETA、SEB、SEC、SEE、SEI、SEA、SEJ、ETB、TSST、SED、SEH和SEG的快速、准确、高灵敏的检测方法就尤为必要。
发明内容
本发明首先提供用于检测金黄色葡萄球菌12种毒素基因，即ETA、SEB、SEC、SEE、SEI、SEA、SEJ、ETB、TSST、SED、SEH和SEG的试剂盒。
本发明所述的食品中金黄色葡萄球菌毒素基因的检测试剂盒中包括检测溶液A和检测溶液B：
检测溶液A中含10mM Tris·Cl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP各2.5mM、Taq DNA聚合酶5U/μL及ETA、SEB、SEC、SEE、SEI和SEA六种毒素基因引物对各10μM；这6种毒素基因的特异性引物序列如下：

检测溶液B中含10mM Tris·Cl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP各2.5mM、Taq DNA聚合酶5U/μL及SEJ、ETB、TSST、SED、SEH和SEG六种毒素基因引物对各10μM；检测溶液B中这6种毒素基因的特异性引物序列如下：

本发明还提供了利用上述试剂盒检测食品中金黄色葡萄球菌毒素基因的方法，包括如下步骤：
①PCR反应：取1ul待测样品DNA溶液，加入10ul试剂盒中的检测溶液A和14ul灭菌超纯水，总体积25ul；另取1ul待测样品DNA溶液，加入10ul试剂盒中的检测溶液B和14ul灭菌超纯水，总体积25ul；两个反应体积分别在5000r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR扩增：
预变性：94℃，3min；
进入循环：94℃变性60s，60℃退火60s，72℃延伸60s，35次循环；
终止延伸：72℃，7min；
②将PCR扩增产物进行DHPLC分析：
色谱柱：PS-DVB&C18DNASep色谱柱，4.6mm×50mm，粒度3μm；
柱温：50℃；
流动相(体积比)：0.0min，55.0％缓冲溶液A，45.0％缓冲溶液B；
0.5min，50.2％缓冲溶液A，49.8％缓冲溶液B；
2.8min，40.9％缓冲溶液A，59.1％缓冲溶液B；
5.0min，37.3％缓冲溶液A，62.7％缓冲溶液B；
7.3min，35.5％缓冲溶液A，64.5％缓冲溶液B；
9.5min，34.3％缓冲溶液A，65.7％缓冲溶液B；
其中，缓冲溶液A是浓度0.1mM的TEAA水溶液；缓冲溶液B是浓度为0.1M TEAA水溶液与乙腈按体积比3∶1的混合溶液；
流速：0.9mL/min；
检测器：荧光检测器，光源：150W Xenon灯；激发谱带宽：15nm；发射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s；
上样量：PCR产物5μL。
检测结束后，根据DHPLC检测图谱中特征色谱峰的峰形、保留时间以及与阳性对照谱图的对照，来确定样品的染菌情况。
本发明采用mPCR-DHPLC技术，针对食品中金黄色葡萄球菌毒素基因建立灵敏便捷的检测方法，并建立应用于该方法的快速检测试剂盒。使用本发明的检测试剂盒及检测方法，可以高灵敏度地检测食品中12种金黄色葡萄球菌毒素基因，并且检测耗时短，操作简捷，可以节省大量的劳力和财力，适合快速检测的要求。
附图说明
本发明附图12幅，分别是：
图1是ETA、SEB、SEC、SEE、SEI和SEA基因各自单一PCR电泳图；
图2是ETA、SEB、SEC、SEE、SEI和SEA基因mPCR-电泳图；
图3是ETA、SEB、SEC、SEE、SEI和SEA基因mPCR-DHPLC检测谱图；
图4是SEJ、ETB、TSST、SED、SEH和SEG基因各自单一PCR电泳图；
图5是SEJ、ETB、TSST、SED、SEH、SEG基因mPCR-电泳图；
图6是SEJ、ETB、TSST、SED、SEH和SEG基因mPCR-DHPLC检测谱图；
图7是ETA、SEB、SEC、SEE、SEI和SEA基因mPCR-DHPLC检测灵敏度试验结果；
图8是ETA、SEB、SEC、SEE、SEI和SEA基因mPCR-凝胶电泳检测灵敏度试验结果，其中：1，100bp Ladder DNA Marker；2，10⁴数量级的菌浓度；3，10³数量级的菌浓度；
图9是SEJ、ETB、TSST、SED、SEH和SEG的mPCR-DHPLC检测灵敏度试验结果；
图10是SEJ、ETB、TSST、SED、SEH和SEG基因mPCR-凝胶电泳检测灵敏度试验结果，1，100bp Ladder DNA Marker；2，10⁴数量级的菌浓度；3，10³数量级的菌浓度；
图11是A模拟污染样品mPCR-DHPLC检测图谱；
图12是B模拟污染样品mPCR-DHPLC检测图谱。
上述附图中，横坐标均为保留时间(单位：分钟min)，纵坐标表示吸收峰信号强度(单位：毫伏mV)。
具体实施方式
下面为本发明的具体实施例，其对本方法的建立及其应用作进一步的说明，但并不以任何形式限制本发明的内容。
若无特殊说明，本部分所使用的主要试剂、仪器及其商品来源为：营养肉汤培养液，普通琼脂培养平板，以及本部分所使用的各菌株的增菌、分离和生化鉴定培养基等均按照相关的国家标准(GB)、检验检疫行业标准(SN)或国际权威标准方法中的配方，购于美国BD公司。
细菌基因组DNA提取试剂(TakaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNAExtraction kit)及Ex Taq等试剂购白宝生物工程(大连)有限公司；三乙胺乙酰盐(TEAA，色谱纯)购自Transgenomic公司；乙腈(色谱纯)购自Fisher公司。
本部分所使用的标准菌株分分别购自美国ATCC标准生物品收藏中心和中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)。
本部分所涉及的试验菌株，均采用细菌DNA提取试剂盒提取细菌DNA，保存于-20℃备用以待检测。
实施例1、食品中金黄色葡萄球菌毒素基因的检测试剂盒及检测方法的建立
(1)引物的设计、合成与试剂盒的组装，所述引物如下所述：


在此基础上，设计用于mPCR-DHPLC检测的试剂盒：
试剂盒中包括检测溶液A和检测溶液B：
检测溶液A中含10mM Tris·Cl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP各2.5mM、Taq DNA聚合酶5U/μL及上述ETA、SEB、SEC、SEE、SEI和SEA六种毒素基因引物对各10μM；
检测溶液B中含10mM Tris·Cl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP各2.5mM、Taq DNA聚合酶5U/μL及上述SEJ、ETB、TSST、SED、SEH和SEG六种毒素基因引物对各10μM。
(2)mPCR-DHPLC检测方法的建立
本检测方法使用本实施例建立的mPCR-DHPLC检测的试剂盒，包括如下步骤：
①待检样品的制备：
a.一般食品样品：取食品样品25g，加入无菌0.2mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液25mL，均质成匀浆。放入灭菌的200mL肠毒素产毒培养基中，36℃培养48h。
b.菌株样品的制备：待测菌株接种在营养琼脂上，36℃培养24h。用约3mL灭菌盐水洗下菌苔，放入肠毒素产毒培养基中，36℃振荡培养48h。
取培养的相应肠产毒素培养基中的培养液1mL，用细菌DNA提取试剂盒提取细菌DNA，保存于-20℃备用以待检测。
②PCR扩增：
本实施例建立两组复合PCR体系，第一组复合PCR体系一次检测金黄色葡萄球菌毒素ETA、SEB、SEC、SEE、SEI、SEA基因；第二组复合PCR体系一次检测金黄色葡萄球菌毒素SEJ、ETB、TSST、SED、SEH、SEG基因。
取1ul待测样品DNA溶液，加入10ul试剂盒中的检测溶液A和14ul灭菌超纯水，总体积25ul；另取1ul待测样品DNA溶液，加入10ul试剂盒中的检测溶液B和14ul灭菌超纯水，总体积25ul；两个反应体积分别在5000r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR扩增：
预变性：94℃，3min；
进入循环：94℃变性60s，60℃退火60s，72℃延伸60s，35次循环；
终止延伸：72℃，7min；
②将PCR扩增产物进行DHPLC分析：
色谱柱：PS-DVB&C18DNASep色谱柱，4.6mm×50mm，粒度3μm；
柱温：50℃；
流动相(体积比)：0.0min，55.0％缓冲溶液A，45.0％缓冲溶液B；
0.5min，50.2％缓冲溶液A，49.8％缓冲溶液B；
2.8min，40.9％缓冲溶液A，59.1％缓冲溶液B；
5.0min，37.3％缓冲溶液A，62.7％缓冲溶液B；
7.3min，35.5％缓冲溶液A，64.5％缓冲溶液B；
9.5min，34.3％缓冲溶液A，65.7％缓冲溶液B；
其中，缓冲溶液A是浓度0.1mM的TEAA水溶液；缓冲溶液B是浓度为0.1M TEAA水溶液与乙腈按体积比3∶1的混合溶液；
流速：0.9mL/min；
检测器：荧光检测器，光源：150W Xenon灯；激发谱带宽：15nm；发射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s；
上样量：PCR产物5μL。
实施例2、多重反应体系检测对比试验
分别采用PCR-电泳和实施例1建立的PCR-DHPLC方法进行检测和对比。
本实施例建立两组复合PCR体系，第一复合PCR体系检测对象包括ETA、SEB、SEC、SEE、SEI、SEA基因；第二复合PCR体系检测对象包括ETASEJ、ETB、TSST、SED、SEH、SEG基因。
第一复合PCR体系ETA、SEB、SEC、SEE、SEI、SEA六种毒素基因的PCR预期扩增片段分别为：119bp、257bp、317bp、350bp、375bp、478bp；其单独的PCR-电泳检测结果见附图1所示，mPCR-电泳检测结果见附图2所示；mPCR-DHPLC检测结果见附图3所示。
从由图1和图2可见，当这6种毒素基因作单一PCR扩增和电泳检测时，均能明显地检测出各自单一的条带；而当该6种毒素基因作复合PCR扩增和电泳检测时，317bp、350bp、375bp的扩增条带却无法分开；从图3可以看出，6种毒素基因的mPCR-DHPLC信号峰各自清晰可辨，显示出比mPCR-电泳更好的检测结果。
第二复合PCR体系SEJ、ETB、TSST、SED、SEH、SEG六种毒素基因的PCR预期扩增片段分别为：142bp、200bp、350bp、482bp、576bp、642bp；其单独的PCR-电泳检测结果见附图4所示，mPCR-电泳检测结果见附图5所示；mPCR-DHPLC检测结果见附图6所示。
从由图4和图5可见，当这6种毒素基因作单一PCR扩增和电泳检测时，均能明显地检测出各自单一的条带；而当该6种毒素基因作复合PCR扩增和电泳检测时，576bp、642bp的扩增条带却无法分开；从图6可以看出，6种毒素基因的mPCR-DHPLC信号峰各自清晰可辨，显示出比mPCR-电泳更好的检测结果。
实施例3、检测方法特异性试验
取表1中所列的参考菌株，按照实施例1所建立的方法进行检测。
表1



取表1中所列试验菌种，经培养后分别提取基因组DNA，建立模板库。然后以这些基因组DNA为模板，分别采用第一复合PCR体系中的ETA、SEB、SEC、SEE、SEI、SEA六种毒素基因和第二复合PCR体系中的SEJ、ETB、TSST、SED、SEH、SEG六种毒素基因为目的基因采用实施例1所建立的条件进行mPCR-DHPLC分析检测。结果显示，在第一复合PCR反应体系中，仅产ETA的金黄色葡萄球菌菌株在2min出现ETA吸收峰，其他菌株均为阴性结果；产SEB的金黄色葡萄球菌菌株在3.6min出现SEB吸收峰，其他菌株均为阴性结果；产SEC的金黄色葡萄球菌菌株在4.7min出现SEC吸收峰，其他菌株均为阴性结果；产SEE的金黄色葡萄球菌菌株在5.4min出现SEE吸收峰，其他菌株均为阴性结果；产SEI的金黄色葡萄球菌菌株在5.7min出现SEI吸收峰，其他菌株均为阴性结果；产SEA的金黄色葡萄球菌菌株在7.8min出现SEA吸收峰，其他菌株均为阴性结果。在第二复合PCR反应体系中，产SEJ的金黄色葡萄球菌菌株在2.9min出现SEJ吸收峰，其他菌株均为阴性结果；产ETB的金黄色葡萄球菌菌株在3.9min出现ETB吸收峰，其他菌株均为阴性结果；产TSST的金黄色葡萄球菌菌株在6.6min出现TSST吸收峰，其他菌株均为阴性结果；产SED的金黄色葡萄球菌菌株在7.7min出现SED吸收峰，其他菌株均为阴性结果；产SEH的金黄色葡萄球菌菌株在8.5min出现SEH吸收峰，其他菌株均为阴性结果；产SEG的金黄色葡萄球菌菌株在8.9min出现SEG吸收峰，其他菌株均为阴性结果。
实施例4、灵敏度试验
将已知浓度的各种金黄色葡萄球菌产毒株，即以比浊度法确定的表2和表3中的L₀₁-L₀₈浓度的复合增菌液，按照权利要求1所建立的方法进行检测，确定各种产毒株肠毒素检测的灵敏度。
表2、第一组梯度稀释细菌数量表

表3第二组梯度稀释细菌数量表

灵敏度试验结果如附图7～10所示：
如附图7所示，第一组的mPCR-DHPLC可以检测到表2中L₀₄梯度：产ETA菌株170CFU/mL，产SEB菌株240CFU/mL，产SEC菌株190CFU/mL，产SEE菌株210CFU/mL，产SEI菌株710CFU/mL，产SEA菌株430CFU/mL，即可以检测到10²的数量级的菌浓度；而PCR-凝胶电泳却只能检测到L₀₂梯度(10⁴的数量级)的菌浓度，如附图8所示。
如附图9所示，第二组的mPCR-DHPLC可以检测到表2中L₀₈梯度：产SEJ菌株340CFU/mL，产ETB菌株610CFU/mL，产TSST菌株570CFU/mL，产SED菌株370CFU/mL，产SEH菌株290CFU/mL，产SEG菌株320CFU/mL，即可以检测到10²的数量级的菌浓度；而PCR-凝胶电泳却只能检测到L₀₆梯度(10⁴的数量级)的菌浓度，如附图10所示。
进行上述灵敏度检测的同时，对几种方法的检测灵敏度进行了比较，包括PCR-凝胶电泳法、胶体金免疫测试条法、VIDAS方法及实施例1所建立的mPCR-DHPLC法。几种检测方法比较的结果如表4和表5所示。
表4、第一组金黄色葡萄球菌毒素四种不同方法检测结果的比较

表5、第二组金黄色葡萄球菌毒素四种不同方法检测结果的比较

从上述比较的结果可见：PCR-DHPLC检测的灵敏度比其他四种方法的灵敏度都要高。
实施例5、模拟污染样品检测试验
在选供测试的食品样品中添加金黄色葡萄球菌产毒标准菌株，A模拟样品是在鱼糜中添加了金黄色葡萄球菌产ETA、SEB、SEC、SEE、SEI、SEA毒素株；B模拟样品是在鱼糜中添加了金黄色葡萄球菌产SEJ、ETB、TSST、SED、SEH、SEG毒素株，模拟样品直接增菌18～24h，按照实施例1所建立的方法提取其基因组，并进行检测。
A组模拟污染样品复合增菌金葡菌的接种量如表6所示：
表6、A组模拟污染样品复合增菌金葡菌的接种量

B组模拟污染样品复合增菌金葡菌的接种量如表7所示：
表7、B组模拟污染样品复合增菌金葡菌的接种量

附图11为A模拟样品复合增菌试验DHPLC检测结果，实验结果表明检测出这六种产毒素株。
图12为B模拟样品复合增菌试验DHPLC检测结果，实验结果表明检测出这六种产毒素株。
实施例6、本发明的试剂盒及检测方法在实际样品检测中应用
将实施例1所建立的试剂盒及多重PCR-DHPLC方法用于实际检验工作中，并与现有其他检测方法进行比较，验证检测方法的实用性和可靠性。自2007年12月至2008年6月的7个月期间，采用本研究建立的多重PCR-DHPLC方法快速筛选，同时采用国家标准的培养鉴定方法(GB/T 4789.10-2003)、胶体金和VIDAS方法进行验证比较，同时检测实际样品，共检测3840份样品。结果从所检测出的349株金黄色葡萄球菌中，用多重PCR-DHPLC方法筛选检出54株金黄色葡萄球菌产毒素株阳性(以毒素血清型统计)，采用胶体金和VIDAS方法进行验证，验证比较结果见表8。
目前市售的胶体金仅有金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C三种免疫测试条，VIDAS方法也仅能检测金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E五种肠毒素，且不能具体分型。
从三种方法的验证比较结果来看，本研究所建立的PCR-DHPLC方法具有鉴定的种类全，同时能进行分型检测的优势，显示该方法具有较好的适用性。
表8.不同检测方法验证对实际样品检测结果

对以PCR-DHPLC法所分离检测出的54份金黄色葡萄球菌产毒素株阳性样本，通过PCR-DHPLC方法进行了毒素分型检测，结果发现：从冻鳕鱼样品中分离出的287株金黄色葡萄球菌检测到毒素基因的有33株，占11.5％，同时携带2种及以上毒素基因的菌有4株，占1.4％；从肉制品中分离的37株金黄色葡萄球菌检测到毒素基因的有14株，占37.8％；从其它食品样品中分离的25株金黄色葡萄球菌检测到毒素基因的有7株，占28.0％。同时携带2种及以上毒素基因的菌有4株，占10.8％。其中，SEA毒素基因的最多，有29株，占53.7％，而含其它传统毒素基因类型SEB、SEC、SED基因的菌株只有6株，占11.1％(SEB、SEC、SED分别占3.7％、1.8％、5.6％)，没有检测到携带SEE、ETB、TSST基因的菌株。携带新发现的毒素基因SEG、SEH、SEI、SEJ和ETA的菌株较多，有19株，占35.2％，其中SEG基因的菌株3株，SEH基因的菌株7株，SEI基因的菌株3株，SEJ基因的菌株5株，ETA基因的菌株1株，分别占5.6％、13.0％、5.5％、9.3％和1.8％。