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1、(10)申请公布号 CN 102719464 A (43)申请公布日 2012.10.10 CN 102719464 A *CN102719464A* (21)申请号 201210205929.9 (22)申请日 2012.06.20 C12N 15/61(2006.01) C12N 15/10(2006.01) C12N 9/90(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (71)申请人 中山大学 地址 510275 广东省广州市新港西路 135 号 (72)发明人 陆勇军 周世宁 刘莉璇 黄雅莉 何。
2、磊 (74)专利代理机构 广州三环专利代理有限公司 44202 代理人 郝传鑫 杨磊 (54) 发明名称 一种新型非核糖体肽合成酶基因及其腺苷酰 化结构域的克隆和表达 (57) 摘要 本发明公开一种新型非核糖体肽合成酶基 因， 所述非核糖体肽合成酶基因命名为 NRPS114， 所述非核糖体肽合成酶基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO 1 所示 ； 同时， 本发明还公开了所述非核糖 体肽合成酶基因的制备方法， 含有非核糖体肽合 成酶基因的质粒 pCC1FOSTM Fosmid-NRPS114， 以 及所述非核糖体肽合成酶基因中的 5 个腺苷酰化 结构域的重组质粒 pET28a-A-2his 的。
3、表达载体。 另外， 本发明还公开了 5 种腺苷酰化结构域及其 制备方法， 将所述腺苷酰化结构域基因 A1、 A2、 A3、 A4、 A5 在大肠杆菌原核表达系统中过量表达， 得到重组腺苷酰化结构域， 具有较高的使氨基酸 发生腺苷酰化的活性， 为组合生物学的研究提供 更多的基因操作材料， 并在新药的研发中具有巨 大的应用前景。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 7 页 序列表 39 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 7 页 序列表 39 页 附图 5 页 1/2 页 2 1. 一种新型非核糖体肽合成酶基因，。
4、 其特征在于， 所述非核糖体肽合成酶基因命名为 NRPS114， 所述基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO 1 所示。 2. 一种如权利要求 1 所述新型非核糖体肽合成酶基因的制备方法， 其特征在于， 包括 以下步骤 ： 通过简并引物序列筛选的方法， 从南海深海沉积物大片段文库中获得 7 个阳性 克隆子， 挑选一个进行全长测序， 然后运用生物信息学软件对所得序列进行分析， 即可获得 所述非核糖体肽合成酶基因。 3. 一种由权利要求 1 所述基因编码的非核糖体肽合成酶， 其特征在于， 所述非核糖体 肽合成酶含有 5 个模块， 共 16 个结构域， 起始模块中含有 3 个结构域， 分别为腺苷酰化。
5、结构 域、 甲基转移酶结构域和酰基载体蛋白结构域 ； 第二模块、 第三模块和第五模块均为常规模 块， 均含有缩合结构域、 腺苷酰化结构域和酰基载体蛋白结构域 ； 第四模块含有两个缩合结 构域、 一个腺苷酰化结构域和一个酰基载体蛋白结构域 ； 末端模块即第五模块不含硫酯酶 结构域。 4. 一种含有如权利要求 1 所述非核糖体肽合成酶基因的重组质粒 pCC1FOSTM Fosmid-NRPS114。 5. 一种重组质粒 pET28a-A-2his， 其特征在于， 所述重组质粒 pET28a-A-2his 包 括分别含有如权利要求 3 中所述的五个腺苷酰化结构域的重组质粒 pET28a-A1-2hi。
6、s、 pET28a-A2-2his、 pET28a-A3-2his、 pET28a-A4-2his、 pET28a-A5-2his， 所述五个重组质粒 均采用以下方法制备所得 ： 分别根据五个腺苷酰化结构域的序列设计引物， 以权利要求 4 所述的重组质粒 pCC1FOSTMFosmid-NRPS114 为模板， 进行 PCR 扩增， PCR 产物经凝胶电泳并 回收产物 1， 凝胶回收产物 1 经限制性内切酶双酶切并回收产物 2， 质粒 pET28a 经双酶切后 与回收产物 2 连接， 获得连接产物， 即得五个重组质粒 pET28a-A1-2his、 pET28a-A2-2his、 pET28a。
7、-A3-2his、 pET28a-A4-2his 和 pET28a-A5-2his。 6. 一种表达菌株， 其特征在于， 所述表达菌株包括分别含有如权利要求 3 中所述的五 个腺苷酰化结构域基因的五个大肠杆菌 BL21-pET28a-A1-2his、 BL21-pET28a-A2-2his、 BL21-pET28a-A3-2his、 BL21-pET28a-A4-2his、 BL21-pET28a-A5-2his， 所述五个 大肠杆菌均采用以下方法构建所得 ： 采用化转法， 分别将权利要求 5 中所得的五 个重组质粒 pET28a-A1-2his、 pET28a-A2-2hispET28a-A。
8、3-2his、 pET28a-A4-2his、 pET28a-A5-2his 转化到大肠杆菌 BL21 感受态细胞中， 将细菌悬浮液恢复培养并稀释 涂布于卡那霉素抗性平板上培养， 挑取阳性转化子， 即得腺苷酰化结构域基因的表达 菌 株 大 肠 杆 菌 BL21-pET28a-A1-2his、 BL21-pET28a-A2-2his、 BL21-pET28a-A3-2his、 BL21-pET28a-A4-2his 和 BL21-pET28a-A5-2his。 7. 一种腺苷酰化结构域的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： （1） 按照权利要求 5 所述内容构建重组质粒 pET28a-A-。
9、2his ； （2） 将步骤 （1） 中构建的重组质粒按照权利要求 6 所述内容构建腺苷酰化结构域基因 表达载体大肠杆菌 ； （3） 目的蛋白腺苷酰化结构域的诱导表达 ： 将步骤 （2） 中构建得到的大肠杆菌涂布于 卡那霉素抗性平板上， 37倒置培养过夜， 挑取单克隆接种于含有 100g/mL 卡那霉素的 液体培养基， 37振荡培养过夜， 按体积比 1 ： 50 的比例转接至新鲜的卡那霉素液体培养 基， 于 37、 200rpm 培养至 OD600=0.50.6 ； 加入 0.1mmol/L IPTG， 16 ,140rpm 诱导培养 权 利 要 求 书 CN 102719464 A 2 2/。
10、2 页 3 20h ； 培养后经镍柱低压蛋白层析亲和纯化， 即得重组腺苷酰化结构域。 8. 如权利要求 7 所述的腺苷酰化结构域的制备方法， 其特征在于， 还包括以下步骤 ： （4） 目的蛋白的检测 ： 取3mL诱导后的菌液， 10,000g离心1min， 弃上清， 用500L水 洗 3 次， 用 500L10mM 咪唑裂解缓冲液重悬， 超声 3s， 停 3s， 连续超声 5min。菌体破碎液于 4， 12000g 离心 5min， 分别取上清和沉淀进行 SDS-PAGE 电泳分析， 分离胶浓度为 10， 浓缩胶浓度 5%。 9. 如权利要求 8 所述的腺苷酰化结构域的制备方法， 其特征在于，。
11、 还包括以下步骤 ： （5）目的蛋白的纯化 ： 取 2L 在 IPTG 终浓度为 0.1mM， 16诱导表达 20h 的菌液， 于 4 8000g 离心 3min， 收集菌体， 水洗 3 次后用裂解缓冲液重悬， 在 300W 功率下进行超声 破碎， 超声 5s， 停 5s， 连续超声 45min， 4 13000g 离心 20min， 取上清， 用 0.22m 滤膜过 滤上清除掉杂质 ； 将过滤后的上清总蛋白通入镍柱中， 收集流出液体 ； 将收集到的液体重 新上机， 重复 1 次 ； 分别用适量 20mM、 50mM、 100mM、 120mM、 140mM、 160mM、 180mM、 20。
12、0mM、 250mM 咪唑缓冲液上柱， 收集流出液， 用于 SDS-PAGE 蛋白电泳分析。 10. 一种采用如权利要求 7 所述方法得到的重组腺苷酰化结构域。 权 利 要 求 书 CN 102719464 A 3 1/7 页 4 一种新型非核糖体肽合成酶基因及其腺苷酰化结构域的克 隆和表达 技术领域 0001 本发明涉及一种新型非核糖体肽合成酶基因及其包含的五个腺苷酰化结构域基 因， 尤其是一种来自南海深海沉积物微生物的新型非核糖体肽合成酶基因及其包含的五个 腺苷酰化结构域基因。 背景技术 0002 非核糖体肽类是一大类由细菌或真菌的非核糖体肽合成酶合成的， 具有生物活性 的天然产物， 并且。
13、在生物体内具有较好的抗酶解和抗化学降解特性。 它的结构非常复杂， 种 类繁多。应用于临床上的非核糖体肽类非常多， 常见的有抗生素 （达托霉素） 、 抗肿瘤 （博来 霉素） 、 抗真菌药物或免疫抑制剂 （环孢霉素） 等。随着细菌耐药性的频频出现， 抗生素类药 物的储备越来越不足， 人类对新型抗生素的需求越来越迫切， 因此寻找新型非核糖体肽合 成酶基因具有十分重要的意义。 0003 非核糖体肽类通常需要一系列后修饰过程。 尽管其合成的模式和酶的催化方式都 非常保守， 但由于可利用的氨基酸底物非常丰富， 非核糖体肽合成酶自身结构的多样性， 使 它的种类远远超过以核糖体合成的肽类。 0004 非核糖体。
14、肽合成酶基因的操作潜力十分巨大， 运用组合生物学技术对模块进行重 排或者改造， 有望得到预期的多肽或者新的药物。达托霉素就是一种新开发的脂肽类抗生 素， 对革兰氏阳性细菌具有很强的抑制作用。组合抗生素已经成为传统药物的竞争者。 发明内容 0005 本发明的第一个目的在于提供一种能够产生非核糖体肽类的非核糖体肽合成酶 基因， 为组合生物学提供研究材料， 为新药的研发提供更多的候选化合物。 0006 为实现上述目的， 本发明采取的技术方案为 ： 一种新型非核糖体肽合成酶基因， 所 述非核糖体肽合成酶基因命名为NRPS114， 所述非核糖体肽合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 1 所示。 0。
15、007 本发明的第二个目的在于提供一种所述新型非核糖体肽合成酶基因的制备方法， 为实现此目的采取的技术方案为 ： 一种如上所述新型非核糖体肽合成酶基因的制备方法， 包括以下步骤 ： 通过简并引物序列筛选的方法， 从南海深海沉积物大片段文库中获得 7 个 阳性克隆子， 挑选一个进行全长测序， 然后运用生物信息学软件对所得序列进行分析， 即可 获得所述非核糖体肽合成酶基因。 0008 所述新型非核糖体肽合成酶基因 NRPS114 通过序列筛选的方法从南海深海沉积 物文库中获得， NRPS114 为一个 17202bp 大小的完整非核糖体肽合成酶基因， 利用 BLAST 在 线比对其核苷酸序列进行同。
16、源性搜索分析表明， 所述新型非核糖体肽合成酶基因 NRPS114 与已知基因相似性很低， 仅为 30% 左右。 0009 本发明的第三个目的在于提供一种由上述所述非核糖体肽合成酶基因编码的非 说 明 书 CN 102719464 A 4 2/7 页 5 核糖体肽合成酶， 所述非核糖体肽合成酶与已发现的同类蛋白的模板排列顺序不同， 它含 有 5 个模块， 共 16 个结构域， 起始模块中含有 3 个结构域， 分别为腺苷酰化结构域、 甲基转 移酶结构域和酰基载体蛋白结构域 ； 第二模块、 第三模块和第五模块均为常规模块， 均含有 缩合结构域、 腺苷酰化结构域和酰基载体蛋白结构域 ； 第四模块含有两。
17、个缩合结构域、 一个 腺苷酰化结构域和一个酰基载体蛋白结构域 ； 末端模块即第五模块不含硫酯酶结构域。 0010 本发明的第四个目的在于提供一种含有如上所述新型非核糖体肽合成酶基因的 重组质粒 pCC1FOSTM Fosmid-NRPS114。所述重组质粒 pCC1FOSTMFosmid-NRPS114 保存于大 肠埃希菌 EPI300 中。 0011 本 发 明 的 第 五 个 目 的 在 于 提 供 一 种 重 组 质 粒 pET28a-A-2his，所 述 重 组 质 粒 pET28a-A-2his 包 括 重 组 质 粒 pET28a-A1-2his、 pET28a-A2-2his、 。
18、pET28a-A3-2hispET28a-A4-2his、 pET28a-A5-2his， 所述五个重组质粒分别含有如上所述 的五个腺苷酰化结构域， 所述五个重组质粒均采用以下方法制备所得 ： 分别根据五个腺苷 酰化结构域的序列设计引物， 以权利要求 4 所述的重组质粒 pCC1FOSTMFosmid-NRPS114 为 模板， 进行 PCR 扩增， PCR 产物经凝胶电泳并回收产物 1， 凝胶回收产物 1 经限制性内切 酶双酶切并回收产物 2， 质粒 pET28a 经双酶切后与回收产物 2 连接， 获得连接产物， 即得 五个重组质粒 pET28a-A1-2his、 pET28a-A2-2hi。
19、s、 pET28a-A3-2his、 pET28a-A4-2his 和 pET28a-A5-2his。 0012 本发明的第六个目的在于提供一种表达菌株， 所述表达菌株包括大肠 杆菌 BL21-pET28a-A1-2his、BL21-pET28a-A2-2his、BL21-pET28a-A3-2his、 BL21-pET28a-A4-2his、 BL21-pET28a-A5-2his， 所述五个大肠杆菌分别含有如上所述 的五个腺苷酰化结构域基因， 所述五个大肠杆菌均采用以下方法构建所得 ： 采用化 转法， 分别将权利要求 5 中所得的五个重组质粒 pET28a-A1-2his、 pET28a-。
20、A2-2his、 pET28a-A3-2his、 pET28a-A4-2his、 pET28a-A5-2his 转化到大肠杆菌 BL21 感受态细胞中， 将细菌悬浮液恢复培养并稀释涂布于卡那霉素抗性平板上培养， 挑取阳性转化子， 即得腺 苷酰化结构域基因的表达菌株大肠杆菌 BL21-pET28a-A1-2his、 BL21-pET28a-A2-2his、 BL21-pET28a-A3-2his、 BL21-pET28a-A4-2his 和 BL21-pET28a-A5-2his。 0013 本发明的第七个目的在于提供一种腺苷酰化结构域的制备方法， 所述方法包括以 下步骤 ： 0014 （1） 。
21、重组质粒 pET 28a-A-2his 的构建 ： 根据 5 个腺苷酰化结构域基因的序列设计 引物， 以提取的质粒 pCC1FOSTM Fosmid-NRPS114 为模板， 进行 PCR 扩增， PCR 产物经凝胶电 泳并回收产物 1， 凝胶回收产物 1 经限制性内切酶双酶切并回收产物 2， 质粒 pET28a 经双酶 切后与回收产物 2 连接， 获得连接产物， 即重组质粒 pET 28a-A-2his ； 0015 （2）腺 苷 酰 化 结 构 域 基 因 表 达 菌 株 的 构 建 ： 采 用 化 转 法， 将 重 组 质 粒 pET28a-A-2his 转化到大肠杆菌 BL 21 感受。
22、态细胞中， 将细菌悬浮液恢复培养并稀释涂布 于卡那霉素抗性平板上培养， 挑取阳性转化子 ； 0016 （3） 腺苷酰化结构域的诱导表达 ： 将重组质粒转化的大肠杆菌涂布于卡那霉素抗 性平板上， 37倒置培养过夜， 挑取单克隆接种于卡那霉素抗性液体培养基， 37振荡培养 过夜， 按体积比 1 ： 50 的比例转接至新鲜的含有 100g/mL 卡那霉素抗性的液体培养基， 于 37、 200rpm 培养至 OD600=0.50.6 ； 加入 0.1mmol/L IPTG， 16 ,140rpm 诱导培养 20h ； 培 说 明 书 CN 102719464 A 5 3/7 页 6 养后经镍柱低压蛋白。
23、层析亲和纯化， 即得重组腺苷酰化结构域。 0017 将所述新型腺苷酰化结构域基因 A1、 A2、 A3、 A4、 A5 在大肠杆菌原核表达系统中过 量表达， 采用所述方法得到的重组腺苷酰化结构域， 具有较高的使氨基酸发生腺苷酰化的 活性， 为组合生物学的研究提供更多的基因操作材料， 并在新药的研发中具有巨大的应用 前景。 0018 作为本发明所述一种腺苷酰化结构域的制备方法的优选实施方式， 所述方法还包 括以下步骤 ：（4） 目的蛋白的检测 ： 取 3mL 诱导后的菌液， 10,000g 离心 1min， 弃上清， 用 500L 水洗 3 次， 用 500L10mM 咪唑裂解缓冲液重悬， 超声。
24、 3s， 停 3s， 连续超声 5min。菌 体破碎液于4， 12000g离心5min， 分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳分析， 分离胶浓 度为 10%， 浓缩胶浓度 5%。 0019 作为本发明所述一种腺苷酰化结构域的制备方法的优选实施方式， 所述方法还包 括以下步骤 ：（5） 目的蛋白的纯化 ： 取 2L 在 IPTG 终浓度为 0.1mM， 16诱导表达 20h 的菌 液， 于48000g离心3min， 收集菌体， 水洗3次后用裂解缓冲液重悬， 在300W功率下进行 超声破碎， 超声 5s， 停 5s， 连续超声 45min， 4 13000g 离心 20min， 取上清， 用 。
25、0.22m 滤 膜过滤上清除掉杂质 ； 将过滤后的上清总蛋白通入镍柱中， 收集流出液体 ； 将收集到的液 体重新上机， 重复 1 次 ； 分别用适量 20mM、 50mM、 100mM、 120mM、 140mM、 160mM、 180mM、 200mM、 250mM 咪唑缓冲液上柱， 收集流出液， 用于 SDS-PAGE 蛋白电泳分析。 0020 其中， 五个腺苷酰化结构域 A1、 A2、 A3、 A4、 A5 与 pET28a （+） 载体编码 2 个六联组氨 酸标签融合表达， 预测相对分子质量分别约为 106kDa、 64kDa、 63.3kDa、 61.7kDa 和 63kDa。 00。
26、21 另外， 本发明的最后一个目的在于提供一种采用如上所述方法制备得到的重组腺 苷酰化结构域。所述重组腺苷酰化结构域包括 A1、 A2、 A3、 A4、 A5， 所述重组腺苷酰化结构 域是腺苷酰化结构域基因 A1、 A2、 43、 A4、 A5 在大肠杆菌原核表达系统中表达后经镍柱低压 蛋白亲和层析的方法纯化得到， 所述 A1、 A2、 A3、 A4、 A5 具有腺苷酰化结构域保守的 10 个 核心模序， 即 L(S/T)YXEL、 LKAGXAY(V/L)P(L/Y)D、 LAYXXYTSG(S/T)TGXPKG、 FDXS、 NXYGPTE、 GELXIXGXG(V/L)ARGYL、 Y(。
27、R/K)TGDL、 GRXDXQVKIRGXRIELGEIE、 LPXYM(I/V)P、 NGK(V/L)DR。 0022 本发明为组合生物学提供了研究材料， 为新药的研发提供了更多的候选化合物。 附图说明 0023 图 1 为 NRPS114 主要 ORF 在基因上的排列图。 0024 图 2 为本发明所述含有非核糖体肽合成酶基因的南海深海沉积物克隆子序列的 开放阅读框分析结果。 0025 图 3 为本发明所述腺苷酰化结构域 A1、 A2、 A3、 A4、 A5 的表达载体的构建全过程的 琼脂糖凝胶电泳图谱。 0026 图 3 中， a 为 5 个腺苷酰化结构域 PCR 扩增、 pCC1FO。
28、STM Fosmid-NRPS114 及 pET28a 质粒的提取 ； b:pET28a 和 5 个 A 结构域的双酶切结果 ； c:5 个 A 结构域的 PCR 产物纯化结 果。 0027 图 4 为腺苷酰化结构域的诱导表达检测图谱。 0028 图 4 中， a ： 5 个腺苷酰化结构域的诱导表达 （上清） ； b ： 5 个腺苷酰化结构域的诱导 表达 （沉淀） 。 说 明 书 CN 102719464 A 6 4/7 页 7 0029 图 5 为 A1 结构域低压蛋白层析纯化结果。 0030 图 6 为 A2 结构域低压蛋白层析纯化结果。 0031 图 7 为 A3 结构域低压蛋白层析纯化。
29、结果。 0032 图 8 为 A4 结构域低压蛋白层析纯化结果。 0033 图 9 为 A5 结构域低压蛋白层析纯化结果。 0034 图 5、 6、 7、 8 和 9 中， M 为 Marker， 1 ： 未诱导 ； 2 ： 诱导 ； 3 ： 上清 ； 4 ： 穿流 ； 5 ： 20mM 洗 涤 ； 6 ： 超滤蛋白。 0035 图 10 为 5 个腺苷酰化结构域的 Western Blot 鉴定结果。 具体实施方式 0036 为更好的说明本发明的目的、 技术方案和优点， 下面结合附图和具体实施例对本 发明作进一步描述。 0037 实施例 1 0038 1、 新型非核糖体肽合成酶基因 NRPS。
30、114 的获得 0039 利用简并引物通过序列筛选的方法， 从南海深海沉积物文库中获得七个含有 NRPS 基因的克隆， 选择一个克隆进行全长测序， 测序由北京华大基因有限公司完成， 然后运用生 物信息学软件对所得序列进行分析， 如附图 1 和附图 2 所示。该序列含有一个 17202bp 的 完整非核糖体肽合成酶基因， 命名为 NRPS114。 0040 2、 根据腺苷酰化结构域的序列设计引物 A1F/A1R、 A2F/A2R、 A3F/A3R、 A4F/A4R、 A5F/A5R。 0041 3、 PCR 扩增 0042 0043 4、 PCR 程序如下 ： 0044 说 明 书 CN 102。
31、719464 A 7 5/7 页 8 0045 5、 腺苷酰化结构域基因扩增产物的凝胶回收 0046 按照 E.Z.N.A gel extraction kit 说明书中步骤进行胶回收。 0047 6、 质粒 pET28a 的提取 0048 将携带相应质粒的 E.coli 单克隆接种到 5mL 含 100g/mL 卡那霉素液体培养基 中， 37， 200rpm， 振荡培养过夜。按照 OMEGA 质粒提取试剂盒说明书中步骤提取质粒。 0049 7、 腺苷酰化结构域基因 PCR 产物及载体的双酶切和产物回收， 酶切产物经 1琼 脂糖凝胶电泳检测， 反应体系如下 ： 0050 体系如下 ： 0051。
32、 0052 酶切后的 PCR 产物和载体片段用试剂盒回收纯化后用于连接反应。 0053 8、 连接反应 0054 在0.2mL离心管中加入如下成分， 混匀后在16过夜连接， 连接产物保存于-20 备用或立即用于转化。 0055 0056 9、 转化 0057 (1)E.coli DH5 化转感受态的制备 0058 从新鲜培养的平板上挑取单个DH5菌落， 接种到3mL液体培养基中， 37剧烈振 说 明 书 CN 102719464 A 8 6/7 页 9 荡培养过夜。取 1mL 过夜培养物， 接种到含 100mL 液体培养基的 500mL 锥形瓶中， 37剧烈 震荡， 直到培养基中细菌浓度达到O。
33、D600为0.375-0.4。 将培养物转入两只50mL离心管中， 冰 上放置10min， 4,000rpm， 4离心15min， 弃上清。 将菌体悬浮于10-20mL预冷的0.1M CaCl2 溶液中， 冰上放置 20min。4,000rpm 离心 10min， 弃上清， 然后将细菌悬浮在 2mL0.1M CaCl2 溶液中。分装成每管 100L， 即可用于后续的转化实验。若不进行实验， 则缓慢滴入甘油 （灭菌） 至终浓度为 15%， 轻柔混匀， 将细菌分装成 0.5mL 每管， 立即液氮冷冻， 转入 -80冰 箱中储存， 可在两个月内使用。 0059 （2） E.coli DH5 的化转 。
34、0060 从 -80冰箱中取出分装好的感受态， 置冰上至刚好解冻， 立即分装， 每管 100L， 加入连接产物5L， 轻轻混匀， 冰上放置30min， 放入42热激90s， 迅速插冰上， 放 置 5min， 然后加入 500L 液体培养基， 37振荡培养 1h。各取 200L 涂布于卡那霉素抗 性平板上。37倒置培养 16-18h。 0061 （3） 阳性克隆的筛选和鉴定 0062 随机挑取转化子进行菌落 PCR， 采用克隆引物进行 PCR 扩增， 通过 PCR 扩增的效果 以检测重组质粒插入片段是否符合要求， 并选送部分克隆进行测序。 0063 10、 重组质粒的提取 0064 挑选经测序确。
35、认无误的克隆进行质粒提取， 按照 OMEGA 质粒提取试剂盒说明书中 步骤提取质粒。 0065 11、 重组表达菌株的构建 0066 将提取得到的重组质粒转化进 BL21 感受态细胞， 获得 BL21-pET28a-A-2his 表达 菌株。腺苷酰化结构域表达载体构建的全过程琼脂糖凝胶电泳如附图 3 所示。 0067 12、 目的蛋白的诱导表达 0068 将菌株 BL21-pET28a-A-2his 涂布于卡那霉素抗性平板上， 37倒置培养 16h。挑 取单克隆接种于卡那霉素液体培养基， 37振荡培养过夜 ； 按体积比 1 ： 50 的比例转接至 新鲜的卡那霉素液体培养基， 于 37、 200。
36、rpm 培养至 OD600=0.50.6 ； 加入 IPTG 至终浓度 0.1mM, 在 37条件下诱导 3h。取 3mL 诱导菌液， 10000g 离心 1min， 弃上清 ； 用 500L 水 洗 3 次， 用 500L10mM 咪唑裂解缓冲液重悬， 超声 3s， 停 3s， 连续超声 5min。菌体破碎液 于 4， 12,000g 离心 5min， 分别取上清和沉淀进行 SDS-PAGE 电泳分析。分离胶浓度为 10， 浓缩胶浓度为 5%， 如附图 4 所示。 0069 13、 目的蛋白腺苷酰化结构域的纯化 0070 （1） 总蛋白的提取 0071 取 2L 在 IPTG 终浓度为 0.。
37、1mM， 16诱导表达 20h 的菌液， 于 4 8000 x g 离心 3min， 收集菌体， 水洗 3 次后用裂解缓冲液重悬， 在 300W 功率下进行超声破碎， 每次超声时 间 5s， 间隔时间 5s， 连续超声 45min， 4 13000g 离心 20min， 取上清， 用 0.22m 滤膜过 滤上清除掉杂质， 即可用于蛋白纯化。 0072 （2） 镍柱低压蛋白亲和层析 0073 1） 将上清总蛋白通入镍柱中， 收集流出液体， 重复上机 1 次。 0074 2）分别用适量 20mM、 50mM、 100mM、 120mM、 140mM、 160mM、 180mM、 200mM、 25。
38、0mM 咪唑 缓冲液上柱， 收集流出液， 用于 SDS-PAGE 蛋白电泳分析， 如附图 5、 6、 7、 8 和 9 所示。 说 明 书 CN 102719464 A 9 7/7 页 10 0075 3） 洗脱完毕后， 依次通入适量水和 20% 的乙醇冲洗镍柱和导管并浸泡。 0076 2、 目的蛋白的脱盐和浓缩 0077 将洗脱下的目的蛋白加入到滤膜孔径为 30kDa 的超滤管中， 5000g 离心， 每次 15min， 弃去超滤管管底的液体， 直到滤膜上的液体少于 500L。 0078 3、 目的蛋白的 Western Blot 鉴定 0079 按照 分子克隆 （第三版） 操作。将膜置于化。
39、学发光印迹系统上， 打开软件使仪器 镜头进行自动对焦， 然后按 1:1 的比例混合化学发光底物 A 液和 B 液， 将其均匀滴到膜上， 启动软件进行曝光并拍照， 如附图 10 所示。 0080 最后所应当说明的是， 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保 护范围的限制， 尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明， 本领域的普通技术人员应当 理解， 可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质 和范围。 说 明 书 CN 102719464 A 10 1/39 页 11 0001 0002 序 列 表 CN 102719464 A 11 2/39 页 12。
40、 0003 序 列 表 CN 102719464 A 12 3/39 页 13 0004 序 列 表 CN 102719464 A 13 4/39 页 14 0005 序 列 表 CN 102719464 A 14 5/39 页 15 0006 序 列 表 CN 102719464 A 15 6/39 页 16 0007 序 列 表 CN 102719464 A 16 7/39 页 17 0008 序 列 表 CN 102719464 A 17 8/39 页 18 0009 序 列 表 CN 102719464 A 18 9/39 页 19 0010 序 列 表 CN 102719464 A 。
41、19 10/39 页 20 0011 序 列 表 CN 102719464 A 20 11/39 页 21 0012 序 列 表 CN 102719464 A 21 12/39 页 22 0013 序 列 表 CN 102719464 A 22 13/39 页 23 0014 序 列 表 CN 102719464 A 23 14/39 页 24 0015 序 列 表 CN 102719464 A 24 15/39 页 25 0016 序 列 表 CN 102719464 A 25 16/39 页 26 0017 序 列 表 CN 102719464 A 26 17/39 页 27 0018 序。
42、 列 表 CN 102719464 A 27 18/39 页 28 0019 序 列 表 CN 102719464 A 28 19/39 页 29 0020 序 列 表 CN 102719464 A 29 20/39 页 30 0021 序 列 表 CN 102719464 A 30 21/39 页 31 0022 序 列 表 CN 102719464 A 31 22/39 页 32 0023 序 列 表 CN 102719464 A 32 23/39 页 33 0024 序 列 表 CN 102719464 A 33 24/39 页 34 0025 序 列 表 CN 102719464 A 。
43、34 25/39 页 35 0026 序 列 表 CN 102719464 A 35 26/39 页 36 0027 序 列 表 CN 102719464 A 36 27/39 页 37 0028 序 列 表 CN 102719464 A 37 28/39 页 38 0029 序 列 表 CN 102719464 A 38 29/39 页 39 0030 序 列 表 CN 102719464 A 39 30/39 页 40 0031 序 列 表 CN 102719464 A 40 31/39 页 41 0032 序 列 表 CN 102719464 A 41 32/39 页 42 0033 序。
44、 列 表 CN 102719464 A 42 33/39 页 43 0034 序 列 表 CN 102719464 A 43 34/39 页 44 0035 序 列 表 CN 102719464 A 44 35/39 页 45 0036 序 列 表 CN 102719464 A 45 36/39 页 46 0037 序 列 表 CN 102719464 A 46 37/39 页 47 0038 序 列 表 CN 102719464 A 47 38/39 页 48 0039 序 列 表 CN 102719464 A 48 39/39 页 49 序 列 表 CN 102719464 A 49 1/5 页 50 图 1 说 明 书 附 图 CN 102719464 A 50 2/5 页 51 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102719464 A 51 3/5 页 52 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 102719464 A 52 4/5 页 53 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 102719464 A 53 5/5 页 54 图 8 图 9 图 10 说 明 书 附 图 CN 102719464 A 54 。