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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310638653.8 (22)申请日 2013.11.28 C12N 9/64(2006.01) (73)专利权人 青岛康原药业有限公司 地址 266300 山东省青岛胶州市营海工业园 康原药业有限公司 (72)发明人 刘乃山 李静洁 刘君 张晓涵 (54) 发明名称 一种高度纯化激肽释放酶的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种高度纯化激肽释放酶的方 法。本发明的技术方案是以猪胰为原料提取、 沉 淀猪胰制成丙酮粉后， 灵活运用醋酸提取、 丙酮沉 淀， 乙醚脱脂脱水， 氯化钠 - 氨水、 丙酮协同除杂， 离子交换树脂 DEAE- 。
2、琼脂糖快胶分步洗脱等传统 与现代相结合的蛋白纯化技术， 高度纯化激肽释 放酶。 本发明具有生产周期短， 对化学和热稳定性 好、 成本低的特点， 非常适用于规模化大生产。 (51)Int.Cl. 审查员 冯晓亮 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书2页 CN 103725664 B 2016.05.11 CN 103725664 B 1.一种高度纯化激肽释放酶的方法， 其特征在于， 该方法包括如下步骤： (1)醋酸提取： 将猪胰脏10Kg制成丙酮粉后， 加入30倍量的醋酸溶液， 搅拌提取， 离心， 得上清液29.8L； (2)丙酮沉淀： 收集上清液， 加。
3、入丙酮沉淀； 沉淀用丙酮、 乙醚脱脂、 脱水， 干燥， 得激肽 释放酶粗品93g； (3)氯化钠-氨水、 丙酮协同除杂： 将粗品用50倍量氯化钠溶液溶解， 用氨水调pH， 搅拌 混合， 过滤， 得滤液； 加入丙酮沉淀； 沉淀用丙酮、 乙醚洗涤， 干燥， 得激肽释放酶中间品60g； (4)离子交换层析： 将激肽释放酶中间品溶于20倍量的pH4.5的0.001mol/L醋酸缓冲液 中， 离心， 得上清液； 取上清液， 按110的体积比上DEAE-琼脂糖快胶柱吸附， 吸附平衡后， 用 含0.2mol/L氯化钠的0.01mol/L醋酸缓冲液洗脱至基线， 再用含0.35mol/L氯化钠的 0.01mol。
4、/L醋酸缓冲液洗脱， 收集洗脱液； 将洗脱液透析脱盐， 冻干， 得激肽释放酶精品42g。 权利要求书 1/1 页 2 CN 103725664 B 2 一种高度纯化激肽释放酶的方法 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 具体地说是以猪胰为原料提取、 沉淀猪胰制成丙酮粉 后， 灵活运用醋酸提取、 丙酮沉淀， 乙醚脱脂脱水， 氯化钠-氨水、 丙酮协同除杂， 离子交换树 脂DEAE-琼脂糖快胶分步洗脱等传统与现代相结合的蛋白纯化技术， 制备激肽释放酶。 背景技术 0002 激肽释放酶(kallikein)是从猪胰脏中分离纯化制得的天然酶类药物， 临床上又 称血管舒缓素， 具有舒展毛细血管和小。
5、动脉的作用， 在临床上常用来治疗高血脂， 防治脂肪 肝、 动脉粥样硬化、 高血压、 心绞痛等多种疾病， 它的开发具有重要的医学和社会价值。 在我 国， 激肽释放酶生产还存在很大的发展空间。 0003 传统的纯化激肽释放酶的工艺由于工艺复杂、 成本较高； 离子交换层析是目前是 适合激肽释放酶工业化生产的最普遍方法； 但通常需要采用多种进口离子交换介质对激肽 释放酶进行纯化， 不仅操作繁琐， 且因多次上柱使得回收率很低， 以最具有实用价值的周祖 萌等人的方法为例， 通过在pH7 .0、 pH5 .0、 pH6 .7条件下， 依次将所得样品上DEAE- Cellulose、 DEAE-Sepharo。
6、secl-6B， 得到了比活1500u/mg左右的激肽释放酶， 收率为40。 除此之外， 目前国际上大多采用阴离子交换， 结合阳离子交换， 最后加一步凝胶过滤层析， 并且离子交换过程中激肽释放酶的洗脱都采用改变pH的方式， 由于缓冲溶液的缓冲作用， 使得柱内pH改变缓慢， 周期延长， 耗费大量缓冲液， 以法国GrahamS.Bailey的纯化过程， 虽 然经三步纯化后， 激肽释放酶比活高达1254u/mg， 但收率只有28.4； 其次有采用离子交换 层析与亲和层析或疏水层析相结合， 步骤较多， 纯化周期较长且成本高昂， 以英国Talal S.EI.Thaher的纯化过程为例， 虽然收率达到87。
7、， 但激肽释放酶比活只有156.3u/mg； 再 次， 采用一种离子交换介质想要通过一次纯化就获得高纯度和高收率的激肽释放酶几乎是 不可能完成的任务， 以李立桓等利用Amberlite-CG50一步从胰酶中分离纯化激肽释放酶， 但其比活和收率分别只有107.4u/mg和12.1。 0004 而本发明是灵活运用醋酸提取、 丙酮沉淀， 乙醚脱脂脱水， 氯化钠-氨水、 丙酮协同 除杂， 离子交换树脂DEAE-琼脂糖快胶分步洗脱等传统与现代相结合的蛋白纯化技术， 使用 DEAE-琼脂糖快胶具有高流速、 高载量， 可以有效的缩短生产周期， 且对化学和热稳定性好， 产品的收率在同类工艺中处于领先地位； 而。
8、激肽释放酶分步洗脱的方法， 虽然不能达到国 际最高标准， 但是依然超过了临床用药的要求， 适合工业化生产。 发明内容 0005 本发明的目的是高度纯化从合格的猪胰脏中提取的激肽释放酶。 0006 本发明的技术方案是： 以猪胰为原料提取、 沉淀猪胰制成丙酮粉后， 灵活运用醋酸 提取、 丙酮沉淀， 乙醚脱脂脱水， 氯化钠-氨水、 丙酮协同除杂， 离子交换树脂DEAE-琼脂糖快 胶分步洗脱等传统与现代相结合的蛋白纯化技术， 高度纯化激肽释放酶。 本发明具有生产 周期短， 对化学和热稳定性好、 成本低的特点， 非常适用于规模化大生产。 包括如下步骤： 说明书 1/2 页 3 CN 103725664 。
9、B 3 0007 (1)醋酸提取： 将猪胰脏制成丙酮粉后， 加醋酸溶液搅拌提取， 离心， 得上清液； 0008 (2)丙酮沉淀： 收集上清液， 加入丙酮沉淀。 沉淀用丙酮、 乙醚脱脂、 脱水， 干燥， 得 激肽释放酶粗品； 0009 (3)氯化钠-氨水、 丙酮协同除杂： 将粗品用氯化钠溶液溶解， 用氨水调PH， 搅拌混 合， 过滤， 得滤液； 将滤液中加入丙酮沉淀。 沉淀用丙酮、 乙醚洗涤， 干燥， 得激肽释放酶中间 品； 0010 (4)离子交换层析： 将激肽释放酶中间品溶于1822倍量的0.00050.0015mol/L 醋酸缓冲液(pH4.5)中， 离心， 得上清液； 取上清液， 按1：。
10、 812的体积比上DEAE-琼脂糖快胶 柱吸附， 吸附平衡后， 用含0.150.25mol/L氯化钠的0.01mol/L醋酸缓冲液洗脱至基线， 再 用含0.250.45mol/L氯化钠的0.01mol/L醋酸缓冲液洗脱， 收集洗脱液； 将洗脱液透析脱 盐， 冻干， 得激肽释放酶精品。 具体实施方式 0011 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。 0012 实施例1 0013 所述的以猪胰为原料提取、 沉淀猪胰制成丙酮粉后， 灵活运用醋酸提取、 丙酮沉 淀， 乙醚脱脂脱水， 氯化钠-氨水、 丙酮协同除杂， 离子交换树脂DEAE-琼脂糖快胶分步洗脱 等传统与现代相结合的蛋白纯化技术， 制备激肽。
11、释放酶， 包括如下步骤： 0014 (1)醋酸提取： 将猪胰脏10Kg制成丙酮粉后， 加入30倍量的醋酸溶液， 搅拌提取， 离 心， 得上清液29.8L。 0015 (2)丙酮沉淀： 收集上清液， 加入丙酮沉淀。 沉淀用丙酮、 乙醚脱脂、 脱水， 干燥， 得 激肽释放酶粗品93g。 0016 (3)氯化钠-氨水、 丙酮协同除杂： 将粗品用50倍量氯化钠溶液溶解， 用氨水调PH， 搅拌混合， 过滤， 得滤液； ， 加入丙酮沉淀。 沉淀用丙酮、 乙醚洗涤， 干燥， 得激肽释放酶中间 品60g。 0017 (4)离子交换层析： 将激肽释放酶中间品溶于20倍量的0.001mol/L醋酸缓冲液 (pH4。
12、.5)中， 离心， 得上清液； 取上清液， 按110的体积比上DEAE-琼脂糖快胶柱吸附， 吸附平 衡后， 用含0.2mol/L氯化钠的0.01mol/L醋酸缓冲液洗脱至基线， 再用含0.35mol/L氯化钠 的0.01mol/L醋酸缓冲液洗脱， 收集洗脱液； 将洗脱液透析脱盐， 冻干， 得激肽释放酶精品 42g。 0018 以上所述， 仅是本发明的较佳实施例而已， 并非是对本发明作其它形式的限制， 任 何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等 效实施例。 但是凡是未脱离本发明技术方案内容， 依据本发明的技术实质对以上实施例所 作的任何简单修改、 等同变化与改型， 仍属于本发明技术方案的保护范围。 说明书 2/2 页 4 CN 103725664 B 4 。