人脐带间充质干细胞的制备方法.pdf

本发明公开了一种人脐带间充质干细胞的制备方法，由下述步骤组成：(1)将人脐带去除残留血液，剪碎，用胶原酶消化；(2)再加入胰酶消化；(3)消化液用筛网过滤，去除未消化组织；(4)将过滤后的消化液用磷酸缓冲液稀释；(5)离心，获得细胞；(6)将细胞接种于培养基内进行培养，得到大量人脐带间充质干细胞，本发明得到的细胞可以满足临床和实验研究的需要，为其将来的应用打下了基础。

1.  一种人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征是由下述步骤组成：
(1)将人脐带去除残留血液，剪碎，用胶原酶消化；(2)再加入胰酶消化；(3)消化液用筛网过滤，去除未消化组织；(4)将过滤后的消化液用磷酸缓冲液稀释；(5)离心，获得细胞；(6)将细胞接种于培养基内进行培养，得到大量人脐带间充质干细胞。

2.  根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征是所述将人脐带剪碎到1mm³的小块，所述加入胶原酶的重量为原料重量的0.05％-0.2％，消化温度为37℃，消化时间为30-60分钟。

3.  根据权利要求2所述的一种人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征是所述加入胶原酶的重量为原料重量的0.1％，所述消化时间为45分钟。

4.  根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征是所述加入胰酶的重量为原料重量的0.05％-0.2％，消化温度为37℃，消化时间为30-60分钟。

5.  根据权利要求4所述的一种人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征是所述加入胰酶的重量为原料重量的0.125％，所述消化时间为45分钟，在所述消化过程中用转子搅拌。

6.  根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征是所述消化液与磷酸缓冲液的体积比为1∶8-12。

7.  根据权利要求6所述的一种人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征是所述消化液与磷酸缓冲液的体积比为1∶10。

8.  根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征是所述离心时，离心机的转速为1000转-2000转/分钟，转10-20分钟。

9.  根据权利要求8所述的一种人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征是所述离心机的转速为1500转/分钟，转15分钟。

10.  根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征是所述细胞接种的培养基为无血清培养基。

人脐带间充质干细胞的制备方法
技术领域
本发明涉及一种脐带间充质干细胞的制备方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是来源于发育早期中胚层和外胚层的一类多能干细胞，最初在骨髓中发现，因其具有以下特点而日益受到人们的关注：(1)多向分化潜能。在体内/外特定的诱导条件下可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于组织工程。(2)造血支持和促植入。作为造血微环境主要细胞成分——基质细胞系的干/祖细胞，MSCs通过细胞对细胞的直接作用、分泌细胞外基质及多种细胞因子，实现对造血的精细调控，支持造血干祖细胞的生长。与造血干细胞共同移植可促进造血干祖细胞的植入，对于提高脐血移植成功率，拓宽脐血移植适用范围具有重要意义。(3)免疫调控。MSCs表达MHC-I类分子，不表达CD80，CD86，HLA-DR等协同刺激分子，体外可抑制混合淋巴细胞反应，体内诱导免疫耐受，对于预防和治疗异基因造血细胞移植后引起的移植物抗宿主病，诱导器官移植免疫耐受有较好的应用前景。(4)自我复制。MSCs作为干细胞可以自我复制，体外扩增、增殖能力强，可以作为基因操作的干细胞平台，在基因治疗中有着十分诱人的前景。
目前MSCs的主要来源为成人骨髓，但成人骨髓源MSCs细胞数量及增殖分化潜能随年龄的增大而下降，病毒感染率较高，且供者MSCs的采集须行骨髓穿刺术，来源受到限制，寻找新的MSCs来源是目前国内外干细胞研究的热点。研究发现，MSCs在人胎儿和生后多种组织广泛存在，包括骨膜、脂肪、羊水、真皮、牙、骨骼肌、胎肺、胎肝、脐血和脐带等。关于脐血MSCs的报道存在较多争议，且脐血MSCs的分离会损失脐血中造血干祖细胞，影响脐血冻存。脐带来源广泛，便于取材，对供者无不利影响，无道德伦理问题的限制，且脐带可望作为自体MSCs来源于脐血共同移植提高脐血移植成功率，因此，脐带MSCs有望成为骨髓MSCs的理想替代来源。新近Yuri A等提出脐带中MSCs存在于内皮和内皮下，可采用内皮消化法从胎儿脐带中分离出MSCs。但采用内皮消化法，只有30％的脐带标本可以得到MSCs，70％的标本不能得到可多次传代的MSCs。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种高效的人脐带间充质干细胞的制备方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征是由下述步骤组成：
(1)将人脐带去除残留血液，剪碎，用胶原酶消化；(2)再加入胰酶消化；(3)消化液用筛网过滤，去除未消化组织；(4)将过滤后的消化液用磷酸缓冲液稀释；(5)离心，获得细胞；(6)将细胞接种于培养基内进行培养，得到大量人脐带间充质干细胞。
人脐带剪碎最好是0.05-1.5mm³的小块。
加入胶原酶的重量为原料重量的0.05％-0.2％，优选的是0.1％，消化温度为37℃，消化时间为30-60分钟，优选的是45分钟。
加入胰酶(Sigma，USA)的重量为原料重量的0.05％-0.2％，优选的是0.125％，消化温度为37℃，消化时间为30-60分钟，优选的是45分钟，在消化过程中可以选用转子搅拌。
筛网可以前后用100目、200目筛网。
将过滤后的消化液用磷酸缓冲液(PBS)稀释，消化液与磷酸缓冲液的体积比为1∶8-12，最好是1∶10。
在离心时，离心机的转速为1000转-2000转/分钟，转10-20分钟，优选1500转/分钟，转15分钟。
细胞接种的培养基为无血清培养基。
本发明的优点：
本发明的一种人脐带间充质干细胞的制备方法，操作简单易行。90％足月脐带可以分离出丰富的MSCs，且可在5周扩增得到1×10⁹MSCs细胞，本方法得到的脐带MSCs可在体外大量扩增，可满足临床和实验研究的需要。
附图说明
图1为MSCs的细胞形态；
图2为脐带来源的MSCs的细胞生长曲线；
图3为脐带来源的MSCs的细胞周期分析；
图4为脐带来源的MSCs向成骨细胞和脂肪细胞的诱导分化；
图5为RT-PCR分析脐带来源的MSCs细胞因子的表达情况；
图6为脐带来源的MSCs对造血CD34+细胞的支持作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
细胞的分离和培养
(1)将人脐带由磷酸缓冲液(PBS)反复冲洗，去除残留的血液，剪碎至约1mm³的小块，加入原料重量0.1％的胶原酶，37℃消化45分钟；(2)加入原料重量0.125％的胰酶(Sigma，USA)37℃消化45分钟，在消化过程中用转子搅拌，加入适量的血清终止胰酶的作用；(3)消化液用筛网过滤，先后用100目及200目的滤网过滤，去除未消化的组织；(4)将过滤后的消化液用磷酸缓冲液稀释，消化液与磷酸缓冲液比例为1∶10比例；(5)离心，获得细胞，离心机的转速为1500rpm/min离心15min，获得细胞；(6)细胞按1～2×10⁴/cm²接种于25ml塑料培养瓶，用10ml无血清培养基(江西协和干细胞公司)，置37℃，5％CO₂培养箱培养，4-5天后换液，弃去非贴壁细胞，以后每3-4天半量换液。待细胞80％融合，0.25％胰酶消化，按1∶3传代。
实施例2
(1)将人脐带由磷酸缓冲液(PBS)反复冲洗，去除残留的血液，剪碎至约0.05mm³的小块，加入原料重量0.05％的胶原酶，37℃消化60分钟；(2)加入原料重量0.05％的胰酶(Sigma，USA)37℃消化60分钟，在消化过程中用转子搅拌，加入适量的血清终止胰酶的作用；(3)消化液用筛网过滤，先后用100目及200目的滤网过滤，去除未消化的组织；(4)将过滤后的消化液用磷酸缓冲液稀释，消化液与磷酸缓冲液比例为1∶8比例；(5)离心，获得细胞，离心机的转速为1000rpm/min离心20min，获得细胞；(6)细胞按1～2×10⁶/cm²接种于75ml塑料培养瓶，用30ml无血清培养基(Stemcell公司，Germany)，置37℃，5％CO₂培养箱培养，4-5天后换液，弃去非贴壁细胞，以后每3-4天半量换液。待细胞80％融合，0.25％胰酶消化，按1∶3传代。本方法获得的细胞数与成功率明显高于依照文献内皮消化的普通方法。
实施例3
(1)将人脐带由磷酸缓冲液(PBS)反复冲洗，去除残留的血液，剪碎至约1.5mm³的小块，加入原料重量0.2％的胶原酶，37℃消化30分钟；(2)加入原料重量0.2％的胰酶(Sigma，USA)37℃消化30分钟，在消化过程中用转子搅拌，加入适量的血清终止胰酶的作用；(3)消化液用筛网过滤，先后用100目及200目的滤网过滤，去除未消化的组织；(4)将过滤后的消化液用磷酸缓冲液稀释，消化液与磷酸缓冲液比例为1∶12比例；(5)离心，获得细胞，离心机的转速为2000rpm/min离心10min，获得细胞；(6)细胞按1～2×10⁶/cm²接种于25ml塑料培养瓶，用15ml无血清培养基(Gibco公司，USA)，置37℃，5％CO₂培养箱培养，4-5天后换液，弃去非贴壁细胞，以后每3-4天半量换液。待细胞80％融合，0.25％胰酶消化，按1∶3传代。本方法获得的细胞数与成功率明显高于依照文献内皮消化的普通方法。
实施例4
细胞形态学观察
采用本方法分离的原代细胞多于24-48小时内贴壁，培养1-2周，倒置显微镜可见贴壁细胞呈梭形、多角形，2周以后增长速度较快，成为形态相对均一的梭形细胞，呈平行排列生长或旋涡状生长，于第2-3周可形成80％融合贴壁细胞层。连续传20代，细胞形态无明显改变。而采用文献报道的内皮消化法只有30％标本可以分离出MSCs，70％标本贴壁细胞穿代不能超过2代。(图1)
图1为脐带来源的MSCs的细胞形态。(A-C)、采用本方法获得的MSCs培养7天后的细胞形态；(D，E)、MSCs传第一代14-20天后的细胞形态；(F，G，H)MSCs传第二代第1、3、5天的细胞形态；(I-L)、传统内皮消化法获得MSCs培养的细胞形态，传二代后细胞形态发生变化。
实施例5
细胞生长曲线的测定
将贴壁细胞用0.25％胰酶消化后，按2×10⁴细胞/孔接种在24孔板内，每隔24h消化3个孔，收集细胞，并用0.4％的胎盼兰计数活细胞，绘制生长曲线。
细胞增殖较快，在对数生长期，细胞倍增时间均约为30h(图2)。细胞每传一代，细胞数约增长2倍。
图2为脐带来源的MSCs的细胞生长曲线。第三代MSCs按2×10⁴细胞/孔接种在24孔板内，每隔24h消化3个孔，收集细胞，并用0.4％的胎盼兰计数活细胞，取5次实验结果的平均值，绘制生长曲线。
实施例6
细胞周期的测定
在细胞生长的对数期，消化细胞，冷70％乙醇4℃固定并透膜24h，10μg/mL的RNaseA37℃孵育30min，加入50μg/mL碘化丙啶4℃避光孵育5min，流式细胞仪(FACA Calibur型，USA)检测，ModiFIT软件分析结果。
流式细胞仪分析细胞周期显示，超过80％的细胞处于G₀/G₁期，S+G₂+M期的细胞仅占14％(图3)
图3为脐带来源的MSCs的细胞周期分析。78.84％细胞在G0-G1期和11.16％细胞在S+G2+M期。
实施例7
体外诱导分化
1.向成骨细胞诱导分化细胞以2×10⁴/孔的密度接种于25cm²塑料培养瓶和六孔板，诱导分化体系为含1.0×10^-8M地塞米松，2.0×10^-4M抗坏血酸，7.0×10^-3Mβ-磷酸甘油的IMDM培养基，每3天半量换液一次。第14天用Von Kossa染色检测钙化基质沉淀。成骨诱导第14天试验组Von-Kossa染色可见细胞间布满黑色颗粒，颗粒大小不均一，提示有矿化基质沉积，未加成骨诱导培养基的对照组细胞Von-Kossa染色未见黑色矿化物沉积(图4A)。
2.向脂肪细胞诱导分化细胞以2×10⁴/孔的密度接种在25cm²塑料培养瓶和六孔板，诱导分化体系为含10％FCS、10^-6M地塞米松、100μg/mL1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤(IBMX)、50μg/mL抗坏血酸的IMDM培养基。每3天半量换液一次。倒置显微镜下观察脂肪滴的形成，第14天采用油红O染色检测脂肪滴。脂肪诱导7天倒置显微镜下即可见胞浆内脂滴形成，第14天油红-O染色呈强阳性，未加脂肪诱导培养基的对照组细胞无脂滴形成，油红-O染色阴性(图4B)。
3.RT-PCR检测分化结果经诱导的细胞和对照(未经诱导)细胞用RT-PCR检测培养第14天脂蛋白酯酶(LPL)和骨桥蛋白(OPN)基因表达，鉴定贴壁细胞成脂肪和成骨分化潜能。Trizol试剂盒(Sangon公司)提取总RNA。所用引物分别为：脂蛋白酯酶(lipoproteinlipase，LPL；298bp)：5’-ATG GAG AGC AAA GCC CTG CTC-3’；6’-TAC AGG GCG GCC ACAAGT TTT；骨桥蛋白(osteopontin，OPN；330bp)：5’-CTA GGC ATC ACC TGT GC CAT ACC-3’；5’-CAG TGA CCA GTT CAT CAG ATT CAT C-3’；β2-微球蛋白(β2-microglobulin，β₂M；115bp)：5’-ACC CCC ACT GAA AAA GAT GA-3’；5’-ATC TTC AAA CCT CCA TGA TG-3’。PCR条件为：95℃ 10min，94℃变性50s，58℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次，最后72℃延伸10min。
RT-PCR结果证实上述被诱导的贴壁细胞分别表达脂肪形成及骨形成特异性基因脂蛋白酯酶和骨桥蛋白基因，而对照组细胞无表达(图4C)。
图4为脐带来源的MSCs向成骨细胞和脂肪细胞的诱导分化。A：脐带来源的MSCs向成骨细胞的分化；B：脐带来源的MSCs向脂肪细胞的分化；C：脂蛋白酯酶和骨桥蛋白基因的诱导表达。
实施例8
造血支持
1.造血因子分泌
采用RT-PCR方法检测脐带MSC细胞因子分泌。引物设计如下.PCR条件为：95℃10min，94℃变性50s，58℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次，最后72℃延伸10min。RT-PCR结果显示脐带MSC表达SCF，TPO，FL，IL-6，IL-11，SDF-1，VEGF，不表达IL-3(图5)。
Gene                  Primer sequence
lipoprotein lipase    S：5’-ATGGAGAGCAAAGCCCTGCTC-3’
                      A：5’-TACAGGGCGGCCACAAGTTTT-3’
Osteopontin           S：5’-CTAGGCATCACCTGTGCCATACC-3’
                      A：5’-CAG TGACCAGTTCATCAGATTCATC-3’
SCF                   S：5’-CTCCTATTTAATCCTCTCGTC-3’
                      A：5’-TACTACCATCTCGCTTATCCA-3’
TPO                   S：5’-TGGAGCCCAACAACCTATCTC-3’
                      A：5’-GGGCTGAAAGGCACATTTGGT-3’
FL                    S：5’-CCTCCTTGGGGCCCTGCAGAGCCT-3’
                      A：5’-GGGTGGAGCTGGACCACAGGG-3’
M-CSF                 S：5’-TGA GAG GCA GTC CGA GGG AT-3’
                      A：5’-GAA TTC CCT CTA CAC TGG CA-3’
IL-3                  S：5’-ATGAGCCGCCTGCCCGTCCTG-3’
                      A：5’-GCGAGGTCAAAGTCGTCTGTTG-3’
IL-6                  S：5’-GTAGCCGCCCCACACAGACAGCC-3’
                      A：5’-GCCATCTTTGGAAGGTTCAGG-3’
GM-CSF                S：5’-GTCTCCTGAACCTGAGTAGAGACA-3’
                      A：5’-AAGGGGATGACAAGCAGAAAGTCC-3’
G-CSF                 S：5’-AGCTTCCTGCTCAAGTGCTTAGAG-3’
                      A：5’-TTCTTCCATCTGCTGCCAGATGGT-3’
SDF-1                 S：5’-CCCTTCAGATTGTAGCCCGG-3’
                      A：5’-CGATCCCAGATCAATGTGCC-3’
VEGF                  S：5’-TCGGGCCTCCGAAACCATGA-3’
                      A：5’-CCTGGTGAGAGATCTGGTTC-3’
β₂-MG    S：5’-TCTGGCCTTGAGGCTATCCAGCGT-3’
         A：5’-GTGGTTCACACGGCAGGCATACTC-3’
图5为RT-PCR分析脐带来源的MSCs细胞因子的表达情况。
2.支持造血
第三代MSCs 2.0×10⁴/孔种于24孔板，⁶⁰C₀20Gy照射后种脐血CD34+细胞2.0×10⁴，共同培养8周，每周半量换液，换出的细胞种于甲基纤维素完全培养基，培养两周后计数集落，大于等于50个细胞为一个集落。对照组为未铺贴璧细胞单独脐血CD34+细胞培养组和成人骨髓来源MSC与脐血CD34+细胞共同培养组。
细胞培养集落计数结果显示：单独脐血CD34+细胞培养组两周即无集落形成，而脐带MSC和脐血CD34+细胞共同培养组可维持6周尚可有集落形成，各周集落形成率与骨髓和脐血CD34+细胞共同培养组无差异，提示脐带MSC具有支持长期造血的能力(图6)。
图6为脐带来源的MSCs对造血CD34+细胞的支持作用。脐带来源的MSCs和造血CD34+细胞共培养，每周取悬浮细胞再进行半固体培养，对集落记数绘图。
结论：
1.本研究建立了从人足月脐带中分离出间充质干细胞的方法，操作简单易行，可从90％脐带标本中分离出丰富的MSCs，5周即可得到1×10⁹MSCs，可满足临床和实验对脐带间充质干细胞研究。
2.脐带间充质干细胞体外易扩增，增殖能力强，免疫表型与骨髓来源充质干细胞、体外具多向分化功能、细胞因子分泌丰富、具有长期造血支持的功能，是骨髓间充质干细胞理想的替代来源。