5′核苷酸酶诊断试剂盒及5′核苷酸酶活性浓度测定方法.pdf

本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的5′核苷酸酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定5′核苷酸酶活性浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括：缓冲液、还原型辅酶、核苷单磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸、丙酮酸羧化酶、甲醛脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的速度，从而测算出5′核苷酸酶的活性浓度大小。

1.  一种利用酶比色法及酶联法技术的5’核苷酸酶活性浓度测定方法，其方法原理如下：
核苷单磷酸+水  5′核苷酸酶  核苷+磷酸根
磷酸根+腺苷二磷酸+草酰乙酸  丙酮酸羧化酶  腺苷三磷酸+
                                     丙酮酸+二氧化碳
二氧化碳+还原型辅酶  甲醛脱氢酶  甲酸+辅酶
核苷可以是腺苷、肌苷、尿苷。
将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出5’核苷酸酶的活性浓度大小结果。

2.  一种5’核苷酸酶诊断试剂盒，主要成分包括：
缓冲液            20——500mmol/L
稳定剂            1——4000mmol/L
还原型辅酶        0.1——0.35mmol/L
丙酮酸羧化酶      1000——80000U/L
甲醛脱氢酶        1000——80000U/L
核苷单磷酸        1——50mmol/L
腺苷二磷酸        1——50mmol/L
草酰乙酸          1——50mmol/L
试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会反应作用。
其特征在于：试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

3.  根据权利要求2所述5’核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸羧化酶、甲醛脱氢酶、核苷单磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸组成单剂试剂。

4.  根据权利要求2所述5’核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸羧化酶、甲醛脱氢酶、核苷单磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、核苷单磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸羧化酶、甲醛脱氢酶组成。还原型辅酶、丙酮酸羧化酶、甲醛脱氢酶、核苷单磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。

5.  根据权利要求2所述5’核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸羧化酶、甲醛脱氢酶、核苷单磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、核苷单磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、甲醛脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸羧化酶组成。还原型辅酶、丙酮酸羧化酶、甲醛脱氢酶、核苷单磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。

6.  根据权利要求2所述5’核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于：还包括稳定剂1-4000mmol/L或0.1％-100％体积比。所述稳定剂为：硫酸铵(AmmoniaSulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐剂中的至少一种。

5’核苷酸酶诊断试剂盒及5’核苷酸酶活性浓度测定方法
技术领域
本发明涉及一种5’核苷酸酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定5’核苷酸酶活性浓度的方法，属于医学检验测定技术领域。
背景技术
医学研究表明，5’-核苷酸酶(5NT)增高主要见于阻塞性黄胆，也可见于肝癌和肝炎。在胆汁淤积并发胆管炎、原发性和继发性胆汁性肝硬化和慢性肝炎时，5NT升高率高于碱性磷酸酶；肝肿瘤和肝肉芽肿时5NT升高的敏感性高于碱性磷酸酶。因为5’-核苷酸酶活性无生理性升高，对于诊断婴幼儿肝病和妊娠性肝功胆汁淤积较碱性磷酸酶不但敏感，而且有特异性。因此测定5’-核苷酸酶的活性对于疾病的诊断具有重要意义。
5’-核苷酸酶的活性测定方法很多，主要有同位素底物法、化学强酸测磷法(1925年)。据申请人了解，目前国际上普遍采用同位素底物测试法，方法为：5’-核苷酸酶作用于H³-dUMP，终止反应后，通过离子交换层析柱分析结果，求得5’-核苷酸酶活性。或者利用5’-核苷酸酶作用于单磷酸腺苷后产生无机磷，再用化学强酸法分析无机磷含量得以计算出5’-核苷酸酶的活性。
同位素底物法方法复杂还有同位素污染，而且需要同位素测定仪，因此难以切实推广应用。无机磷测定法是1925年发明的方法，准确度不好，强酸污染环境等等，也不适合推广应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定5’核苷酸酶活性浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的5’核苷酸酶诊断试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行5’核苷酸酶活性浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明5’核苷酸酶活性浓度测定方法原理如下：
核苷单磷酸+水5′核苷酸酶核苷+磷酸根
磷酸根+腺苷二磷酸+草酰乙酸丙酮酸羧化酶腺苷三磷酸+
                                  丙酮酸+二氧化碳
二氧化碳+还原型辅酶甲醛脱氢酶甲酸+辅酶
核苷可以是腺苷、肌苷、尿苷。
这种方法应用5’核苷酸酶(5′Nucleotidase EC 3.1.3.5)酶(偶)联丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase；EC 6.4.1.1)、甲醛脱氢酶(formate dehydrogenase；EC 1.2.1.2；EC 1.2.1.43)酶促反应连续监测法。5’核苷酸酶酶解核苷单磷酸反应产生磷酸根，再通过(偶)联合丙酮酸羧化酶、甲醛脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算5’核苷酸酶的活性浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明5’核苷酸酶诊断试剂较为理想：
缓冲液            100mmol/L
稳定剂            500mmol/L
还原型辅酶        0.25mmol/L
丙酮酸羧化酶        10000U/L
甲醛脱氢酶          10000U/L
核苷单磷酸          9mmol/L
腺苷二磷酸          7mmol/L
草酰乙酸            8mmol/L
本发明的5’核苷酸酶诊断试剂盒可以是单剂，包括：
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸羧化酶、甲醛脱氢酶、核苷单磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、核苷单磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸。
试剂2
缓冲液、稳定剂、丙酮酸羧化酶、甲醛脱氢酶。
还原型辅酶、丙酮酸羧化酶、甲醛脱氢酶、核苷单磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、核苷单磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸。
试剂2
缓冲液、稳定剂、甲醛脱氢酶。
试剂3
缓冲液、稳定剂、丙酮酸羧化酶。
还原型辅酶、丙酮酸羧化酶、甲醛脱氢酶、核苷单磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定5’核苷酸酶活性浓度的方法，其还原型辅酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH中的一种。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的5’核苷酸酶诊断试剂为单试剂，包括：
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           500mmol/L
还原型辅酶                       0.25mmol/L
丙酮酸羧化酶                     10000U/L
甲醛脱氢酶                       10000U/L
核苷单磷酸                       9mmol/L
腺苷二磷酸                       7mmol/L
草酰乙酸                         8mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测5’核苷酸酶样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值-4180。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出5’核苷酸酶的活性浓度大小。
实施例二
本实施例的5’核苷酸酶诊断试剂为双试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           50mmol/L
还原型辅酶                       0.25mmol/L
核苷单磷酸                       9mmol/L
腺苷二磷酸                       7mmol/L
草酰乙酸                         8mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           500mmol/L
丙酮酸羧化酶                     10000U/L
甲醛脱氢酶                       10000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测5’核苷酸酶样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值-2170。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出5’核苷酸酶的活性浓度大小。
实施例三
本实施例的5’核苷酸酶诊断试剂为三试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           50mmol/L
还原型辅酶                       0.25mmol/L
核苷单磷酸                       9mmol/L
腺苷二磷酸                       7mmol/L
草酰乙酸                         8mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           500mmol/L
甲醛脱氢酶                       10000U/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           500mmol/L
丙酮酸羧化酶                     10000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。
测定5’核苷酸酶活性浓度时，在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测5’核苷酸酶样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值-2170。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出5’核苷酸酶的活性浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明：采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(ΔA/min)≤0.0007；吸光度时间反应曲线应呈直线下降；试剂可测有效(R≥0.99)线形范围可达500U/L；试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±5％；试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)≤3％；试剂在2-8℃下保存，活性可以稳定一年；——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，稳定期长，足以便于推广应用。