《一种产葡萄糖转苷酶的黑曲霉突变菌株.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种产葡萄糖转苷酶的黑曲霉突变菌株.pdf（6页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510996318.4 (22)申请日 2015.12.25 CCTCC NO ： M2015682 2015.11.18 C12N 1/14(2006.01) C12N 9/10(2006.01) C12R 1/685(2006.01) (71)申请人 青岛蔚蓝生物集团有限公司 地址 266061 山东省青岛市崂山区苗岭路 29 号山东高速大厦 12A07 (72)发明人 徐晓东 张珍珍 刘文瑶 刘安邦 (74)专利代理机构 青岛海昊知识产权事务所有 限公司 37201 代理人 曾庆国 (54) 发明名称 一种产葡萄糖转苷酶的黑曲。
2、霉突变菌株 (57) 摘要 本发明的目的是提供一株高产葡萄糖转苷 酶的黑曲霉突变菌株， 是通过紫外诱变的方法获 得的。本发明的黑曲霉突变菌株， 其保藏号为 CCTCCNO ： M2015682。本发明通过紫外诱变筛选获 得一株黑曲霉突变菌株 Su-T2。该菌株在摇瓶发 酵条件下， 产葡萄糖转苷酶活力达到 4.08u/ml， 比出发菌株提高了 61.9； 在 30L 发酵罐条件下， 该菌株产葡萄糖转苷酶活力达到 10.73u/ml， 比 出发菌株提高了 71.4。该突变菌株可广泛应用 于葡萄糖转苷酶的生产， 为该酶的利用奠定了基 础。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人。
3、民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 CN 105505787 A 2016.04.20 CN 105505787 A 1.一株黑曲霉突变菌株， 其特征在于， 所述的突变株的保藏号为CCTCCNO： M2015682。 2.如权利要求1所述的黑曲霉突变菌株， 其特征在于， 所述的黑曲霉突变菌株是通过紫 外诱变方法获得的。 3.权利要求1所述的黑曲霉突变菌株在生产葡萄糖转苷酶中的应用。 4.一种生产葡萄糖转苷酶的方法， 其特征在于， 所述的方法是用权利要求1所述的黑曲 霉突变菌株发酵来制备的。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105505787 A 2 一种。
4、产葡萄糖转苷酶的黑曲霉突变菌株 技术领域 0001 本发明属于基因工程技术领域， 具体内容涉及一种产葡萄糖转苷酶的黑曲霉突变 菌株及其应用。 技术背景 0002 葡萄糖转苷酶可专一性地切开糖类底物分子中非还原端的 -1,4糖苷键， 释放出 葡萄糖， 或将游离出的葡萄糖残基以 -1,6糖苷键转移到另一个糖类底物上， 从而得到非发 酵性的低聚异麦芽糖(简称IMO， 主要包括异麦芽糖、 潘糖、 异麦芽三糖及四糖以上的低聚 糖)、 糖脂或糖肽等。 在低聚异麦芽糖的生产中， 利用葡萄糖转苷酶的水解作用和其转苷作 用是生产低聚异麦芽糖的关键。 因此葡萄糖转苷酶倍受国内外食品工业界的重视。 0003 葡萄糖。
5、转苷酶在自然界中分布广泛， 种类繁多， 性质各异， 几乎存在于所有生物体 内， 在人类的糖原降解及动物、 植物和微生物的糖类代谢方面具有重要的生理功能。 目前， 国内葡萄糖转苷酶的用量虽然很大， 但由于成本过高而难以实现工业化生产， 仍然依赖进 口， 这些限制因素也导致国内IMO的生产受到严重kj制约。 本领域亟需获得高活性的葡萄糖 转苷酶及其相应的稳定、 高产的生产菌株。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一株高产葡萄糖转苷酶的黑曲霉突变菌株， 是通过紫外诱变 的方法获得葡萄糖转苷酶产量明显提升的黑曲霉突变菌株， 为葡萄糖苷酶的广泛应用奠定 了基础。 0005 本发明一方面提供了一株黑曲。
6、霉突变菌株黑曲霉Su-T2(AspergillusnigerSu- T2)， 已于2015年11月18日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心， 保藏号为 CCTCCNO： M2015682。 0006 本发明还提供了上述黑曲霉突变菌株在葡萄糖转苷酶生产中的应用。 0007 本发明还提供一种生产葡萄糖转苷酶的方法， 是用上述的黑曲霉突变菌株发酵来 制备的。 0008 本发明通过紫外诱变筛选获得一株黑曲霉突变菌株Su-T2。 该菌株在摇瓶发酵条 件下， 产葡萄糖转苷酶活力达到4.08u/ml， 比出发菌株提高了61.9； 在30L发酵罐条件下， 该菌株产葡萄糖转苷酶活力达到10.73u/。
7、ml， 比出发菌株提高了71.4。 该突变菌株可广泛 应用于葡萄糖转苷酶的生产， 为该酶的利用奠定了基础。 具体实施方式 0009 本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法 ， 例如 MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,3ndEd .(Sambrook,2001)和CURRENT PROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。 这些一般性参考文献 提供了本领域技术人员已知的定义和方法。 但是， 本领域的技术人员可以在本发明所记载 说明书 1/4 页 3 CN 105505787 A 3 的技术。
8、方案的基础上， 采用本领域其它常规的方法、 实验方案和试剂， 而不限于本发明具体 实施例的限定。 0010 下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。 0011 实施例1出发菌株产葡萄糖转苷酶能力检测 0012 出发菌株： 黑曲霉Su-T1(AspergillusnigerSu-T1)， 该菌株是由发明人徐晓东 于2013年10月筛选自山东省青岛市崂山区林场的土壤中。 0013 将黑曲霉Su-T1菌株接种PDA平板， 30培养5-7d。 待菌落表面变黑， 产生大量孢子 时， 割取2cm2cm大小的菌块， 接种至50ml液体摇瓶培养基中发酵， 32培养5d， 每天加入 适量氨水， 控制pH在4.。
9、5左右。 培养5d后， 离心菌体获得上清液即为粗酶液， 进行葡萄糖转苷 酶酶活力检测。 结果显示， 黑曲霉Su-T1发酵上清液中葡萄糖转苷酶活力为2.52u/ml。 0014 (1)葡萄糖转苷酶酶活单位的定义 0015 在50、 pH值为4.8的条件下， 每分钟从浓度为4mmol/L的对硝基苯酚- -D-葡萄糖 苷溶液中释放1 mol对硝基苯酚所需要的酶量即为一个酶活力单位U。 0016 (2)标准曲线绘制 0017 5mmol/L对硝基苯酚- -D-葡萄糖苷底物溶液： 秤取0.0753g对硝基苯酚- -D-葡萄 糖苷， 精确到0.0001g， 缓慢加入0.05mol/LpH4.8的柠檬酸缓冲。
10、液至接近50ml， 磁力搅拌 约10min， 用2mol/L的柠檬酸或者氢氧化钠调相应的pH值， 最后定容至50ml， 现用现配。 0018 秤取对硝基苯酚0.0696g， 用0.05mol/LpH4.8的柠檬酸缓冲液定容至100ml棕 色容量瓶中， 磁力搅拌30min至完全溶解即得5mmol/L对硝基苯酚溶液。 0019 将5mmol/L对硝基苯酚溶液精确稀释10倍即得对硝基苯酚标准液。 将对硝基苯酚 标准液分别稀释2、 4、 6、 8、 10、 12、 16倍。 0020 取0.5ml上述对硝基苯酚稀释液(空白对照取缓冲液)， 加入2ml碳酸钠溶液， 加入 0.5ml5mmol/L对硝基苯。
11、酚- -D-葡萄糖苷底物溶液， 混合均匀， 以空白对照调零， 以在410nm 测定吸光值。 以体系中对硝基苯酚含量为横坐标X， 吸光值为纵坐标Y， 绘制标准曲线YkX+ b。 0021 (3)酶活测定 0022 取适量底物， 50预热5min； 0023 取4支15*150试管(1支空白管， 3支样品管)， 分别向4支管中准确加入已稀释好的 酶液0.5ml； 0024 将4支试管同时置于50水浴中， 预热2min； 0025 准确向样品试管中加入0.5ml5mmol/L对硝基苯酚- -D-葡萄糖苷底物溶液底物溶 液， 准确计时15min； 0026 迅速向各管中加入2ml碳酸钠溶液， 于空白管。
12、中加入底物溶液0.5ml， 摇匀； 0027 以空白管调零， 在分光光度计波长410nm下， 用10mm比色杯分别测量。 0028 3样品管中的吸光值取平均值， 通过查标准曲线求出对硝基苯酚的含量。 0029 酶活力计算公式： AX1/0.5n/15 0030 A -葡萄糖转苷酶酶活力， u/ml； 0031 X吸光值在标准曲线上查得的对硝基苯酚含量， mol； 0032 1/0.5换算成酶液1ml； 说明书 2/4 页 4 CN 105505787 A 4 0033 n酶样的稀释倍数； 0034 15时间换算系数。 0035 实施例2紫外诱变与筛选 0036 1、 确定致死率： 0037 接。
13、种上述黑曲霉Su-T1于PDA平板， 30培养5-7d。 待菌落表面变黑， 产生大量孢子 时， 吸取5ml无菌水洗脱， 获得孢子液， 离心后用无菌水重悬， 用血球计数板计数。 取一个 90mm培养皿， 加入5ml稀释好的孢子悬液(浓度为1107)， 加入转子， 并在磁力搅拌器上搅 拌使孢子液处于均匀状态。 在无菌超净工作台中， 用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的 上方照射， 分别照射30s、 45s、 60s、 75s、 90s、 105s、 120s， 取照射后的孢子液稀释10、 100、 1000倍， 取100ul涂布PDA平板， 30培养2-3d后计数， 以未照射的孢子液为对照， 。
14、计算致死 率。 结果显示， 照射90s时， 致死率为95， 选取该照射时间进行后续诱变实验。 0038 2诱变筛选： 0039 取一个90mm培养皿， 加入5ml稀释好的孢子悬液(浓度为1107)， 加入转子， 并在 磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。 在无菌超净工作台中， 用功率为9w的紫外灯于 垂直距离20cm的上方照射， 照射90s后稀释1000倍， 取100ul涂布PDA平板， 30培养2-3d。 0040 共涂布200块PDA平板， 30培养2-3d后， 每个平板长出30-50个菌落。 先通过菌落 形态， 筛选短分枝的突变体， 挑取菌落形态较小、 菌丝致密、 菌落周围绒毛较短的突。
15、变体238 个， 分别接种到PDA平板， 30培养5-7d。 每个转化子割取2cm2cm大小的菌块， 分别接种至 50ml液体摇瓶培养基中发酵， 32培养5d， 每天加入适量氨水， 控制pH在4.5左右。 培养5d 后， 离心菌体获得上清液即为粗酶液， 分别对粗酶液进行葡萄糖转苷酶酶活力检测。 0041 酶活测定结果显示， 上述通过紫外诱变获得的突变菌株中葡萄糖转苷酶产量最高 的突变菌株为黑曲霉Su-T2(AspergillusnigerSu-T2)， 该菌株发酵上清液中葡萄糖转苷 酶酶活力达到4.08u/ml， 比出发菌株提高了61.9。 0042 该突变菌株已于2015年11月18日将突变。
16、菌株黑曲霉Su-T2(Aspergillusniger Su-T2)保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为CCTCCNO： M 2015682。 0043 实施例3发酵罐发酵验证 0044 在30升发酵罐上进行上述突变菌株黑曲霉Su-T2和出发菌株黑曲霉Su-T1的发酵， 发酵使用的培养基配方为： 麦芽糖2.5g/L、 硫酸铵0.9、 磷酸氢二钠0.15g/L、 氯化钙0.1g/ L、 硫酸钾0.5g/L、 硫酸镁16.4g/L、 柠檬酸钠0.2g/L、 磷酸二氢钾0.25、 豆粉0.5、 消泡剂 0.05。 补料培养基： 麦芽糖浓度为400g/L， pH调至4.0-5.。
17、0之间。 0045 发酵生产工艺： pH值4.0、 温度30、 搅拌速率300-700rpm、 通风量1.0-1.5(v/v)、 溶氧控制在20以上。 0046 整个发酵过程分为三个阶段： 第一阶段为菌体培养阶段， 按7比例接入种子， 30 培养15-25h， 以溶氧回升为标志； 第二阶段为饥饿阶段， 当底糖耗完之后， 不流加任何碳 源， 溶氧上升至60以上表明该阶段结束， 为期约30-120min； 第三阶段为产酶阶段， 流加补 料培养基进行产酶培养， 期间保持溶氧在20以上且维持发酵液中还原糖浓度不低于1g/ L， 发酵周期在140-170h之间。 发酵结束后， 发酵液通过板框过滤机处理后获得粗酶液。 0047 对上述获得的粗酶液分别进行葡萄糖转苷酶酶活测定， 结果显示， 出发菌株黑曲 说明书 3/4 页 5 CN 105505787 A 5 霉Su-T1发酵液酶活为6.26u/ml， 而突变菌株黑曲霉Su-T2发酵液酶活高达10.73u/ml， 比出 发菌株提高了71.4。 说明书 4/4 页 6 CN 105505787 A 6 。