技术领域
本发明涉及一种融合型抗菌肽GA，该肽由GST标签蛋白经肠激酶酶切位点连接抗菌肽 AWRK6构成，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有一定抑菌活性，作为添加剂加入饲料 中饲喂鸡雏后证实该融合肽可以提高鸡雏的免疫指标，是禽畜、水产饲料中抗生素的优秀替 代品。
背景技术
目前，对于禽畜和水产养殖专业户，为了提高禽畜及水产品的免疫性，大都在饲料中添 加抗生素，抗生素的添加不仅产生耐药性，而且存在毒副作用，且污染环境。
抗菌肽（antibacterialpeptides，ABP）又称宿主防御肽(hostdefensepeptides，HDPs)或抗 微生物肽(Antimicrobialpeptides，AMPs)，是生物体在条件性诱导下产生的具有免疫调节活 性和广谱抗菌活性的一种小分子多肽，属非特异性防御系统的重要组件，几乎存在于所有生 命形式如植物、昆虫、两栖动物、鱼类、鸟类、哺乳动物包括人体中。
研究发现，抗菌肽具有广谱抗菌活性以及快速杀菌特性，对于抗革兰氏阳性菌、革兰氏 阴性菌、多重耐药细菌、真菌、寄生虫、囊膜病毒和肿瘤细胞有不同程度的抑制及杀伤效果， 并且能通过趋化树突状细胞、单核细胞和记忆T细胞，成为先天性免疫和获得性免疫反应之 间的重要桥梁，能够启动获得性免疫系统从而提高机体对于微生物感染的抵抗能力。抗菌肽 具有抑制肿瘤细胞生长，抑制胰高血糖素分泌等功效。
枯草芽孢杆菌由于其非致病性，对人畜无害，兼具完善的分泌系统，外源基因表达产物 分泌能力强，以及良好的发酵基础，成为优良的原核外源蛋白表达宿主。但是受原始枯草菌 株的高蛋白酶分泌量以及相对较低的基因表达水平局限，未受研究者广泛重视和使用。直至 二十世纪八十年代中期一批蛋白酶缺陷的枯草芽孢杆菌突变株相继问世，将胞外蛋白酶降低 至原有的5%，使得这些蛋白酶缺陷株成为外源蛋白表达的理想宿主。同时，枯草芽孢杆菌自 身具备多种优良条件适用于动物肠道环境，是畜禽饲料添加剂的优秀生物替代品。
因此，针对禽畜及水产品的安全需要，寻找不产生耐药性、无毒副作用、无污染及残留 的绿色饲料添加剂是亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于通过枯草芽孢杆菌WB600所携带质粒pHYSGA获得分泌的融合型抗 菌肽GA，该融合型抗菌肽对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有一定抑菌活性，作为添加 剂加入饲料中，饲喂鸡雏后表明该融合肽可以提高鸡雏体重增长率、提高鸡雏的免疫指标， 可以成为禽畜、水产饲料中抗生素的优秀替代品。
本发明提供的融合型抗菌肽GA是由GST标签蛋白经肠激酶酶切位点连接抗菌肽 AWRK6构成。
所述的抗菌肽AWRK6（SWVGKHGKKFGLKKHKKH）由18个氨基酸构成，分子量为 2130.5，结构主要为α-螺旋，等电点为9.60。
本发明，根据抗菌肽AWRK6序列，通过TouchdownBoosterPCR方法获得AWRK6全长 基因，插入构建的大肠杆菌——枯草芽孢杆菌穿梭表达载体，在枯草芽孢杆菌中进行诱导分 泌表达。通过pcr方法获得谷胱甘肽转移酶（gultathioneStransferases,GST）作为蛋白标签， 以蔗糖果聚糖酶（Levansucrase）的启动子及信号肽序列（SacBp.s.,SacR）作为表达调控元 件，连接并转入质粒pHY300-plk，获得穿梭载体pHYSGA。转化进入蛋白酶缺陷型枯草芽孢 杆菌WB600，进行诱导表达，获得融合型抗菌肽GA。具体制备方法如下：
1）SacR调控序列的制备：提取枯草芽孢杆菌基因组；根据NCBI公布的SacB序列，以 提取的枯草芽孢杆菌基因组为模板，设计上下游引物pS1及pS2，在两端分别添加Xba I和NdeI酶切位点，PCR扩增获得SacR调控序列；
所述的上游引物pS1的序列为GCGTGCTCTAGAGATCCTTTTTAACCCATC；
所述的下游引物pS2的序列为GAATTCCATATGCGCAAACGCTTGAGTTG；
2）制备GST标签蛋白序列；
3）按照SEQIDNO.2所示的序列，设计6条引物pA1-pA6进行PCRpA1-pA6，获得AWRK6 序列；
所述的引物pA1的序列是：TATTACCATTAATATGACGACGACGACAAGA；
所述的引物pA2的序列是：GCTTGCCCACCCAGCTCTTGTCGTCGTCGT；
所述的引物pA3的序列是：GCTGGGTGGGCAAGCATGGCAAGAAGTTTG；
所述的引物pA4的序列是：TATGTTTCTTCAGGCCAAACTTCTTGCCAT；
所述的引物pA5的序列是：GCCTGAAGAAACATAAGAAACATTGACTGA；
所述的引物pA6的序列是：TGCCCAAGCTTTCTTTGTATTCTTTGTAAC；
4）各元件的连接以及与载体的连接：连接经QuickCutNdeI内切酶处理的SacR片段与 GST片段，得到SG序列，经QuickCutVspI酶切后与同样经QuickCutVspI酶酶切 的抗菌肽AWRK6序列片段进行连接，得到重组序列SGA；将重组序列SGA和提取 质粒pHY300-PLK分别经QuickCutHindIII和QuickCutXbaI双酶切后连接，得到重 组质粒pHYSGA；
5）重组质粒的转化：将重组质粒pHYSGA转入枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞中；
6）选取5）步获得的阳性转化子接种于含有Tetracycline的LB液体培养基中，37℃、 200rpm活化2h，之后以1%接种量接种于含有Tetracycline的LB液体培养基中，37 ℃、180rpm震荡3h，12000rpm离心10min后取上清液，上清液中加入20%蔗糖溶液 作为诱导剂至终浓度为2%，从培养第8小时开始诱导至第48小时，12000rpm离心 10min，取上清，得融合型抗菌肽GA。
本发明获得的融合型抗菌肽可以作为禽畜和水产品饲料添加剂。
本发明的融合型抗菌肽GA具有不产生耐药性、无毒副作用、无污染及残留的功效，对 革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有一定抑菌活性，作为添加剂加入饲料中饲喂鸡雏后表明 该融合肽还可以提高鸡雏体重增长率、提高鸡雏的免疫指标，因此可以成为禽畜、水产饲料 中抗生素的优秀替代品。
附图说明
图1质粒pHY300-PLK结构图。
图2琼脂糖凝胶电泳鉴定调控序列SacR的PCR结果。
图3琼脂糖凝胶电泳鉴定标签蛋白序列GST的PCR结果。
图4琼脂糖凝胶电泳鉴定检测AWRK6序列的PCR结果。
图5琼脂糖凝胶电泳鉴定元件拼接的PCR结果。
图6琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒pHY300-PLKHindIII单酶切结果。
图7琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒pHYSGAHindIII/XbaI双酶切结果。
图8SacR序列pcr产物测序部分结果。
图9GST标签序列pcr产物测序部分结果。
图10AWRK6序列测序部分结果。
图11SGA序列连接产物测序部分结果。
图12琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性转化子PCR验证。
图13琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性转化子双酶切结果。
图14SDS-PAGE鉴定AWRK6在枯草芽孢杆菌WB600中诱导表达结果。
其中，M：PremixedProteinMarker(Broad)；1：诱导前上清；2：诱导后8h上清；3：诱导 后16h上清；4：诱导后24h上清；5：诱导后32h上清；6：诱导后40h上清；7：诱导后48h 上清；8：菌体。
图15Western-Blot鉴定AWRK6在枯草芽孢杆菌WB600中诱导表达结果。
1：未诱导；2：诱导8h上清；3：诱导16h上清；4：诱导24h上清；5：诱导32h上清； 6：诱导40h上清；7：诱导48h上清；8：菌体。
具体实施方式
实施例1融合型抗菌肽GA的制备方法
1.SacR调控序列的制备
(1)枯草芽孢杆菌基因组提取
以接种环沾取少量冻存的枯草芽孢杆菌WB600，于20mL固体LB培养基上划线，37℃ 过夜培养。次日挑取单菌落接种于10mL液体LB培养基，37℃、220rpm震荡2h，分装保留 5mL种子液，其余全部加入95mL液体LB培养基中，37℃、180rpm震荡4h至OD600nm≈1.2。 依照说明书使用Axygen细菌基因组DNA小量制备试剂盒提取枯草芽孢杆菌WB600的基因 组。
(2)以WB600基因组为模板PCR获得SacB启动子和信号肽序列
根据NCBI公布的SacB序列：
1GATCCTTTTTAACCCATCACATATACCTGCCGTTCACTATTATTTAGTGAAATGAGATAT
61TATGATATTTTCTGAATTGTGATTAAAAAGGCAACTTTATGCCCATGCAACAGAAACTAT
121AAAAAATACAGAGAATGAAAAGAAACAGATAGATTTTTTAGTTCTTTAGGCCCGTAGTCT
181GCAAATCCTTTTATGATTTTCTATCAAACAAAAGAGGAAAATAGACCAGTCCAA
241ACGAGAGTCTAATAGAATGAGGTCGAAAAGTAAATCGCGCGGGTTTGTTACTG
301CAAGACCTAAAATGTGTAAAGGGCAAAGTGTATACTTTGGCGTCACCCCTTACATAT
361TTTAGGTCTTTTTTTATTGTGCGTAACTAACTTGCCATCTTCAAACAGGAGGGCTGGAAG
421AAGCAGACCGCTAACACAGTACATAAAAAAGGAGACATGAACGATGAACATCAAAAAGTT
481TGCAAAACAAGCAACAGTATTAACCTTTACTACCGCACTGCTGGCAGGAGGCGCAACTCA
541AGCGTTTGCGAAAGAAACGAACCAAAAGCCATATAAGGAAACATACGGCATTTCCCATAT
序列中以框线表示启动子元件，阴影表示核糖体结合位点（RBS），下划线指示的是蔗糖 果聚糖酶的信号肽序列。以上述序列为模板，设计上下游引物pS1及pS2，在两端分别添加 XbaI，NdeI酶切位点，引物序列见表1：
表1
以在步骤(1)中得到的枯草芽孢杆菌WB600基因组为模板，建立以下PCR体系：
PCR条件：采用三步法，98℃10s，55℃15s，72℃40s，共30循环后结束反应，产 物即SacR调控序列。AxygenPCRCleanupKit清洁反应产物并测序。SacR调控序列PCR扩 增的琼脂糖凝胶电泳鉴定如图2所示，由图2可见片段大小符合NCBI数据库描述。SacR序 列pcr产物测序结果如图8所示，从图8可见，测序结果与目的序列完全符合。
2.GST标签蛋白序列的制备
以接种环沾取少量冻存的大肠杆菌BL21-GEX，于20mLAmpicillin浓度50μg/mL的固体 LB培养基上划线，37℃过夜培养。次日挑取单菌落接种于10mLAmpicillin浓度50μg/mL液 体LB培养基，37℃、180rpm震荡4h至OD600nm≈1.2。依照说明书使用Axygen质粒小量 制备试剂盒提取质粒pGEX-4T-2，以其为模板进行PCR，体系如下
PCR条件：采用三步法，98℃10s，55℃15s，72℃50s，共30循环后结束反应，获 得GST标签蛋白序列。AxygenPCRCleanupKit清洁反应产物并测序。标签蛋白GST序列 PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳鉴定如图3所示，由图3可见片段大小符合NCBI数据库描述。 GST标签序列pcr产物测序结果如图9所示，从图9可见测序结果与目的序列完全符合。
3.AWRK6序列的制备
根据已知的AWRK6序列（SWVGKHGKKFGLKKHKKH），设计6条长引物pA1-pA6（引 物pA1-pA6的序列见表1）进行PCR，获得AWRK6序列。扩增后通过AxygenPCRCleanup Kit清洁反应产物并测序。AWRK6序列的PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳鉴定如图4所示，从图 4可见片段大小符合预期。AWRK6序列pcr产物测序结果如图10所示，从图10可见测序结 果与目的序列完全符合。
4.各元件的连接以及与载体的连接
依据TakaraDNALigationKitVer.2.1说明，连接经QuickCutNdeI内切酶处理的SacR片 段与GST片段，将GST片段去磷酸化后加入下列反应体系：
16℃处理30min后将产物SG序列清洁回收，经QuickCutVspI酶切后与同样经QuickCut VspI酶酶切的AWRK6序列片段进行连接，体系如下
16℃处理30min后得到重组序列SGA，以SGA片段为模板，SacR上游引物PS1及AWRK6 下游引物PA6为模板，扩增SGA序列，反应体系如下：
PCR条件：采用三步法，98℃10s，55℃15s，72℃90s，共30循环后结束反应，获 得重组序列SGA。AxygenPCRCleanupKit清洁反应产物并测序。SGA序列PCR扩增的琼 脂糖凝胶电泳鉴定如图5所示，从图5可见片段大小符合预期。SGA序列连接产物测序结果 如图11所示，从图11可见，测序结果与目的序列完全符合。
以接种环沾取少量冻存的大肠杆菌JM109-HY，于20mLAmpicillin及Tetracycline浓度 50μg/mL的固体LB培养基上划线，37℃过夜培养。次日挑取单菌落接种于10mL同样抗生 素浓度的液体LB培养基，37℃、180rpm震荡4h至OD600nm≈1.2。依照说明书使用Axygen 质粒小量制备试剂盒提取质粒pHY300-PLK。质粒pHY300-PLKHindIII单酶切结果的琼脂糖 凝胶电泳鉴定如图6所示，从图6可见片段大小符合预期。
将经过QuickCutHindIII单酶切并切胶回收的pHY300-PLK质粒片段与测序后的SGA片 段分别经QuickCutHindIII和QuickCutXbaI双酶切的片段使用In-FusionHDCloningKit进 行克隆连接。体系如下：
反应条件50℃15min，获得重组质粒pHYSGA。琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒pHYSGA HindIII/XbaI双酶切结果如图7所示，从图7可见片段大小符合预期。
5.质粒的转化
(1)取冻存的枯草芽孢杆菌WB600菌种于添加10μLchloromycetin的20mLLB固体培养 基上划线，37℃过夜培养。
(2)挑取单菌落在含有25μg/mLchloromycetin的5mLLB液体培养基中进行活化。37℃、 180rpm培养4h后挑取活化菌种一环接入内含5mLGM1培养基的试管，37℃、200rpm过夜 培养。
(3)取500μL过夜培养的菌液转接入5mL新的GM1培养基中，37℃、200rpm培养3h， 此时菌体生长达到对数期末期。取0.75mL以GM1培养的菌液接入装有5mLGM2培养基的 试管，37℃、125pm培养1.5h，5000rpm离心10min收集菌体并用mL元培养液上清轻轻悬 浮菌体，得到枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞，预留待用细胞后加30%灭菌甘油至终浓度 10%，混匀后每0.5mL菌液分装一管，-70℃冻存备用。
(4)将5μL含有80ng/μL重组质粒pHYSGA的溶液与1mLWB600感受态细胞轻轻震荡混 匀，37℃、120rpm培养0.5h，提高震荡速度至200rpm继续培养1.5h，吸取100μL菌液涂布 于含有50ug/mLTetracycline的固体LB培养基上37℃培养过夜。
(5)转化子验证
以接菌环挑取少量转化子菌体稀释于0.04mL无菌水，沸水浴5min后置于-20℃冰箱中 静置5min，于室温溶解后12000rpm离心2min，取1μL上清液为模板，使用引物pS1、pA6 为引物进行PCR验证。琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性转化子PCR验证结果如图12所示，从图12 可见片段大小与预期SGA片段一致。琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性转化子双酶切结果如图13所 示，从图13可见双酶切获得的两条片段大小符合预期。
6.AWRK6在枯草芽孢杆菌WB600中的诱导表达及检测
(1)诱导表达
选取阳性转化子接种于5mL含有50ug/mLTetracycline的LB液体培养基中，37℃、200rpm 活化2h，之后以1%量接种于100mL含50ug/mLTetracycline的LB液体培养基中，37℃、180rpm 震荡3h，取样并12000rpm离心10min后分别保存上清和菌体。于上清和菌体中分别加入20% 蔗糖溶液作为诱导剂至终浓度为2%，持续诱导48h，并于诱导8h、16h、24h、32h、40h、48h 时分别取样，12000rpm离心10min，再分别保存上清和菌体。
(2)诱导结果SDS-PAGE检测
取诱导表达前后不同时间段的菌液以及未诱导菌体各10μL，加入等体积2×上样缓冲液 混匀，沸水浴5min，冷却至室温吸取10μL上样。电泳仪设置80V待条带进入分离胶后调高 至100V电泳1.5h，至指示条带电泳至高于分离胶下沿1cm时终止电泳。将胶置于考马斯亮 蓝R250染色液中染色0.5h，脱色至条带清晰并观察。抗菌肽AWRK6在枯草芽孢杆菌WB600 中诱导表达的SDS-PAGE鉴定结果如图14所示，从图14可见，在32h的发酵液中AWRK6 的条带最显著，说明此刻浓度最高，为最优表达时间。未诱导的菌液中有微量AWRK6存在， 为痕量表达。菌体中有相应条带存在，为尚未分泌到菌液中的抗菌肽AWRK6。因此选择32h 诱导表达获得的融合型抗菌肽GA用于实施例2和实施例3。
(3)诱导结果WesternBlot鉴定
依(2)步骤使用预染蛋白质分子质量标准PrestainedProteinMolecularWeightMarker进行 SDS-PAGE进行电泳，取消染色步骤。将0.22um孔径的聚偏二氟乙烯膜 （polyvinylidenefluoride）放在去离子水中，毛细作用去除气泡，在转移缓冲液中平衡15分 钟。采用半干法进行转膜，以1V/cm2膜的条件转膜2h。取出膜后以PBST漂洗，封闭液于室 温轻摇1h。将膜用滤纸铁脚喜感，正面朝下置于一抗稀释液中，4℃静置过夜。而后勇PBST 浸洗3次，每次10min。取出膜后正面向下置于二抗稀释液中室温轻摇1h。再次使用PBST 漂洗后浸洗3次，每次10min。
依据辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法，混合发光液A、B备用。将膜用去离子水漂洗并 吸干后加上发光混合液覆盖，熄灯至可见绿色荧光后吸干并与暗盒中盖加胶片曝光。曝光15s 后立即放入显影液中1min，去离子清洗，置于定影液中并再次清洗晾干。AWRK6在枯草芽 孢杆菌WB600中诱导表达的Western-Blot鉴定结果如图15所示，从图15可见，在诱导后标 签蛋白GST及抗菌肽AWRK6得以成功表达，而未诱导的菌液中只有痕量存在，说明诱导调 控系统有效控制了蛋白的表达，避免了对宿主菌有杀伤作用的蛋白的毒害，同时能够使得在 菌体最优生长阶段表达蛋白成为可能，从而获得较高蛋白表达量。
实施例2融合型抗菌肽GA的抗菌性
取-20℃冻存的ATCC25923（金黄色葡萄球菌），ATCC25922(大肠埃希氏菌)在LB平板上 三线法划线，37℃过夜培养，次日挑取单菌落，接种于含5mLLB液体培养基的试管，180rpm， 37℃过夜震荡培养。涂板计数，稀释菌液至终浓度为5×105CFU/mL。
选取实施例1中制备的诱导表达32小时获得的上清融合型抗菌肽GA，经0.22μm滤膜 过滤后，浓度记为2C，部分稀释为1/2浓度梯度，分别将500uL不同浓度上清液与500uL稀 释后浓度为105CFU/mL的菌液充分混合，37℃180rpm过夜震荡培养，此时的各组药物浓度为 C、C/2、C/4、C/8、C/16、C/32、C/64，并设置无菌组和卡那霉素组进行比对。
将过夜培养后的菌液稀释至适当浓度进行涂布于LB固体平板，37℃恒温过夜培养。记 录菌落数，结果见表2和表3。
表2卡那霉素抑菌效果
表3WB600(pHYSGA)诱导32h菌液抑菌效果
结论：由表2和表3可见，WB600(pHYSGA)诱导32h菌液在等量添加入测试菌菌液后，抑 菌效果接近终浓度为16μg/mL的卡那霉素，明显优于终浓度为8μg/mL的卡那霉素。由此可 见，融合型抗菌肽GA对于革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌均具有较明显的抑菌能力，具备显 著的开发和应用前景。
实施例3融合型抗菌肽GA作为禽畜饲料添加剂的应用
(1)鸡雏饲养管理
选取健康，体重相近的1日龄雄性鸡雏60只，随机分为三组，每组20只。I组为实验 组，饲喂基础日粮并添加扩增3小时后添加终浓度2%蔗糖诱导的WB600SGA菌液，II组为阳 性对照组，饲喂基础日粮并添加用液体LB培养基培养35h的枯草芽孢杆菌WB600（扩大培养 3小时候添加终浓度为2%的蔗糖），III组为空白对照组，饲喂基础日粮并添加含2%蔗糖的 液体LB液体培养基，试验期21天。
(2)增重实验
实验各组鸡雏饲养于同一鸡舍，横式鸡笼喂养，1日龄阶段光照23h，此后每天减低0.5h， 恒温38℃，自由采食和饮水，不设免疫。每三天记录各组鸡雏体重并计算平均体重。结果见 表4。
表4各组鸡雏平均耗料量、平均增重及肉料比
同列数据肩注不同大写字母者表示差异极显著（P<0.01），不同小写字母者表示差异显 著（P<0.05），相同字母者表示差异不显著（P>0.05）
WB600组（II）肉料比增长=(0.513/1-0.479/1)/(0.479/1)*100%=7.098%
WB600(SGA)组（I）肉料比增长=(0.556/1-0.479/1)/(0.479/1)*100%=16.075%
由此可知，融合型抗菌肽GA添加组的肉料比有极显著的增长。
(3)免疫实验
用消毒过的干燥注射器由翅静脉采血，每只鸡应更换一个针头与注射器注入清洁干燥试 管内，在室温下3000rpm离心10min，待血清析出后-20oC保存。
使用鸡SIgA、鸡IL-2、鸡γ-IFNELISA试剂盒检测鸡雏血清上述三项免疫力指标。结 果见表5。
表5鸡雏血清免疫指标对比
γ-IFN含量pg/mL SIg含量pg/mL IL-2含量pg/mL I 56.390±3.134B 80.522±5.261B 72.569±5.186B II 39.957±1.920Aa 62.741±3.809Aa 55.706±3.792Aa III 39.590±1.757Aa 62.947±4.960Aa 55.888±3.319Aa
同列数据肩注不同大写字母者表示差异极显著（P<0.01），不同小写字母者表示差异显 著（P<0.05），相同字母者表示差异不显著（P>0.05）。
如表5所示的三项检测共同证实融合型抗菌肽GA的添加对鸡雏的免疫指标具有显著提 升效果。
上述动物实验表明，融合型抗菌肽GA的添加提高了鸡雏对饲料的利用率，在此基础之 上，含有抗菌肽的菌液的添加进一步提高了鸡雏生长的肉料比，等量饲料的饲喂下，增重更 多，证实其可以作为添加剂显著提高鸡雏生产效能。