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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610080206.9 (22)申请日 2016.02.05 C12Q 1/04(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (71)申请人 刘名霞 地址 276826 山东省日照市望海路 35 号日 照市中医医院 (72)发明人 刘名霞 (54) 发明名称 一种李斯特菌选择培养基 (57) 摘要 本发明公开了一种李斯特菌选择培养基。 属于检验微生物培养领域， 其特征在于， 配制 1000ml 培养基的配方中含有 ： 酵母浸出粉、 牛肉 粉、 酪蛋白胨、 琼脂、 葡萄糖、 氯化钠、 酵母锌、 磷 酸二氢钠、 - 羟基精氨。
2、酸、 N- 乙酰 -D- 葡萄糖 胺、 光谷甘肽、 杆菌肽、 无菌马血蛋白， 蒸馏水加至 1000ml。本发明与现有技术相比较， 具有检出可 靠， 李斯特菌分离率高的特点。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 CN 105543326 A 2016.05.04 CN 105543326 A 1.一种李斯特菌选择培养基， 其特征在于配制1000ml培养基的配方中含有： 酵母浸出粉58g； 牛肉粉610g； 酪蛋白胨610g； 琼脂1520g； 葡萄糖35g； 氯化钠55.5g； 酵母锌0.010.05g； 磷酸二氢钠13。
3、g； -羟基精氨酸0.10.5g； N-乙酰-D-葡萄糖胺0.010.05g； 光谷甘肽0.10.5g； 杆菌肽0.0010.003g； 无菌马血蛋白2050g； 蒸馏水加至1000ml。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105543326 A 2 一种李斯特菌选择培养基 技术领域 0001 本发明涉及检验微生物培养领域， 具体涉及一种李斯特菌选择培养基。 背景技术 0002 微生物培养是一种用人工方法使微生物生长繁殖的技术， 而选择性培养基是用来 促进或抑制一定类型的生物体 （如细胞或细菌等） 而设计的培养基， 利用这种培养基可以将 所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。 李斯特菌 （L。
4、isteriamonocytogenes） 为革 兰阳性杆菌， 是一种兼性厌氧细菌， 广泛分布在自然环境中， 如土壤、 污水、 饲料、 动物、 健康 人及各种生食和即食食品中， 可引起人类李斯特菌病， 李斯特菌是一种细胞内寄生菌， 多数 感染李斯特菌病的健康人没有症状或有自限性的流感样症状和胃肠道症状， 如头痛、 发热、 寒战、 肌肉疼痛、 腹痛、 腹泻、 恶心、 呕吐等。 部分患者会发展为神经系统感染 （如脑膜炎、 脑 膜脑炎、 脑干脑炎等） 、 败血症及局灶感染 （如心内膜炎、 关节炎、 肝炎、 皮炎等） 和菌血症等。 神经系统的感染可能造成后遗症。 孕妇感染后多无症状或症状轻微， 但可导。
5、致流产、 死胎、 早产及严重的新生儿感染。 0003 近年来李斯特菌感染患者呈上升趋势， 在新生儿、 妊娠妇女、 40岁以上及免疫功能 受损的人群中均可发生， 尤其是妊娠妇女感染李斯特菌的风险是普通人群的30100倍。 早 期诊断并早期治疗， 可100%治愈。 若诊断延误， 病死率可达2030%， 因此作为确诊唯一依据 的临床细菌检查的正确与快速鉴定极为重要。 目前， 该菌属的鉴定金标准为荧光定量PCR鉴 定， 但是PCR检测设备要求和操作成本均较高， 因此临床检验手段主要是革兰染色法， 但有 1/3的李斯特菌无法阳性检出， 而且如果要辨别李斯特菌的种类就需要细菌培养， 并就其菌 落形态特征进。
6、行鉴别。 目前培养多用胰酪胨大豆琼脂 （TSA-YE） 。 但是李斯特菌培养阳性率 低， 仅为36%左右， 主要是临床培养过程中该菌容易被认为是污染的杂菌而遭丢弃， 且标本 中的金黄色葡萄球菌、 大肠杆菌、 肺炎球菌等在目前的培养基上比李斯特菌生长更快， 很快 覆盖了培养基， 李斯特菌无法生长， 结果延误诊疗时间。 发明内容 0004 本发明的技术任务是针对以上现有技术的不足， 提供一种适合于李斯特菌的选择 培养基。 0005 本发明解决其技术问题的技术方案是： 一种李斯特菌的选择培养基， 其特征为， 配 制1000ml培养基的配方中含有： 酵母浸出粉58g； 牛肉粉610g； 酪蛋白胨610。
7、g； 琼脂1520g； 葡萄糖35g； 氯化钠55.5g； 说明书 1/5 页 3 CN 105543326 A 3 酵母锌0.010.05g； 磷酸二氢钠13g； -羟基精氨酸0.10.5g； N-乙酰-D-葡萄糖胺0.010.05g； 杆菌肽0.0010.003g； 光谷甘肽0.10.5g； 无菌马血蛋白2050g； 蒸馏水加至1000ml。 0006 其中： 所述的牛肉粉、 酪蛋白胨、 葡萄糖提供碳源、 氮源， 酵母浸出粉富含蛋白质、 氨基酸、 多肽、 核苷酸、 维生素、 生长因子、 微量元素等营养成分， 为李斯特菌的繁殖和生长 提供均衡的营养元素； 氯化钠维持均衡的渗透压； 琼脂为培养。
8、基的凝固剂； 酵母锌为营养 剂， 发明人发现， 在培养基中加入一定浓度的锌离子， 目标菌的生长状态好于对照组， 因此 推论锌离子有助于该菌的生长， 同时母体酵母含微生物必需氨基酸含量丰富、 配比合理， 具 有促进细菌繁殖的功效； 磷酸二氢钠为缓冲剂； N-乙酰基-D-葡萄糖胺是营养强化剂， 基础 实验证实， 将同一李斯特菌菌株接种到2个TSA-YE培养基上， 其中一个TSA-YE配方中加入N- 乙酰-D-葡萄糖胺0.05g/L， 37下大气条件下培养， 48小时后观察菌株， 发现添加N-乙酰- D-葡萄糖胺的TSA-YE培养基有小的李斯特菌菌落， 没有添加N-乙酰-D-葡萄糖胺的TSA-YE 。
9、培养基未发现李斯特菌菌落， N-乙酰-D-葡萄糖胺促进细胞生长、 分化， 是李斯特菌的生长 因子； 杆菌肽 （Bacitracin） ， 实验室研究表明杆菌肽可以抑制革兰阳性细菌和阴性球菌、 肺 炎双球菌、 葡萄球菌、 淋球菌、 脑膜炎双球菌等杂菌的生长， 但该浓度下由于对李斯特菌属 无抗菌抑菌作用， 因此提高了李斯特菌的分离率。 -羟基精氨酸为激活剂， 可以促进李斯 特菌对矿物质的摄取； 无菌马血蛋白提供能量环境。 0007 此外， 光谷甘肽可以降低培养基氧化还原电势， 促进细胞生长、 分化， 是李斯特菌 的生长促进剂。 苍术酮抑制大肠杆菌、 肠炎沙门菌、 金黄色葡萄球菌、 沙门氏菌、 铜绿。
10、假单胞 等细菌生长， 但该浓度下对李斯特菌菌落的生长没有影响； 山萸肉为山茱萸科植物山茱萸 的果实， 现代医学研究表明， 山萸肉含山茱萸鞣毛， 山茱萸裂甙， 铁、 铝、 铜、 锌、 硼、 磷等21种 元素， 苏氨酸、 缬氨酸、 亮氨酸等14种氨基酸， 维生素A， 葡萄糖、 果糖、 蔗糖、 熊果酸、 没食子 酸、 苹果酸、 酒石酸等糖类和有机酸类， 山萸肉水提液是良好的营养强化剂， 并且对金黄色 葡萄球菌、 奈氏卡他球菌、 结核杆菌、 肺炎双球菌、 流感嗜血杆菌、 脊髓灰质炎病毒等均有不 同程度的抑菌作用。 0008 本发明与现有技术相比较， 具有检出可靠、 李斯特菌分离率高的特点。 具体实施方。
11、式 0009 以下结合实际情况， 对本发明的具体实施方式作详细说明。 0010 实施例1， 配制1000ml培养基的配方中含有： 酵母浸出粉5g； 牛肉粉10g； 酪蛋白胨 6g； 琼脂15g； 葡萄糖4g； 氯化钠5g； 磷酸二氢钠1g； -羟基精氨酸0.3g； 酵母锌0.01g； N-乙 酰-D-葡萄糖胺0.01g； 杆菌肽0.003g； 无菌马血蛋白20g， 蒸馏水加至1000ml。 制备方法： 称 取酵母浸出粉； 牛肉粉； 酪蛋白胨； 琼脂； 葡萄糖； 氯化钠； 磷酸二氢钠； -羟基精氨酸； 酵母 锌， 混匀蒸馏水溶解， 210， 灭菌15min， 冷却到45， 加入灭菌N-乙酰-D-。
12、葡萄糖胺； 灭菌杆 说明书 2/5 页 4 CN 105543326 A 4 菌肽； 无菌马血蛋白混匀， 灭菌蒸馏水定容到1000ml后分装。 0011 实施例2， 配制1000ml培养基的配方中含有： 酵母浸出粉5g； 牛肉粉6g； 酪蛋白胨 8g； 琼脂15g； 葡萄糖3g； 氯化钠5g； 磷酸二氢钠3g； -羟基精氨酸0.1g； 酵母锌0.05g； N-乙 酰-D-葡萄糖胺0.03g； 杆菌肽0.001g； 光谷甘肽0.1g； 无菌马血蛋白40g， 蒸馏水加至 1000ml。 制备方法： 称取酵母浸出粉； 牛肉粉； 酪蛋白胨； 琼脂； 葡萄糖； 氯化钠； 磷酸二氢钠； -羟基精氨酸； 酵。
13、母锌， 混匀蒸馏水溶解， 210， 灭菌15min， 冷却到45， 加入灭菌光谷甘 肽； 灭菌N-乙酰-D-葡萄糖胺； 灭菌杆菌肽； 无菌马血蛋白混匀， 灭菌蒸馏水定容到1000ml后 分装。 0012 实施例3， 配制1000ml培养基的配方中含有： 酵母浸出粉5g； 牛肉粉8g； 酪蛋白胨 6g； 琼脂18g； 葡萄糖5g； 氯化钠5.5g； 磷酸二氢钠2g； -羟基精氨酸0.5g； 酵母锌0.03g； N- 乙酰-D-葡萄糖胺0.05g； 杆菌肽0.001g； 苍术酮0.003g； 无菌马血蛋白50g， 蒸馏水加至 1000ml。 制备方法： 称取酵母浸出粉； 牛肉粉； 酪蛋白胨； 琼脂。
14、； 葡萄糖； 氯化钠； 磷酸二氢钠； -羟基精氨酸； 酵母锌； 苍术酮， 混匀蒸馏水溶解， 210， 灭菌15min， 冷却到45， 加入灭 菌N-乙酰-D-葡萄糖胺； 灭菌杆菌肽； 无菌马血蛋白混匀， 灭菌蒸馏水定容到1000ml后分装。 0013 实施例4， 配制1000ml培养基的配方中含有： 酵母浸出粉6g； 牛肉粉10g； 酪蛋白胨 8g； 琼脂18g； 葡萄糖4g； 氯化钠5g； 磷酸二氢钠2g； -羟基精氨酸0.1g； 酵母锌0.03g； N-乙 酰-D-葡萄糖胺0.05g； 杆菌肽0.002g； 无菌马血蛋白30g； 200g L山茱萸肉水提液200ml； 蒸 馏水加至1000。
15、ml。 制备方法：（1） 取40g山茱萸肉加水煮沸30min， 过滤， 取滤液， 根据滤液体 积， 采取浓缩或者加水调整体积到浓度为200g/L， 得山茱萸肉水提液200ml；（2） 称取酵母浸 出粉； 牛肉粉； 酪蛋白胨； 琼脂； 葡萄糖； 氯化钠； 磷酸二氢钠； -羟基精氨酸； 酵母锌， 溶于 步骤 （1） 所得的山茱萸肉提取液中混匀， 210灭菌15min， 冷却到45， 加入灭菌N-乙酰-D- 葡萄糖胺； 灭菌杆菌肽； 无菌马血蛋白混匀， 灭菌蒸馏水定容到1000ml后分装。 0014 实施例5， 配制1000ml培养基的配方中含有： 酵母浸出粉6g； 牛肉粉6g； 酪蛋白胨 8g； 。
16、琼脂20g； 葡萄糖3g； 氯化钠5.5g； 磷酸二氢钠3g； -羟基精氨酸0.5g； 酵母锌0.01g； N- 乙酰-D-葡萄糖胺0.01g； 杆菌肽0.003g； 光谷甘肽0.3g； 苍术酮0.001g； 无菌马血蛋白40g， 蒸馏水加至1000ml。 制备方法： 称取酵母浸出粉； 牛肉粉； 酪蛋白胨； 琼脂； 葡萄糖； 氯化钠； 磷酸二氢钠； -羟基精氨酸； 酵母锌； 苍术酮， 混匀蒸馏水溶解， 210， 灭菌15min， 冷却到 45， 加入灭菌光谷甘肽； 灭菌N-乙酰-D-葡萄糖胺； 灭菌杆菌肽； 无菌马血蛋白混匀， 灭菌 蒸馏水定容到1000ml后分装。 0015 实施例6， 配制。
17、1000ml培养基的配方中含有： 酵母浸出粉8g； 牛肉粉8g； 酪蛋白胨 10g； 琼脂20g； 葡萄糖3g； 氯化钠5.5g； 磷酸二氢钠3g； -羟基精氨酸0.5g； 酵母锌0.01g； N-乙酰-D-葡萄糖胺0.01g； 杆菌肽0.003g； 光谷甘肽0.5g； 无菌马血蛋白50g； 浓度200g L的 山茱萸肉水提液250ml； 蒸馏水加至1000ml。 制备方法：（1） 取50g山茱萸肉加水煮沸45min， 过滤， 取滤液， 根据滤液体积， 采取浓缩或者加水调整体积到浓度为200g/L， 得山茱萸肉水 提液250ml；（2） 称取酵母浸出粉； 牛肉粉； 酪蛋白胨； 琼脂； 葡萄糖；。
18、 氯化钠； 磷酸二氢钠； - 羟基精氨酸； 酵母锌， 溶于步骤 （1） 所得的山茱萸肉提取液中混匀， 210灭菌15min， 冷却到 45， 加入灭菌光谷甘肽； 灭菌N-乙酰-D-葡萄糖胺； 灭菌杆菌肽； 无菌马血蛋白混匀， 灭菌 蒸馏水定容到1000ml后分装。 0016 实施例7， 配制1000ml培养基的配方中含有： 酵母浸出粉8g； 牛肉粉8g； 酪蛋白胨 说明书 3/5 页 5 CN 105543326 A 5 10g； 琼脂15g； 葡萄糖4g； 氯化钠5g； 磷酸二氢钠3g； -羟基精氨酸0.3g； 酵母锌0.03g； N-乙 酰-D-葡萄糖胺0.03g； 杆菌肽0.001g； 。
19、苍术酮0.005g； 无菌马血蛋白20g； 浓度200g L的山茱 萸肉水提液300ml； 蒸馏水加至1000ml。 制备方法：（1） 取60g山茱萸肉加水煮沸60min， 过滤， 取滤液， 根据滤液体积， 采取浓缩或者加水调整体积到浓度为200g/L， 得山茱萸肉水提液 300ml；（2） 称取酵母浸出粉； 牛肉粉； 酪蛋白胨； 琼脂； 葡萄糖； 氯化钠； 磷酸二氢钠； -羟基 精氨酸； 酵母锌； 苍术酮， 溶于步骤 （1） 所得的山茱萸肉提取液中混匀， 210灭菌15min， 冷 却到45， 加入灭菌N-乙酰-D-葡萄糖胺； 灭菌杆菌肽； 无菌马血蛋白混匀， 灭菌蒸馏水定容 到1000ml。
20、后分装。 0017 实施例8， 配制1000ml培养基的配方中含有： 酵母浸出粉8g； 牛肉粉10g； 酪蛋白胨 6g； 琼脂18g； 葡萄糖3g； 氯化钠5.5g； 磷酸二氢钠2g； -羟基精氨酸0.3g； 酵母锌0.01g； N- 乙酰-D-葡萄糖胺0.05g； 杆菌肽0.001g； 光谷甘肽0.3g； 苍术酮0.003g； 无菌马血蛋白30g； 浓度200g L的山茱萸肉水提液250ml； 蒸馏水加至1000ml。 制备方法：（1） 取60g山茱萸肉加 水煮沸60min， 过滤， 取滤液， 根据滤液体积， 采取浓缩或者加水调整体积到浓度为200g/L， 得山茱萸肉水提液300ml；（2）。
21、 称取酵母浸出粉； 牛肉粉； 酪蛋白胨； 琼脂； 葡萄糖； 氯化钠； 磷 酸二氢钠； -羟基精氨酸； 酵母锌； 苍术酮， 溶于步骤 （1） 所得的山茱萸肉提取液中混匀， 210灭菌15min， 冷却到45， 加入灭菌光谷甘肽； 灭菌N-乙酰-D-葡萄糖胺； 灭菌杆菌肽； 无菌马血蛋白混匀， 灭菌蒸馏水定容到1000ml后分装。 0018 所述山茱萸肉水提液浓度200g/L指的是每升含有生药200g。 0019 本发明所得李斯特菌选择培养基用于粪便标本， 具有检出可靠、 李斯特菌分离率 高的特点， 为临床资料充分证明， 有关资料如下。 0020 1对象与方法。 0021 1.1培养基制备： 实验。
22、组共设4组， 分别为实施例1方案组； 实施例2方案组、 实施例6 方案组、 实施例8方案组， 对照组为胰酪胨大豆琼脂 （TSA-YE） 培养基， 每升中含有： 蛋白胨 17.0g； 多价胨3.0g； 氯化钠5.0g； 磷酸氢二钾2.5g； 葡萄糖2.5g； 琼脂15.0。 0022 1.2粪便样本处理、 培养方法： 门诊或住院疑似李斯特菌病腹泻患者 （腹疼、 腹泻 症状； 老人、 孕妇或免疫缺陷背景； 或伴有感冒样症状、 发热、 寒战） 113例， 取患者新鲜 粪便， 悬浮于5ml0.9%生理盐水， 用接种环分区划线接种于实施例1方案组； 实施例2方案组； 实施例6方案组； 实施例8方案组和对。
23、照组培养基。 接种好的培养基， 35大气条件下保温培 养48h， 挑取细小菌落进行菌属鉴定。 各样本编号送检PCR做分子生物学鉴定。 0023 1.3检出阳性标准： 取出培养皿， 依据 临床微生物学诊断与图解 进行目标菌选择 及鉴定： 观察菌落生长情况， 挑选目标菌涂片， 革兰氏染色， 显微镜镜检。 判断最终结果金标 准为荧光定量PCR结果。 0024 2结果： 113份患者粪便标本检出菌落经荧光定量PCR最后鉴定为李斯特菌阳性的 为15例。 48h各组检出阳性、 假阳性、 阴性、 假阴性菌株例数见下表， 分组总数PCR阳性阳性假阳性阴性假阴性 实施例1113151231016 实施例2113。
24、151331005 实施例611315142993 实施例811315141992 说明书 4/5 页 6 CN 105543326 A 6 对照组 （TSA-YE）113154110912 上述结果可以看出， 培养48小时后， 各实施例组与对照组阳性检出率比较均具有明显 差异 （P0.05） ， 且各实施例组的假阴性率均低于对照组， 具有极明显差异 （P0.001） 。 对照 组阳性检出结果与PCR检测结果比较， 阳性检出率差异巨大 （ 2=6.95， P0.05） 。 0025 以上结果表明， 粪便标本经过本发明实施例培养基培养后， 李斯特菌阳性率与PCR 检测差异无统计学差异， 且分离率明显高于现有的培养基， 普通TSA-YE培养基选择性不足， 粪便中杂菌迅速生长覆盖培养基影响李斯特菌的阳性生长， 本发明培养基可以尽量准确的 菌株阳性率， 李斯特菌检出可靠， 阳性分离率高， 从而缩短确诊时间。 说明书 5/5 页 7 CN 105543326 A 7 。