《一种磁性海藻酸钠固化漆酶的制备方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种磁性海藻酸钠固化漆酶的制备方法.pdf（7页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610072431.8 (22)申请日 2016.02.02 C12N 11/14(2006.01) C12N 11/10(2006.01) (71)申请人 江苏时空涂料有限公司 地址 213164 江苏省常州市武进区郑陆镇东 门外东青 (72)发明人 陈明生 张帆 林大伟 (54) 发明名称 一种磁性海藻酸钠固化漆酶的制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种磁性海藻酸钠固化漆酶的 制备方法， 属于固定化酶制备技术领域。本发明 利用产漆菌种发酵制得漆酶酶液， 掺加磁性粒子， 辅以海藻酸钠对其固定， 振荡吸附后干燥， 从而得 到磁性。
2、海藻酸钠固定化漆酶的制备方法。该方法 工艺简单， 成本低廉， 制得的磁性海藻酸钠固定化 漆酶不仅活力在 250IU/mL 以上， 总产量也提高至 85 90， 均达到了较高水平， 而且纳米级磁性 粒子的掺入使其更容易进行吸附， 易于分离， 使得 固定化漆酶回收率提高， 稳定性也得到显著增强， 具有优异的性能。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 CN 105505914 A 2016.04.20 CN 105505914 A 1.一种磁性海藻酸钠固化漆酶的制备方法， 其特征在于具体制备步骤为： （1） 按接种量为培养基。
3、底物质量57%将白毒鹅膏菌接种到装有50100mL基础液体培 养基的300mL三角瓶中， 放置在摇床上在2530下以100200rpm的速率恒温振荡培养3 5天， 用无菌水淋洗菌丝表面并收集淋洗液， 得到菌丝悬浮液， 于46下保存； （2） 向80100mL基础液体培养基中分别加入12% （w/v） 茶叶、 12% （w/v） 豆粕和1 2% （w/v） 蔗渣组成的混合物以及510mL浓度为0.5mol/L硫酸铜溶液， 混合均匀后再加入20 25mL上述制备的菌丝悬浮液， 放入恒温箱在2535下发酵78天， 再将发酵液移入卧 式离心机， 以70009000r/min转速离心分离， 得上清液即为。
4、漆酶酶液， 备用； （3） 按摩尔比为3:2将浓度为0.3mol/L氯化铁和0.2mol/L氯化亚铁溶液混合均匀， 取 100200mL混合液装入300mL三口烧瓶中， 用质量浓度为17%氨水调节pH至910后， 向烧瓶 中以10mL/min速率持续通入氮气并移入水浴锅中， 升温至7585保温熟化3040min， 在 磁场作用下吸附分离， 得纳米级磁性粒子； （4） 取13g纳米级磁性粒子在超声作用下分散于4050mL浓度为10%海藻酸钠溶液 中， 制得混合液， 用注射器向制得的混合液中注入200300mL蓖麻油并移入高剪切乳化机， 以1200013000r/min转速进行乳化， 在乳化过程中。
5、再逐滴滴入510mL蔗糖脂肪酸酯， 滴 加完毕后继续乳化510min； （5） 乳化结束后将乳化液倒入400500mL质量浓度为5%氯化钙溶液中， 用搅拌棒搅拌 均匀后静置沉淀过夜， 再过滤分离得到沉淀物， 将得到的沉淀物用含有5%脂肪酸甘油酯水 溶液冲洗12h， 放入烘箱在105110下干燥至恒重； （6） 称取2030g上述冲洗干燥后的烘干物放入装有300500mL步骤 （2） 制备的漆酶酶 液的漩涡振荡仪中， 以3050W功率在3040下振荡吸附1224h后滤出， 真空干燥后即 得一种磁性海藻酸钠固化漆酶。 2.根据权利要求1所述的一种磁性海藻酸钠固化漆酶的制备方法， 其特征在于： 所述。
6、的 基础液体培养基是由11.2L马铃薯浸出液、 1525g葡萄糖、 23g蛋白胨、 35g磷酸二氢 钾和24g硫酸镁混合而成。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105505914 A 2 一种磁性海藻酸钠固化漆酶的制备方法 技术领域 0001 本发明公开了一种磁性海藻酸钠固化漆酶的制备方法， 属于固定化酶制备技术领 域。 背景技术 0002 漆酶是一种含铜多酚氧化酶， 广泛存在于真菌、 细菌和植物中。 漆酶具有较广泛的 底物专一性和较强的稳定性， 能催化许多酚类和芳香胺类物质， 如苯酚、 对氯苯酚、 苯胺以 及多酚和多胺类物质， 因而在生物传感器、 生物燃料电池、 生物转化及废水处理等领域具。
7、有 广泛应用。 但是由于漆酶易溶于水， 在水中游离的漆酶不可回收也不能长期保存， 且在高温 或其他极端环境下漆酶的稳定性不易保持， 因而限制了漆酶的实际应用。 0003 游离的漆酶因在使用过程中易随环境的变化变性失活、 易混入产品和不易循环利 用等使其应用受到限制， 对漆酶进行固定化是实现其重复利用、 改善其稳定性的有效方法。 固定化漆酶是指将水溶性漆酶以物理或化学的方法固定在有机或无机载体上， 形成不溶于 水的具有酶活性的衍生物， 在催化反应中， 它以固相状态作用于底物， 反应完成后， 容易与 水溶性反应物分离， 可反复使用。 0004 固定化技术在保持游离漆酶的专一、 高效的催化活性的同时。
8、， 且比水溶性酶稳定， 可较长期使用， 更是提高漆酶重复利用性、 操控性和稳定性的有效手段， 常用的固定化载体 包括活性炭、 壳聚糖、 多孔硅胶以及微滤膜等多种材料， 但现有的固定化材料存在固定化效 率低、 加工工艺复杂、 分离困难以及操作性不高等缺陷。 发明内容 0005 本发明主要解决的技术问题： 针对目前传统漆酶易溶于水， 在水中游离不可回收 也不能长期保持， 且在高温或其他极端环境下稳定性不易保持， 容易变性失活， 因此限制了 应用， 而常用的固定化技术虽可以保持游离漆酶的催化活性， 提高利用率和稳定性， 但使用 的固定化材料存在固定化效率低、 加工工艺复杂、 分离困难以及操作性不高等。
9、现状， 提供了 一种利用产漆菌种发酵制得漆酶酶液， 掺加磁性粒子， 辅以海藻酸钠对其固定， 振荡吸附后 干燥， 从而得到磁性海藻酸钠固定化漆酶。 该方法工艺简单， 成本低廉， 制得的磁性海藻酸 钠固定化漆酶不仅活力在250IU/mL以上， 总产量也提高至8590， 均达到了较高水平， 而 且纳米级磁性粒子的掺入使其更容易进行吸附， 易于分离， 使得固定化漆酶回收率提高， 稳 定性也得到显著增强， 具有优异的性能。 0006 为了解决上述技术问题， 本发明所采用的技术方案是： （1） 按接种量为培养基底物质量57%将白毒鹅膏菌接种到装有50100mL基础液体培 养基的300mL三角瓶中， 放置在。
10、摇床上在2530下以100200rpm的速率恒温振荡培养3 5天， 用无菌水淋洗菌丝表面并收集淋洗液， 得到菌丝悬浮液， 于46下保存； （2） 向80100mL基础液体培养基中分别加入12% （w/v） 茶叶、 12% （w/v） 豆粕和1 2% （w/v） 蔗渣组成的混合物以及510mL浓度为0.5mol/L硫酸铜溶液， 混合均匀后再加入20 说明书 1/5 页 3 CN 105505914 A 3 25mL上述制备的菌丝悬浮液， 放入恒温箱在2535下发酵78天， 再将发酵液移入卧 式离心机， 以70009000r/min转速离心分离， 得上清液即为漆酶酶液， 备用； （3） 按摩尔比为。
11、3:2将浓度为0.3mol/L氯化铁和0.2mol/L氯化亚铁溶液混合均匀， 取 100200mL混合液装入300mL三口烧瓶中， 用质量浓度为17%氨水调节pH至910后， 向烧瓶 中以10mL/min速率持续通入氮气并移入水浴锅中， 升温至7585保温熟化3040min， 在 磁场作用下吸附分离， 得纳米级磁性粒子； （4） 取13g纳米级磁性粒子在超声作用下分散于4050mL浓度为10%海藻酸钠溶液 中， 制得混合液， 用注射器向制得的混合液中注入200300mL蓖麻油并移入高剪切乳化机， 以1200013000r/min转速进行乳化， 在乳化过程中再逐滴滴入510mL蔗糖脂肪酸酯， 滴。
12、 加完毕后继续乳化510min； （5） 乳化结束后将乳化液倒入400500mL质量浓度为5%氯化钙溶液中， 用搅拌棒搅拌 均匀后静置沉淀过夜， 再过滤分离得到沉淀物， 将得到的沉淀物用含有5%脂肪酸甘油酯水 溶液冲洗12h， 放入烘箱在105110下干燥至恒重； （6） 称取2030g上述冲洗干燥后的烘干物放入装有300500mL步骤 （2） 制备的漆酶酶 液的漩涡振荡仪中， 以3050W功率在3040下振荡吸附1224h后滤出， 真空干燥后即 得一种磁性海藻酸钠固化漆酶。 0007 所述的基础液体培养基是由11.2L马铃薯浸出液、 1525g葡萄糖、 23g蛋白 胨、 35g磷酸二氢钾和2。
13、4g硫酸镁混合而成。 0008 本发明的应用方法是： 使用时， 取本发明制得的磁性海藻酸钠固定化漆酶加入废 水池中， 其中加入量为每13L废水中加入510g固定化漆酶， 加入完毕后对池底进行曝 气， 使固定化酶与废水充分混合均匀， 处理35h后， 检测废水， 测得废水中的COD从原来的 30005000mg/L降低到了300500mg/L， 去除率达到了90以上， 处理结束后用磁性装置 回收固定化酶即可。 0009 本发明的有益效果是： （1） 本发明操作简便， 大大降低了生产成本； （2） 本发明制得的磁性海藻酸钠固定化漆酶活力在250IU/mL以上， 总产量提高至85 以上， 均达到了较高。
14、水平， 具有广泛的工业使用价值和显著的经济效益； （3） 本发明利用纳米级磁性粒子对固定化漆酶进行吸附， 易于分离， 使其活性回收率 高， 提高了漆酶的稳定性； （4） 本发明制得的磁性海藻酸钠固定化漆酶活性高， 可以广泛应用于纺织印染、 造纸、 草坪修复、 能源再生、 饲料、 食品、 废水处理等方面。 具体实施方式 0010 首先按接种量为培养基底物质量57%将白毒鹅膏菌接种到装有50100mL基础 液体培养基的300mL三角瓶中， 放置在摇床上在2530下以100200rpm的速率恒温振荡 培养35天， 用无菌水淋洗菌丝表面并收集淋洗液， 得到菌丝悬浮液， 于46下保存； 然 后向8010。
15、0mL基础液体培养基中分别加入12% （w/v） 茶叶、 12% （w/v） 豆粕和12% （w/ v） 蔗渣组成的混合物以及510mL浓度为0.5mol/L硫酸铜溶液， 混合均匀后再加入20 25mL上述制备的菌丝悬浮液， 放入恒温箱在2535下发酵78天， 再将发酵液移入卧式 说明书 2/5 页 4 CN 105505914 A 4 离心机， 以70009000r/min转速离心分离， 得上清液即为漆酶酶液， 备用； 随后按摩尔比为 3:2将浓度为0.3mol/L氯化铁和0.2mol/L氯化亚铁溶液混合均匀， 取100200mL混合液装 入300mL三口烧瓶中， 用质量浓度为17%氨水调节。
16、pH至910后， 向烧瓶中以10mL/min速率持 续通入氮气并移入水浴锅中， 升温至7585保温熟化3040min， 在磁场作用下吸附分 离， 得纳米级磁性粒子； 接下来取13g纳米级磁性粒子在超声作用下分散于4050mL浓度 为10%海藻酸钠溶液中， 制得混合液， 用注射器向制得的混合液中注入200300mL蓖麻油并 移入高剪切乳化机， 以1200013000r/min转速进行乳化， 在乳化过程中再逐滴滴入5 10mL蔗糖脂肪酸酯， 滴加完毕后继续乳化510min； 乳化结束后将乳化液倒入400500mL 质量浓度为5%氯化钙溶液中， 用搅拌棒搅拌均匀后静置沉淀过夜， 再过滤分离得到沉淀物。
17、， 将得到的沉淀物用含有5%脂肪酸甘油酯水溶液冲洗12h， 放入烘箱在105110下干燥 至恒重； 最后称取2030g上述冲洗干燥后的烘干物放入装有300500mL上述制备的漆酶 酶液的漩涡振荡仪中， 以3050W功率在3040下振荡吸附1224h后滤出， 真空干燥后 即得一种磁性海藻酸钠固化漆酶。 其中所述的基础液体培养基是由11.2L马铃薯浸出液、 1525g葡萄糖、 23g蛋白胨、 35g磷酸二氢钾和24g硫酸镁混合而成。 0011 实例1 首先按接种量为培养基底物质量5%将白毒鹅膏菌接种到装有50mL基础液体培养基的 300mL三角瓶中， 放置在摇床上在25下以100rpm的速率恒温振。
18、荡培养3天， 用无菌水淋洗 菌丝表面并收集淋洗液， 得到菌丝悬浮液， 于4下保存； 然后向80100mL基础液体培养基 中分别加入1% （w/v） 茶叶、 1% （w/v） 豆粕和1% （w/v） 蔗渣组成的混合物以及5mL浓度为 0.5mol/L硫酸铜溶液， 混合均匀后再加入20mL上述制备的菌丝悬浮液， 放入恒温箱在25 下发酵7天， 再将发酵液移入卧式离心机， 以7000r/min转速离心分离， 得上清液即为漆酶酶 液， 备用； 随后按摩尔比为3:2将浓度为0.3mol/L氯化铁和0.2mol/L氯化亚铁溶液混合均 匀， 取1000mL混合液装入300mL三口烧瓶中， 用质量浓度为17%。
19、氨水调节pH至9后， 向烧瓶中 以10mL/min速率持续通入氮气并移入水浴锅中， 升温至75保温熟化30min， 在磁场作用下 吸附分离， 得纳米级磁性粒子； 接下来取1g纳米级磁性粒子在超声作用下分散于40mL浓度 为10%海藻酸钠溶液中， 制得混合液， 用注射器向制得的混合液中注入200mL蓖麻油并移入 高剪切乳化机， 以12000r/min转速进行乳化， 在乳化过程中再逐滴滴入5mL蔗糖脂肪酸酯， 滴加完毕后继续乳化5min； 乳化结束后将乳化液倒入400mL质量浓度为5%氯化钙溶液中， 用 搅拌棒搅拌均匀后静置沉淀过夜， 再过滤分离得到沉淀物， 将得到的沉淀物用含有5%脂肪 酸甘油酯。
20、水溶液冲洗1h， 放入烘箱在105下干燥至恒重； 最后称取20g上述冲洗干燥后的 烘干物放入装有300mL上述制备的漆酶酶液的漩涡振荡仪中， 以30W功率在30下振荡吸附 12h后滤出， 真空干燥后即得一种磁性海藻酸钠固化漆酶。 其中所述的基础液体培养基是由 1L马铃薯浸出液、 15g葡萄糖、 2g蛋白胨、 3g磷酸二氢钾和2g硫酸镁混合而成。 0012 本发明的应用方法是： 使用时， 取本发明制得的磁性海藻酸钠固定化漆酶加入废 水池中， 其中加入量为每1L废水中加入5g固定化漆酶， 加入完毕后对池底进行曝气， 使固定 化酶与废水充分混合均匀， 处理3h后， 检测废水， 测得废水中的COD从原。
21、来的3000mg/L降低 到了300mg/L， 去除率达到了90， 处理结束后用磁性装置回收固定化酶即可。 0013 实例2 首先按接种量为培养基底物质量6%将白毒鹅膏菌接种到装有80mL基础液体培养基的 说明书 3/5 页 5 CN 105505914 A 5 300mL三角瓶中， 放置在摇床上在28下以150rpm的速率恒温振荡培养4天， 用无菌水淋洗 菌丝表面并收集淋洗液， 得到菌丝悬浮液， 于5下保存； 然后向90mL基础液体培养基中分 别加入1.5% （w/v） 茶叶、 1.5% （w/v） 豆粕和1.5% （w/v） 蔗渣组成的混合物以及8mL浓度为 0.5mol/L硫酸铜溶液， 。
22、混合均匀后再加入23mL上述制备的菌丝悬浮液， 放入恒温箱在30 下发酵7.5天， 再将发酵液移入卧式离心机， 以8000r/min转速离心分离， 得上清液即为漆酶 酶液， 备用； 随后按摩尔比为3:2将浓度为0.3mol/L氯化铁和0.2mol/L氯化亚铁溶液混合均 匀， 取150mL混合液装入300mL三口烧瓶中， 用质量浓度为17%氨水调节pH至9.5后， 向烧瓶中 以10mL/min速率持续通入氮气并移入水浴锅中， 升温至80保温熟化35min， 在磁场作用下 吸附分离， 得纳米级磁性粒子； 接下来取2g纳米级磁性粒子在超声作用下分散于45mL浓度 为10%海藻酸钠溶液中， 制得混合液。
23、， 用注射器向制得的混合液中注入250mL蓖麻油并移入 高剪切乳化机， 以12500r/min转速进行乳化， 在乳化过程中再逐滴滴入8mL蔗糖脂肪酸酯， 滴加完毕后继续乳化8min； 乳化结束后将乳化液倒入450mL质量浓度为5%氯化钙溶液中， 用 搅拌棒搅拌均匀后静置沉淀过夜， 再过滤分离得到沉淀物， 将得到的沉淀物用含有5%脂肪 酸甘油酯水溶液冲洗1.5h， 放入烘箱在108下干燥至恒重； 最后称取25g上述冲洗干燥后 的烘干物放入装有400mL上述制备的漆酶酶液的漩涡振荡仪中， 以40W功率在35下振荡吸 附20h后滤出， 真空干燥后即得一种磁性海藻酸钠固化漆酶。 其中所述的基础液体培养。
24、基是 由1.1L马铃薯浸出液、 20g葡萄糖、 2.5g蛋白胨、 4g磷酸二氢钾和3g硫酸镁混合而成。 0014 本发明的应用方法是： 使用时， 取本发明制得的磁性海藻酸钠固定化漆酶加入废 水池中， 其中加入量为每2L废水中加入8g固定化漆酶， 加入完毕后对池底进行曝气， 使固定 化酶与废水充分混合均匀， 处理4h后， 检测废水， 测得废水中的COD从原来的5000mg/L降低 到了300mg/L， 去除率达到了94， 处理结束后用磁性装置回收固定化酶即可。 0015 实例3 首先按接种量为培养基底物质量7%将白毒鹅膏菌接种到装有100mL基础液体培养基的 300mL三角瓶中， 放置在摇床上在。
25、30下以200rpm的速率恒温振荡培养5天， 用无菌水淋洗 菌丝表面并收集淋洗液， 得到菌丝悬浮液， 于6下保存； 然后向100mL基础液体培养基中分 别加入2% （w/v） 茶叶、 2% （w/v） 豆粕和2% （w/v） 蔗渣组成的混合物以及10mL浓度为0.5mol/L 硫酸铜溶液， 混合均匀后再加入25mL上述制备的菌丝悬浮液， 放入恒温箱在35下发酵8 天， 再将发酵液移入卧式离心机， 以9000r/min转速离心分离， 得上清液即为漆酶酶液， 备 用； 随后按摩尔比为3:2将浓度为0.3mol/L氯化铁和0.2mol/L氯化亚铁溶液混合均匀， 取 200mL混合液装入300mL三口。
26、烧瓶中， 用质量浓度为17%氨水调节pH至10后， 向烧瓶中以 10mL/min速率持续通入氮气并移入水浴锅中， 升温至85保温熟化40min， 在磁场作用下吸 附分离， 得纳米级磁性粒子； 接下来取3g纳米级磁性粒子在超声作用下分散于50mL浓度为 10%海藻酸钠溶液中， 制得混合液， 用注射器向制得的混合液中注入300mL蓖麻油并移入高 剪切乳化机， 以13000r/min转速进行乳化， 在乳化过程中再逐滴滴入10mL蔗糖脂肪酸酯， 滴 加完毕后继续乳化10min； 乳化结束后将乳化液倒入500mL质量浓度为5%氯化钙溶液中， 用 搅拌棒搅拌均匀后静置沉淀过夜， 再过滤分离得到沉淀物， 将。
27、得到的沉淀物用含有5%脂肪 酸甘油酯水溶液冲洗2h， 放入烘箱在110下干燥至恒重； 最后称取30g上述冲洗干燥后的 烘干物放入装有500mL上述制备的漆酶酶液的漩涡振荡仪中， 以50W功率在40下振荡吸附 24h后滤出， 真空干燥后即得一种磁性海藻酸钠固化漆酶。 其中所述的基础液体培养基是由 说明书 4/5 页 6 CN 105505914 A 6 1.2L马铃薯浸出液、 25g葡萄糖、 3g蛋白胨、 5g磷酸二氢钾和4g硫酸镁混合而成。 0016 本发明的应用方法是： 使用时， 取本发明制得的磁性海藻酸钠固定化漆酶加入废 水池中， 其中加入量为每3L废水中加入10g固定化漆酶， 加入完毕后对池底进行曝气， 使固 定化酶与废水充分混合均匀， 处理5h后， 检测废水， 测得废水中的COD从原来的5000mg/L降 低到了400mg/L， 去除率达到了92， 处理结束后用磁性装置回收固定化酶即可。 说明书 5/5 页 7 CN 105505914 A 7 。