技术领域
本发明涉及一种含三唑环的不对称二硫醚类化合物及其在制备除草剂中的用途，具体涉 及到该类化合物在体外对拟南芥乙酰乳酸合成酶(acetohydroxyacid synthase，AHAS)的抑制 作用，以及在体内对油菜根长的抑制作用。
背景技术
当今世界，人口过多造成严重的粮食短缺，并且由于环境保护的要求，人类需要除草剂 继续发挥作用，但同时对环境不造成污染和负面影响，对人畜安全。因此，寻找作用于人畜 体内没有的特异靶标进行农药分子设计是重要的除草剂研究开发策略。
乙酰乳酸合成酶AHAS催化支链氨基酸的生物合成是一个对哺乳动物高度安全的靶点 (Duggleby，R.G.，et al.J.Biochem.Mol.Biol.2000，33(1)，1-36)。事实上，近30年来，广泛应 用的磺酰脲、咪唑啉酮、嘧啶氧(硫)苯甲酸、三唑嘧啶磺酰胺等四大类正是靶向AHAS的 除草剂，在世界范围的植物保护领域发挥了巨大的作用。但是，随着这些已有类型的除草剂 广泛使用，杂草针对已知的四大类AHAS抑制剂逐渐产生抗性问题已不可忽视。因此，靶向 AHAS设计全新结构的除草剂将成为刻不容缓的历史使命。
AHAS的三维晶体结构在本世纪初期被相继解析(Pang，S.S.，et al.J.Bio.Chem.2003. 278，7639-7644；McCourt，J.A.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2006，103，569-573.)，使得人们 有条件基于原有抑制剂的结合模式，理性设计新的AHAS抑制剂化合物。2007年，我们通过 虚拟筛选的方法发现二硫醚类化合物是拟南芥AHAS抑制剂(Wang，J.G.，et al.Bioorg.Med. Chem.2007，15，374-380)。
2005年，韩国科学家Yoon小组通过高通量筛选的方法发现不对称二硫醚类化合物对肺 结核病菌AHAS有抑制(Yoon，M.Y.et al.Febs Lett.2005，579，4903-4910)，之后又发现了该 类化合物对感冒病菌的AHAS有抑制(Yoon，M.Y.et al.Arch.Biochem.Biophy.2007，466， 24-30)。说明二硫醚类化合物有望成为新的AHAS抑制剂类型。
迄今为止，不对称芳香二硫醚类化合物对植物AHAS的抑制活性和除草活性未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的含三唑环的不对称二硫醚类化合物及其合成方法和用 途，含三唑环的不对称二硫醚类化合物用于制备除草剂，特别是在体外对拟南芥AHAS有明 显的抑制作用，在体内对油菜根长有明显的抑制作用。
本发明提供的含三唑环的不对称二硫醚类化合物如式(I)所示：
其中，R1为H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷硫基、卤素或硝基、卤代C1-C6碳烷 基、卤代C1-C6烷氧基、卤代C1-C6烷硫基、苯基、3-吡啶基、4-吡啶基；其中所述苯基、3- 吡啶基、4-吡啶基是未取代的或者任选被一个或多个选自下列的基团取代的苯基：卤素、 C1-C4烷基或卤代C1-C4烷基；
R2的位置为苯环上可被取代的任意位置，R2为H，或R2为苯环上的单取代或多取代基， 分别是：卤素、硝基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧羰基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷硫基、卤代C1-C6烷基、卤代C1-C6烷氧羰基、卤代C1-C6烷氧基、卤代C1-C6烷硫基或3，4-苯并基，其中，多 取代时，取代基可相同或不同；
本发明进一步优选：
R1为H、C1-C3烷基、苯基、对甲苯基、4-吡啶基、3-吡啶基；
R2为H、邻位硝基、邻或对位卤素、对位C1-C3烷基、邻位C1-C3烷氧羰基、对位C1-C3烷氧基或3，4-苯并基。
本发明提供的含三唑环的不对称二硫醚类化合物的合成方法包括的步骤：
将等物质的量(即摩尔数)的取代4H-[1，2，4]-三唑-3-硫酚(II)加入到取代苯次磺酰氯 (III)的乙醚溶液当中，室温反应1-5个小时，过滤，无水乙醚洗涤，即得目标化合物(I)， 产率大于90％。
通过离体拟南芥AHAS抑制活性实验表明，本发明的含三唑环的不对称二硫醚类化合物 对野生型拟南芥AHAS和部分抗性拟南芥AHAS有很强的抑制效果，因此本发明的含三唑环 的不对称二硫醚类化合物可用于制备AHAS抑制剂的活性化合物。
通过油菜根长法实验表明，本发明的含三唑环的不对称二硫醚类化合物在100mg/L浓度 下对油菜根长的生长有很好的抑制效果，因此本发明的含三唑环的不对称二硫醚类化合物可 用于制备农用除草剂。
本发明还提供一种除草剂，该除草剂含有上述的含三唑环的不对称二硫醚类化合物以及 一种或多种农业上可接受的载体及盐类。
具体实施方式
本发明实质性特点可以从下述实施例中得以体现，但这些实施例仅作为说明，而不是对 本发明进行限制。
本发明使用的试剂及原料除特别指出外，其余均为市售。其中实施例1采用的所有硫酚 均购自阿拉丁试剂(上海)有限公司。
实施例1：苯次磺酰氯的制备
将1.1g(10mmol)苯硫酚溶于20mL二氯甲烷中，冰水浴温度条件下，滴加1.35g(10mmol) 磺酰氯，搅拌1h，真空脱掉溶剂，得到红色苯次磺酰氯1.36g，产率95％，直接用于下一步反 应。
同样，可以制备对甲基苯次磺酰氯，对甲氧基苯次磺酰氯，对溴苯次磺酰氯，邻氟苯次 磺酰氯，邻甲基苯次磺酰氯，β-萘次磺酰氯。
实施例2：邻甲氧羰基苯次磺酰氯的制备
将5g(16.3mmol)2，2′-二硫代二苯甲酸溶于37.5mL无水甲醇中，搅拌，缓缓滴加1.5mL 浓硫酸，加热回流72h，冷却至室温，真空脱掉过量甲醇，用饱和碳酸钠溶液中和浓缩液，使 pH值达7-8，乙酸乙酯萃取有机层，用饱和食盐水洗涤，硫酸镁干燥，真空浓缩得到灰色2，2′- 二硫代二苯甲酸甲酯固体4.5g(产率82.5％)。
参考实施例1的方法可以制备邻甲氧羰基苯次磺酰氯。
同样，可以制备邻乙氧羰基苯次磺酰氯。
实施例3：邻硝基苯次磺酰氯的制备
将1.93g(84mmol)金属钠小心缓慢加入50mL无水乙醇中，待反应完毕后，加入溶于 25mL无水甲醇的10.33g(83mmol)苄硫醇。然后滴加13.13g(83mmol)邻硝基氯苯，加热 回流1h，冷却至室温，抽滤得到黄色固体，再用甲醇重结晶得2-硝基苯基苄基硫醚18.39g(产 率90.3％)。
将6.8g(50mmol)磺酰氯溶于25mL三氯甲烷，在常温搅拌下慢慢将其滴加入12.2g (50mmol)2-硝基苯基苄基硫醚的80mL的三氯甲烷溶液中，滴加完毕后升温至45℃，此时 反应物完全溶解，控制在该温度下反应0.5h，减压除去溶剂得到黄色油状物，向其中加入 100mL石油醚得到黄色絮状固体，乙醚纯化得邻硝基苯次磺酰氯5.23g(产率55.2％)。
实施例4：5-甲基-4H-[1，2，4]-三唑-3-硫酚的制备
5mL乙酸在圆底烧瓶中油浴加热15min，然后加入1.37g(15mmol)氨基硫脲，全溶后， 继续搅拌加热30min。然后加入6mL沸水，混合物在冰浴下冷却，过滤，得白色沉淀物，干 燥得1.84g乙酰氨基硫脲(产率92.0％)。
将0.67g(5mmol)乙酰氨基硫脲和10％的氢氧化钾(5ml)混合，加热回流1h。然后将 混合物冷却至室温并过滤，滤液用浓盐酸酸化使pH达3-4，抽滤，干燥，得到5-甲基-4H-[1，2，4]- 三唑-3-硫酚白色固体0.55g(产率95.5％)。
同样，可以制备4H-[1，2，4]-三唑-3-硫酚。
实施例5：5-苯基-4H-[1，2，4]-三唑-3-硫酚的制备
1.4g(10mmol)苯甲酰氯溶于15mL四氢呋喃当中，冷却至15℃，分批加入1.0g(11mmol) 氨基硫脲，在室温下搅拌反应6h。然后加入15mL饱和碳酸氢钠溶液，再用30mL乙酸乙酯 萃取，有机相再依次用15mL饱和碳酸氢钠洗涤、盐水洗涤，无水硫酸镁干燥后，乙醇重结 晶，得苯甲酰氨基硫脲1.56g(产率80.2％)。
参考实施例4，可以制备5-苯基-4H-[1，2，4]-三唑-3-硫酚。
同样，可以制备5-(4-甲基)苯基-4H-[1，2，4]-三唑-3-硫酚。
实施例6：5-(4-吡啶基)-4H-[1，2，4]-三唑-3-硫酚的制备
在-10℃下，10mL氯化亚砜慢慢加入到18mL含有1.23g(10mmol)异烟酸溶液当中， 混合物加热回流6h后，冷却至室温，真空脱掉多余的乙醇和氯化亚砜。得到的白色物质溶于 水中，用碳酸钾调节pH值为8-9，然后用乙酸乙酯萃取，有机层用无水硫酸钠干燥过夜。真 空脱掉乙酸乙酯，得到黄色油状的异烟酸乙酯1.49g(产率96.7％)，直接用于下一步反应。
将1.44g(10mmol)异烟酸乙酯和2mL水合肼混合，加热回流6h，冷却至室温，过滤， 用冷的乙酸乙酯洗涤，干燥，得到白色的异烟酰肼固体1.0g(产率73％)。
将1.37g(10mmol)异烟酰肼用30％的盐酸溶液调节pH值到3，在30℃下加入硫氰酸 钾1.2g(13mmol)和丙酮(0.2ml)，加热回流4.5h，冷却至室温，过滤，滤饼用2mL 5％的氢 氧化钠溶液和2mL水依次洗涤，干燥，得到黄色的异烟酰氨基硫脲1.0g(产率51％)。
参考实施例4的第二步，可以制备得到5-(4-吡啶基)-4H-[1，2，4]-三唑-3-硫酚。
同样，可以制备得到5-(3-吡啶基)-4H-[1，2，4]-三唑-3-硫酚。
实施例7：3-对甲苯二硫基-1H-[1，2，4]-三唑的制备
将0.5g(5mmol)4H-[1，2，4]-三唑-3-硫酚加入到0.8g(5mmol)对甲苯次磺酰氯的乙醚溶 液当中，室温反应1-5个小时，过滤，无水乙醚洗涤，即得目标化合物，粗品过柱，得1.06g 白色3-对甲苯二硫基-1H-[1，2，4]-三唑(化合物1，产率95％)。
同样，可以制备本发明的其他化合物(2-48)。
目标化合物的结构式和物化参数见表1，1H NMR及高分辨质谱见表2。
实施例8：离体拟南芥AHAS(AtAHAS)抑制活性测定。
将构建好的pET-AtAHAS：T86-CHis载体转入大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导其表达， 再利用固定金属亲和色谱IMAC纯化后提纯蛋白。纯化的蛋白保存于-80℃冰箱中，以保持其 酶活性(Hill，C.M.et al.Biochem.J.1997，327，891-898)。
应体系缓冲溶液的配制：所有的辅助因子及底物均配制成母液于-20℃保存，FAD配制 成100μM的母液，ThDP为10mM，MgCl2为100mM，丙酮酸钠为500mM。配制500mM的 磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.0)。在抑制活性测定时，取各溶液25μL于1.5mL离心管中，加入90μL Milli Q纯净水，以及不同浓度的化合物(1-48)溶液25μL。
AtAHAS的活性检测：向反应体系中加入10μL AHAS酶液，酶所催化的反应即被引发。 反应于37℃进行30min，之后加入25μL 10％H2SO4将其终止。在60℃加热15min，使生成 的乙酰乳酸脱羧，全部转变成3-羟基-2-丁酮，此时加入250μL 5％α-萘酚(溶于4M NaOH液) 和250μL 0.5％肌酸溶液，于60℃再反应15min后读取OD525。与空白进行对照计算抑制率。
抑制常数Ki测定时，对于每一个化合物，都要进行一个大区间和一个小区间下多种浓度 同时测定，才能够进行表观抑制常数的计算。具体做法为：首先将化合物(1，6)在实际反 应体系中的浓度设定在1×10-4M，3×10-5M，1×10-5M......1×10-8M，3×10-9M，1×10-9M，找 到抑制区间可能出现的范围，然后在一个较小的浓度范围内(如0，1×10-7M，1.5×10-7M， 2×10-7M，3×10-7M，5×10-7M，7×10-7M，1×10-6M，1.5×10-6M，2×10-6M，3×10-6M，5×10-6M。 每个平行3次)测定抑制常数Ki。
同样的，可以表达纯化突变性W574L-AtAHAS并测定抑制活性和抑制常数。
RF(resistance factor，抗性指数)，是化合物对突变体的抑制常数与化合物对野生型的抑制 常数的比值，即RF＝Ki(突变型)/Ki(野生型)。RF小于1，表示突变体对化合物的抑制作用表 现的比野生型敏感；RF等于1，表示突变体和野生型酶对化合物的抑制表现出相似的敏感性； 1＜RF＜5，表示突变体对化合物抑制表现出较弱抗性。5＜RF＜10，表示突变体对化合物抑制表 现出中等程度抗性。RF＞10，表示突变体对化合物抑制表现出较高程度的抗性。
实施例9：对油菜根长的抑制活性测定。
在直径6cm的培养皿中铺好一张直径5.6cm的滤纸，加入2mL浓度为100mg/L的供试 化合物(1-48)溶液，播种浸种4h的油菜种子10粒。28℃下，黑暗培养72h后测定胚根长 度来检测化合物的除草活性。
目标化合物抑制野生型AtAHAS的活性以及除草活性数据(百分比抑制率)见表3，化合物 1和6对野生型AtAHAS和突变型AtAHAS的Ki值见表4。
从表3的结果来看，本发明多数化合物在100mg/L浓度下对野生型AtAHAS的抑制率 ＞80％，而化合物2、3、4在3mg/L浓度下对野生型AtAHAS的抑制率＞80％；同时许多化合 物在100mg/L浓度下对油菜根长有很好的抑制活性(70～90％)。
从表4中的结果来看，典型的磺酰脲除草剂单嘧磺酯(由南开大学农药国家工程研究 中心提供)对于野生型AtAHAS活性远高于本发明的化合物，但是对于抗性的AtAHAS 其抑制活性还低于1和6号化合物；典型的咪唑啉酮类AHAS抑制剂灭草喹(Imazaquin， 样品从商业渠道购买)对野生型AtAHAS的Ki与本发明的1和6号化合物接近，但是对 于抗性的AtAHAS的Ki与1和6号化合物相比，却高了几十倍。
综合表3和表4的结果，表明含三唑环的不对称二硫醚类化合物是一类全新结构的 AHAS抑制剂，对抗性的AtAHAS抑制活性比商品化AHAS抑制剂有更为明显的优势，同 时该类化合物表现出较好的除草活性，该类化合物有望发展出具有真正应用前景的全新靶 向AHAS的除草剂。
表1.目标化合物1-48的物化参数
表2.目标化合物的1HNMR以及高分辨质谱
表3.目标化合物对野生型AtAHAS和油菜根长的抑制活性
表4.化合物1和6抑制野生型和突变型AtAHAS的抑制常数