一种降血压肽的制备方法.pdf

一种降血压肽的制备方法，涉及一种降血压肽。提供一种生产成本较低，便于进行规模化生产的降血压肽的制备方法。配制固体平板培养基，将冻存的大肠杆菌工程菌涂板后培养活化，再挑取单菌落接种入灭菌后种子培养基中，得工作种子液；将培养基倒入发酵罐中；灭菌后冷却，加入消泡剂，将工作种子液接种于发酵罐中，校正相对溶氧水平达100％；在发酵过程中，调节转速和通气量使DO维持在溶氧为10％～80％，培养后补料；乳糖诱导，加入乳糖至终浓度0.1％～2％，将发酵液离心，取沉淀，用1×PBS缓冲液清洗，收集菌体；将菌体超声破碎，离心，取上清液，即获得降血压肽。

1.  一种降血压肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)工作种子液的制备：配制固体平板培养基，将冻存的大肠杆菌工程菌E.coliBL21/VLPVP涂板后培养活化，再挑取单菌落接种入灭菌后种子培养基中，摇床培养得活化菌种，即得工作种子液；
2)接种前准备：洗净发酵罐，用pH7.0和pH10.01标准液校正发酵罐的pH计探头，然后将已配制好的经优化的培养基倒入发酵罐中，高压灭菌后冷却，高压过程中校正溶解氧DO为0％；
3)接种，培养：灭菌结束待冷却到37℃后，在火焰圈的保护下加入消泡剂，以1％～6％的接种量将工作种子液接种于发酵罐中，培养温度为23～44℃，起始pH为6～7.5，校正相对溶氧水平达100％；
4)补料：在发酵过程中，调节转速和通气量使DO维持在溶氧为10％～80％，培养1～4h后开始补料；
5)乳糖诱导表达VLPVPR重组蛋白阶段：停止补料后，开始乳糖诱导，诱导的条件为诱导温度23～44℃，加入乳糖至终浓度0.1％～2％，诱导时间为5～8h；
6)菌体收集：将步骤5)的发酵液离心，取沉淀，用1×PBS缓冲液清洗，收集菌体；
7)获得降血压肽：将步骤6)制得的菌体超声破碎，离心，取上清液，即获得降血压肽；
8)SDS-PAGE电泳检测GST融合蛋白表达量：取获得的降血压肽进行SDS-PAGE电泳，经染色和脱色后观察VLPVPR重组蛋白的表达情况。

2.  如权利要求1所述的一种降血压肽的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述固体平板培养基的配方为：酵母提取物10g/L，胰蛋白胨16g/L，氯化钠5g/L，琼脂10g/L，pH为7.0，灭菌冷却后加入氨苄青霉素至终浓度为100mg/L。

3.  如权利要求1所述的一种降血压肽的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述培养活化在37℃恒温培养箱活化18～24h。

4.  如权利要求1所述的一种降血压肽的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述种子培养基的配方为：酵母提取物10g/L，胰蛋白胨16g/L，氯化钠5g/L，pH为7.0，灭菌冷却后加入氨苄青霉素至终浓度为100mg/L。

5.  如权利要求1所述的一种降血压肽的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述经优化的培养基，按质量百分比的含量为：酵母粉0.5％～3.5％，蛋白胨0.5％～3％，，葡萄糖0％～3％，NaCl 0.5％～3％，其余为水。

6.  如权利要求1所述的一种降血压肽的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述接种量为2％，培养温度为37℃，起始pH为7.0。

7.  如权利要求1所述的一种降血压肽的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述溶氧为40％，培养2h后开始补料，所述补料的速度为0.5～1.5mL/min，补料的时间为0.5～2h。

8.  如权利要求1所述的一种降血压肽的制备方法，其特征在于在步骤5)中，所述诱导温度为37℃，加入乳糖至终浓度为2％，诱导时间为6h。

9.  如权利要求1所述的一种降血压肽的制备方法，其特征在于在步骤7)中，所述离心为12000r/min离心15min。

一种降血压肽的制备方法
技术领域
本发明涉及一种降血压肽，尤其是涉及一种采用全自动发酵罐进行高密度发酵的降血压肽的制备方法。
背景技术
高血压是一种高发病率、多并发症的危险疾病，正严重危害着人类身体健康和生活质量。高血压发病机制复杂多样，肾素-血管紧张素调节系统(RAS)调节机制失衡是高血压发病的重要机制之一。血管紧张素转化酶(ACE)在该调节系统中起关键作用，血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)能通过抑制血管紧张素转化酶(ACE)活性而达到抑制血压升高的作用。但由于目前用于临床治疗的该类药物易产生不良反应和毒副作用，因此寻找高效和安全的ACEI成为抗高血压药物研究方向之一。降血压肽(AHP)是一类能够降低人体血压的多肽的总称，它是血管紧张素转化酶(ACE)的抑制剂，可通过抑制人体血管紧张素II的生成而达到降低血压的目的。降血压肽毒副作用低、降压效果明显、来源广泛，已成为抗高血压药物研究的热点之一。目前降血压肽的制备主要采用酶解法，但由于特异性蛋白酶筛选繁琐、分离纯化工艺复杂、产量低等问题而无法实现产业化。利用基因工程技术生产降血压肽是克服上述困难进行大规模生产的重要途径，有广阔应用前景。
公开号为CN101153310的发明专利申请公开一种复合酶解带鱼脊骨制备降血压肽的方法，将带鱼脊骨粉碎后加水搅匀，调节pH，将温度升高到30～45℃，加入弹性蛋白酶，进行酶解反应，然后将酶解液迅速升温至90～100℃，保持10～15min后，再迅速冷却至室温终止反应，调酶解液pH为1.5～3.0，加入胃蛋白酶，进行酶解反应，而后反应体系迅速升温至90～100℃，保持10～15min后，再迅速冷却至室温终止反应，离心后取上清液过滤、真空浓缩、冷冻干燥，得到粉状降血压肽。
公开号为CN101168762的发明专利申请公开一种发酵法利用带鱼脊骨制备降血压肽的方法，将蔗糖、粉碎后的带鱼脊骨、蛋白胨、K₂HPO₄、MgSO₄·7H₂O及水配制成发酵培养基，灭菌后接种地衣芽孢杆菌，经培养得发酵液；发酵液离心后取上清液，将上清液过滤，滤液灭酶；灭酶后的滤液离心，离心上清液用活性碳脱色除味，得脱色除味后的滤液；将脱色除味后的滤液进行超滤，得透过液，透过液真空浓缩后冷冻干燥，得到具有降血压功能的肽粉。
公告号为CN1687444的发明专利提供一种利用酶-膜耦合技术制备紫菜降血压肽的方法及用途。先对干紫菜进行包括粉碎、脱脂、溶解与超声作用的预处理，再对紫菜溶液采用蛋白酶解与膜分离耦合的技术进行紫菜降血压肽的制备与分离，最后通过过滤、浓缩与干燥得到粉状的紫菜降血压肽产品。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生产成本较低，便于进行规模化生产的降血压肽的制备方法。
本发明的技术方案是采用高密度发酵法，优化基因工程菌的培养基和培养条件，采用乳糖诱导剂进行诱导，得到最佳发酵工艺条件。
本发明采用的大肠杆菌工程菌E.coli BL21/VLPVPR可购自GE公司(法玛西亚)，GE公司的信息可参见网址：http://show.bioon.com/consumables/show_product.asp？id＝11364。
本发明包括以下步骤：
1)工作种子液的制备：配制固体平板培养基，将冻存的大肠杆菌工程菌E.coliBL21/VLPVP涂板后培养活化，再挑取单菌落接种入灭菌后种子培养基中，摇床培养得活化菌种，即得工作种子液；
2)接种前准备：洗净发酵罐，用pH7.0和pH10.01标准液校正发酵罐的pH计探头，然后将已配制好的经优化的培养基倒入发酵罐中，高压灭菌后冷却，高压过程中校正溶解氧DO为0％；
3)接种，培养：灭菌结束待冷却到37℃后，在火焰圈的保护下加入消泡剂，以1％～6％的接种量将工作种子液接种于发酵罐中，培养温度为23～44℃，起始pH为6～7.5，校正相对溶氧水平(DO)达100％；
4)补料：在发酵过程中，调节转速和通气量使DO维持在溶氧为10％～80％，培养1～4h后开始补料；
5)乳糖诱导表达VLPVPR重组蛋白阶段：停止补料后，开始乳糖诱导，诱导的条件为诱导温度23～44℃，加入乳糖至终浓度0.1％～2％，诱导时间为5～8h；
6)菌体收集：将步骤5)的发酵液离心，取沉淀，用1×PBS缓冲液清洗，收集菌体；
7)获得降血压肽：将步骤6)制得的菌体超声破碎，离心，取上清液，即获得降血压肽；
8)SDS-PAGE电泳检测GST融合蛋白表达量：取获得的降血压肽进行SDS-PAGE电泳，经染色和脱色后观察VLPVPR重组蛋白的表达情况。
在步骤1)中，所述固体平板培养基的配方最好为：酵母提取物10g/L，胰蛋白胨16g/L，氯化钠5g/L，琼脂10g/L，pH为7.0，灭菌冷却后加入氨苄青霉素至终浓度为100mg/L；所述培养活化最好在37℃恒温培养箱活化18～24h；所述种子培养基的配方最好为：酵母提取物10g/L，胰蛋白胨16g/L，氯化钠5g/L，pH为7.0，灭菌冷却后加入氨苄青霉素至终浓度为100mg/L；所述摇床培养最好在37℃250rpm恒温摇床培养12h。
在步骤2)中，所述经优化的培养基，按质量百分比的含量为：酵母粉0.5％～3.5％，蛋白胨0.5％～3％，，葡萄糖0％～3％，NaCl 0.5％～3％，其余为水；最好为酵母粉3％，蛋白胨2.5％，NaCl 0.5％，水94％。
在步骤3)中，所述接种量最好为2％，培养温度最好为37℃，起始pH最好为7.0，发酵罐可采用全自动生物反应器。
在步骤4)中，所述溶氧最好为40％，最好培养2h后开始补料，所述补料的速度可为0.5～1.5mL/min，最好为1mL/min，补料的时间可为0.5～2h，最好为1h。在发酵过程中，由于发酵罐配有pH探头，可通过自动泵入酸或碱来自动控制pH值。
在步骤5)中，所述诱导温度最好为37℃，加入乳糖最好至终浓度为2％，诱导时间最好为6h。
在步骤7)中，所述离心最好12000r/min离心15min。
上述工艺流程下的发酵液中的GST融合蛋白表达量为27.74％(质量浓度)。
当进行IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导试验对比时，诱导条件为诱导温度为37℃，加入IPTG至终浓度0.5mmol/L，诱导4h。在上述工艺流程下的发酵液中的GST融合蛋白表达量为20.15％(质量浓度)。
与现有的降血压肽的制备方法相比，本发明具有以下突出优点：
1)本发明采用的培养基原料价低易得，并用乳糖代替IPTG诱导剂，很大程度降低了该降血压肽的生产成本。
2)高密度发酵有利于实现产业化。不仅可以减少培养体积，强化下游分离提取，而且可以缩短生产周期，减少设备投资，从而降低生产成本，减少劳动强度，能极大地提高产品在市场上的竞争力。
附图说明
图1为培养条件对GST-AHP表达的影响。在图1中，Mark为对照，1～16为实验号。
图2为诱导条件对GST-AHP表达的影响。在图2中，Mark为对照，1～16为实验号。
图3为比较不同诱导剂对GST-AHP表达的影响。在图3中，1～8为实验号。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
实施例1(优化培养条件)：
选用L₁₆(4⁴)进行正交实验，因素水平见表1，将活化菌种按不同的接种量转接至经过优化的发酵培养基中，在不同的培养条件下培养至OD₆₀₀为1.5时，加IPTG至终浓度0.4mmol/L，30℃诱导5h，取样进行结果分析。电泳结果见图1，正交实验分析结果见表2。
表1培养条件因素水平表

表2培养条件正交实验的结果

(表中的K1～K4是水平1～4的结果的最大差值，R是K1～K4的平均值。)(正交实验分析结果的表示方法。)
GST-AHP表达的最佳培养条件为：培养温度37℃、pH 7.0、装液量20％(v/v)、接种量2％(v/v)。
实施例2(优化乳糖诱导条件)：
选用L₁₆(4⁴)进行正交实验，乳糖诱导条件因素水平表见表3，本实施例研究了诱导温度、诱导起始OD、乳糖终浓度和诱导时间等因素对可溶性融合蛋白的影响。电泳结果见图2，正交实验分析结果见表4。
表3乳糖诱导条件因素水平表

表4诱导条件正交实验的结果

(表中的K1～K4是水平1～4的结果的最大差值，R是K1～K4的平均值。)(正交实验分析结果的表示方法。)
故乳糖的诱导条件为：诱导温度30℃，起始OD值为2.5，乳糖终浓度2％，诱导时间为8h。
实施例3(比较诱导剂IPTG、乳糖)：
为比较乳糖诱导剂和IPTG诱导剂对工程菌诱导表达产生GST-AHP蛋白的不同效果，本实验在各自最优的诱导条件下进行诱导，进行综合比较。诱导结果见图3，其中1，2号为进口培养基的IPTG诱导；3，4号为国产培养基的乳糖诱导；5，6号为空白，即没有添加任何诱导剂；7，8号为国产培养基的IPTG诱导。结果见表5。
表5不同条件的诱导下GST-AHP的含量

结果表明，用乳糖做为诱导剂替代IPTG切实可行。