技术领域
本发明属于医药生物工程领域，尤其涉及一种以人类血液或哺乳动物血液 为原料制备医用凝血因子XIII的方法。
背景技术
凝血因子XIII(又称纤维蛋白稳定因子、纤维蛋白连接酶、转谷氨酰胺酶) 是以酶原(A2B2四聚体，Mr≈320KD)形式存在于血浆中的一种糖蛋白，是正 常凝血所必需的一种血浆蛋白酶，被激活后发挥转氨酶的作用，可催化可溶性 纤维蛋白单体(sFM)分子间的交联反应，形成γ链二聚体以及大分子量的α链多 聚体，增加血块强度，加速伤口愈合。
目前国内外的凝血因子XIII的制备主要从人血浆、酵母细胞中提取，还有 从血小板、胚胎中提取，临床上使用时再经凝血酶催化，在Ca2+参与作用下， 转变成具有活性的A2结构，催化纤维蛋白凝胶进一步共价交联成不溶的血纤维 蛋白凝块。
凝血因子XIII制品可从人或动物猪血液中提取，我国是畜牧大国，养猪业 规模较大，猪血资源十分丰富，由于生产工艺不够成熟，导致目前我国猪血的 利用率很低。从猪血中提取FXIII既可以充分利用猪血资源，又可以减少因排放 而造成的环境污染。FXIII的缺乏会导致迟发性出血、表面擦伤出血、皮下血肿、 组织损伤出血、口腔粘膜和牙龈出血常见，更为常见的是运动损伤或肌肉注射 引起肌肉血肿。此外，FXIII对治疗手术后伤口愈合紊乱、硬皮病、溃疡性结肠 炎、伪膜性结肠炎等很有效。FXIII也是组织粘合剂的重要成分之一。
凝血因子XIII是一种糖蛋白，一般的凝血因子XIII的提取包括六个基本步 骤，即血浆血球分离、病毒灭活、硫酸铵分级沉淀、DEAE-FF层析柱、进行分 装和冻干，最后经干热病毒灭活和钴-60辐照。但是上述工艺存在以下缺陷：
生产的过程中三次溶解的时间太长，这个过程中容易导致细菌等微生物繁 殖，从而增加产品中热原等毒素的含量；溶解时间过长也容易造成活性损失， 同时延长生产周期，增加成本；上述工艺制得的产品，纯度不高，活性较低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种得率高、纯度高且生产周期短的 凝血因子XIII的制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：凝血因子XIII的制备 方法，包括如下步骤：
步骤1、向血液中加入抗凝剂后离心分离，取上清抗凝血浆；
步骤2、向上清抗凝血浆中加入磷酸三丁酯和吐温-80作为病毒灭活剂，并 加入助剂，进行S/D病毒灭活，得灭活后的血浆；
步骤3、将步骤2所得灭活后的血浆离心，取清液；
步骤4、将步骤3所得清液预冷至0～4℃，加入0～4℃的饱和硫酸铵溶液后， 取沉淀；
步骤5、将步骤4所得沉淀用0～4℃的饱和硫酸铵溶液洗涤，将洗涤后的沉 淀破碎并加入0～4℃的一次溶解剂并搅拌，取清液，所述一次溶解剂为氯化钾溶 液；
步骤6、将步骤5所得清液预冷至0～4℃，加入0～4℃的乙酸体积分数为 94％～96％的乙酸溶液至溶液pH为5.2～6.5后，加入硫酸铵固体至溶液饱和度为 15％～20％，取沉淀；
步骤7、向步骤6所得沉淀中加入0～4℃的二次溶解剂并搅拌，取清液，所 述二次溶解剂为含有氯化钠的缓冲液，所述缓冲液中的缓冲对为Tris-HCl、磷酸 氢二钠-磷酸二氢钠和柠檬酸盐-磷酸盐中的任一种；
步骤8、将步骤7所得清液水浴加热至53～56℃，维持160～200秒后冷却至 0～4℃，取清液；
步骤9、向步骤8所得清液中加入硫酸铵固体至溶液饱和度为35％～40％， 取沉淀；
步骤10、向步骤9所得沉淀中加入0～4℃的三次溶解剂并搅拌，取清液， 所述三次溶解剂为含有氯化钾的Tris-HCl缓冲液；
步骤11、将步骤10所得清液梯度洗脱后冷冻干燥，即得凝血因子XIII冻 干制品。
本发明的有益效果在于：在溶解时加入不同的溶解剂，同时使得沉淀中的 凝血因子XIII溶解充分同时大大缩短溶解时间，减少细菌滋生；提取效率高， 每升血浆能提取10毫克以上的凝血因子XIII；制得的凝血因子XIII冻干制品中， 凝血因子XIII纯度在90％以上；操作简单，生产周期短，在2天时间内即可完 成凝血因子XIII的制备；制得的凝血因子XIII冻干制品的复溶时间短，稳定性 好，保存时间长。
附图说明
图1为本发明实施例1和实施例2的凝血因子XIII的制备方法的流程图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并 配合附图予以说明。
本发明最关键的构思在于：在病毒灭活时加入助剂，在0～4℃环境下进行凝 血因子XIII的分级沉降、溶解过程，加入不同的溶解剂对沉淀进行分级溶解， 提高溶解效率，缩短生产周期，减少细菌滋生，提高凝血因子XIII得率和纯度。
请参照图1，凝血因子XIII的制备方法，包括如下步骤：
步骤1、向血液中加入抗凝剂后离心分离，取上清抗凝血浆；
步骤2、向上清抗凝血浆中加入磷酸三丁酯和吐温-80作为病毒灭活剂，并 加入助剂，进行S/D病毒灭活，得灭活后的血浆；
步骤3、将步骤2所得灭活后的血浆离心，取清液；
步骤4、将步骤3所得清液预冷至0～4℃，加入0～4℃的饱和硫酸铵溶液后， 取沉淀；
步骤5、将步骤4所得沉淀用0～4℃的饱和硫酸铵溶液洗涤，将洗涤后的沉 淀破碎并加入0～4℃的一次溶解剂并搅拌，取清液，所述一次溶解剂为氯化钾溶 液；
步骤6、将步骤5所得清液预冷至0～4℃，加入0～4℃的乙酸体积分数为 94％～96％的乙酸溶液至溶液pH为5.2～6.5后，加入硫酸铵固体至溶液饱和度为 15％～20％，取沉淀；
步骤7、向步骤6所得沉淀中加入0～4℃的二次溶解剂并搅拌，取清液，所 述二次溶解剂为含有氯化钠的缓冲液，所述缓冲液中的缓冲对为Tris-HCl、磷酸 氢二钠-磷酸二氢钠和柠檬酸盐-磷酸盐中的任一种；
步骤8、将步骤7所得清液水浴加热至53～56℃，维持160～200秒后冷却至 0～4℃，取清液；
步骤9、向步骤8所得清液中加入硫酸铵固体至溶液饱和度为35％～40％， 取沉淀；
步骤10、向步骤9所得沉淀中加入0～4℃的三次溶解剂并搅拌，取清液， 所述三次溶解剂为含有氯化钾的Tris-HCl缓冲液；
步骤11、将步骤10所得清液梯度洗脱后冷冻干燥，即得凝血因子XIII冻 干制品。
所述助剂为氨基酸、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、山梨醇、葡萄酸钠、柠檬酸 三钠、EDTA中的一种或几种，助剂中的氨基酸为谷氨酸、赖氨酸、丙氨酸、组 氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、精氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸中的一种或几种，所述 助剂中的溶质的浓度均为0.01～1.0mol/L。
助剂能提高凝血因子XIII制品的质量，在病毒灭活和沉降过程中起到保护 凝血因子XIII的生物学活性的作用。
发明人在实际生产实践中发现，由于在S/D病毒灭活后，由于病毒体被灭 火剂破坏，产生了大量变性的蛋白，同时灭活剂对血浆中的各种蛋白也有一定 程度的破坏，导致蛋白质变性，产生各种不溶物，这些不溶物经发明人研究发 现，对产品质量，尤其是复溶速度与产品纯度具有不利影响，因此在灭活后加 入离心分离步骤。
夹杂在沉淀中的S/D灭活剂、杂蛋白等对产品的复溶速度与品质同样有不 利影响，因此采用冷硫酸铵溶液作为洗涤剂，以洗去一次沉淀里的残余的S/D 灭活剂和杂蛋白；采用0～4℃的饱和硫酸铵溶液作为洗涤剂是因为温度过高时， 洗涤剂会溶解凝血因子XIII。
其中，在上述梯度洗脱过程中，采用新型DEAESepharoseFF填料，分离效 果好。
其中，所述血液为无菌采集的猪血液或人血液。其中，所述一次溶解剂中 氯化钾的浓度为0.1～0.2mol/L。
其中，所述二次溶解剂中氯化钠的浓度为0.1～0.2mol/L，缓冲对的浓度为 0.01～0.05mol/L，所述二次溶解剂的pH值为7.0～7.5。
其中，所述三次溶解剂的pH值为8.0，三次溶解剂中氯化钾的浓度为 0.50mM，三次溶解剂中Tris-HCL的浓度为10mM。
其中，步骤11中进行冷冻干燥前向梯度洗脱后的溶液中加入冻干保护剂， 所述冻干保护剂的溶质选自多羟基碳水化合物、柠檬酸三钠、氯化钠、氨基酸 中的一种或几种。
优选的，所述冻干保护剂的溶质为多羟基碳水化合物、柠檬酸三钠、氯化 钠和氨基酸；所述冻干保护剂中，多羟基碳水化合物的浓度为0.1％～5％w/v，氯 化钠的浓度为0.1％～0.9％w/v，氨基酸的浓度为0.1％～5％w/v。本申请中w/v的 单位均为g/mL，如“多羟基碳水化合物的浓度为0.1％～5％w/v”表示，每100 毫升溶液中含有0.1～5克的多羟基碳水化合物，即多羟基碳水化合物的浓度为 1～50g/L。
其中，所述多羟基碳水化合物选自蔗糖、海藻糖、葡萄糖、甘露醇、山梨 醇中的一种或几种；冻干保护剂中的氨基酸选自谷氨酸、赖氨酸、丙氨酸、组 氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、精氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸中的一种或几种。
其中，在步骤11之后还依次包括：
步骤12、将步骤11中的凝血因子XIII冻干制品进行分装、真空度检测和 轧盖后，在98～100℃水浴保温30分钟的条件下对凝血因子XIII制品中的非脂 包膜病毒进行干热病毒灭活；
步骤13、将步骤12中干热灭活后的凝血因子XIII制品进行钴-60辐照，得 到医用凝血因子XIII无菌制品。
本发明实施例中所采用的原血浆均来自于同一天经无菌采集的血浆，加入 0.1mol/L的柠檬酸三钠无菌无热原抗凝剂10000ml，无菌血液采集总量约为 90000ml，按实施例1、2和3中的使用要求分三次实验进行。
实施例1
请参照图1，工艺所有操作均在无菌万级净化区中进行，其中分装和冻干操 作均在局部百级净化区进行，所进行的操作均符合洁净区操作要求。生产规格 为1.5ml。
(1)取无菌采集的猪血液10000ml；
(2)离心分离，取上清抗凝血浆4000ml；
(3)对步骤(2)所得的上清抗凝血浆加入0.3％w/v磷酸三丁酯和1％w/v 吐温-80作为病毒灭活剂，加入0.2mol/L的葡萄糖作为助剂，25℃下进行病毒灭 活6小时；
将灭活后的血浆离心分离，弃去沉淀物，取清液；
(4)一次沉降：将经步骤(3)所得清液预冷至0～4℃，加入1000ml饱和 硫酸铵溶液，所述饱和硫酸铵溶液的温度为0～4℃；
(5)分离并收集步骤(4)中一次沉降得到的凝血因子XIII一次沉淀物， 用0～4℃，硫酸铵溶液对步骤(4)中一次沉降得到的凝血因子XIII一次沉淀物 进行洗涤，弃去洗涤液；
(6)一次溶解：对步骤(5)中洗涤后的凝血因子XIII一次沉淀物剪碎并 加入一次溶解剂，4℃条件下并搅拌，将步骤(5)收集得到的凝血因子XIII一 次沉淀物溶解，去除不溶物，收集溶解清液500ml；
(7)收集步骤(6)中的不溶物，加入等体积的一次溶解剂，25℃水浴1h, 去除不溶物，收集溶解清液300ml；
(8)二次沉降：合并步骤(6)(7)得到的溶解清液800ml预冷至0～4℃后， 向上清液中加入冷乙酸，调pH，再加入固体硫酸铵，沉降溶解清液中的凝血因 子XIII，所述冷乙酸的温度为0～4℃；
(9)二次溶解：分离并收集步骤(8)中二次沉降得到的凝血因子XIII二 次沉淀物，加入二次溶解剂400ml，4℃条件下并搅拌，将凝血因子XIII二次沉 淀物溶解；
(10)将步骤(9)得到的二次溶解清液水浴加热至53～56℃，维持3分钟， 迅速放入冰浴中冷却至4℃，分离沉淀，收集上清液；
(11)三次沉降：向步骤(10)得到的上清液中，加入固体硫酸铵，沉降 上清液中的凝血因子XIII；
(12)三次溶解：分离并收集步骤(11)中三次沉降得到的凝血因子XIII 三次沉淀物，加入三次溶解剂，4℃条件下并搅拌，将凝血因子XIII三次沉淀物 溶解；
(13)将步骤(12)得到的三次溶解清液上DEAE柱，梯度洗脱，收集有 活性部分；
(14)向步骤(13)得到的有活性的洗脱液中加入冻干保护剂，冻干，得 到凝血因子XIII冻干制品。
采用Bradford法检测洗脱液中的蛋白浓度C1(见表1)；
(15)根据(14)中的检测结果，采用PEG浓缩至溶液中的蛋白浓度为5mg/ml, 加入保护剂，制剂中成分组成为：
凝血因子XIII5mg/ml
葡萄糖2.5mg/ml
甘氨酸2mg/ml
(16)分装，每支分装1.5ml，分装完成后进行冻干，冻干出柜后立即进行 轧盖，最后对冻干品进行钴-60辐照，即可得到凝血因子XIII制品B1(见表2)。
(17)将步骤(16)中的凝血因子XIII冻干制品进行分装、真空度检测和 轧盖后，在98～100℃水浴保温30分钟的条件下对凝血因子XIII制品中的非脂 包膜病毒进行干热病毒灭活；
(18)将步骤(17)干热灭活后的凝血因子XIII制品进行钴-60辐照，得到 医用凝血因子XIII无菌制品。
实施例2
请参照图1，工艺所有操作均在无菌万级净化区中进行，其中分装和冻干操 作均在局部百级净化区进行，所进行的操作均符合洁净区操作要求。生产规格 为1.5ml。
(1)取无菌采集的猪血液24000ml；
(2)离心分离，取上清抗凝血浆12000ml；
(3)对步骤(2)所得的上清抗凝血浆加入0.3％w/v磷酸三丁酯和1％w/v 吐温-80作为病毒灭活剂，加入0.2mol/L的葡萄糖作为助剂，25℃下进行病毒灭 活6小时；
将灭活后的血浆离心分离，弃去沉淀物，取清液；
(4)一次沉降：将经步骤(3)所得清液预冷至0～4℃，加入3000ml饱和 硫酸铵溶液，所述饱和硫酸铵溶液的温度为0～4℃；
(5)分离并收集步骤(4)中一次沉降得到的凝血因子XIII一次沉淀物， 用0～4℃，硫酸铵溶液对步骤(4)中一次沉降得到的凝血因子XIII一次沉淀物 进行洗涤，弃去洗涤液；
(6)一次溶解：对步骤(5)中洗涤后的凝血因子XIII一次沉淀物剪碎并 加入一次溶解剂，4℃条件下并搅拌，将步骤(5)收集得到的凝血因子XIII一 次沉淀物溶解，去除不溶物，收集溶解清液1500ml；
(7)收集步骤(6)中的不溶物，加入等体积的一次溶解剂，25℃水浴1h, 去除不溶物，收集溶解清液900ml；
(8)二次沉降：合并步骤(6)(7)得到的溶解清液2400ml预冷至0～4℃ 后，向上清液中加入冷乙酸，调pH，再加入固体硫酸铵，沉降溶解清液中的凝 血因子XIII，所述冷乙酸的温度为0～4℃；
(9)二次溶解：分离并收集步骤(8)中二次沉降得到的凝血因子XIII二 次沉淀物，加入二次溶解剂1200ml，4℃条件下并搅拌，将凝血因子XIII二次 沉淀物溶解；
(10)将步骤(9)得到的二次溶解清液水浴加热至53～56℃，维持3分钟， 迅速放入冰浴中冷却至4℃，分离沉淀，收集上清液；
(11)三次沉降：向步骤(10)得到的上清液中，加入固体硫酸铵，沉降 上清液中的凝血因子XIII；
(12)三次溶解：分离并收集步骤(11)中三次沉降得到的凝血因子XIII 三次沉淀物，加入三次溶解剂，4℃条件下并搅拌，将凝血因子XIII三次沉淀物 溶解；
(13)将步骤(12)得到的三次溶解清液上DEAE柱，梯度洗脱，收集有 活性部分；
(14)向步骤(13)得到的有活性的洗脱液中加入冻干保护剂，冻干，得 到凝血因子XIII冻干制品。
采用Bradford法检测洗脱液中的蛋白浓度C2(见表1)；
(15)根据(14)中的检测结果，采用PEG浓缩至溶液中的蛋白浓度为5mg/ml, 加入保护剂，制剂中成分组成为：
凝血因子XIII5mg/ml
葡萄糖2mg/ml
甘氨酸1mg/ml
(16)分装，每支分装1.5ml，分装完成后进行冻干，冻干出柜后立即进行 轧盖，最后对冻干品进行钴-60辐照，即可得到凝血因子XIII制品B2(见表2)。
(17)将步骤(16)中的凝血因子XIII冻干制品进行分装、真空度检测和 轧盖后，在98～100℃水浴保温30分钟的条件下对凝血因子XIII制品中的非脂 包膜病毒进行干热病毒灭活；
(18)将步骤(17)干热灭活后的凝血因子XIII制品进行钴-60辐照，得到 医用凝血因子XIII无菌制品。
实施例3工艺所有操作均在万级净化区中进行，其中分装和冻干操作均 在局部百级净化区进行，所进行的操作均符合洁净区操作要求。生产规格为 1.5ml。
(1)取无菌采集的猪血液50000ml；
(2)离心分离，取上清抗凝血浆20000ml；
(3)对步骤(2)所得的上清抗凝血浆加入0.3％w/v磷酸三丁酯和1％w/v 吐温-80作为病毒灭活剂，25℃下进行病毒灭活6小时；
将灭活后的血浆离心分离，弃去沉淀物，取清液；
(4)一次沉降：将经步骤(3)所得清液预冷至0～4℃，加入5000ml饱和 硫酸铵溶液，所述饱和硫酸铵溶液的温度为0～4℃；
(5)分离并收集步骤(4)中一次沉降得到的凝血因子XIII一次沉淀物， 用0～4℃，硫酸铵溶液对步骤(4)中一次沉降得到的凝血因子XIII一次沉淀物 进行洗涤，弃去洗涤液；
(6)一次溶解：对步骤(5)中洗涤后的凝血因子XIII一次沉淀物剪碎并 加入一次溶解剂，4℃条件下并搅拌，将步骤(5)收集得到的凝血因子XIII一 次沉淀物溶解，去除不溶物，收集溶解清液2400ml；
(7)收集步骤(6)中的不溶物，加入等体积的一次溶解剂，25℃水浴1h, 去除不溶物，收集溶解清液1400ml；
(8)二次沉降：合并步骤(6)(7)得到的溶解清液3800ml预冷至0～4℃ 后，向上清液中加入冷乙酸，调pH，再加入固体硫酸铵，沉降溶解清液中的凝 血因子XIII，所述冷乙酸的温度为0～4℃；
(9)二次溶解：分离并收集步骤(8)中二次沉降得到的凝血因子XIII二 次沉淀物，加入二次溶解剂2000ml，4℃条件下并搅拌，将凝血因子XIII二次 沉淀物溶解；
(10)将步骤(9)得到的二次溶解清液水浴加热至53～56℃，维持3分钟， 迅速放入冰浴中冷却至4℃，分离沉淀，收集上清液；
(11)三次沉降：向步骤(10)得到的上清液中，加入固体硫酸铵，沉降 上清液中的凝血因子XIII；
(12)三次溶解：分离并收集步骤(11)中三次沉降得到的凝血因子XIII 三次沉淀物，加入三次溶解剂，4℃条件下并搅拌，将凝血因子XIII三次沉淀物 溶解；
(13)将步骤(12)得到的三次溶解清液上DEAE柱，梯度洗脱，收集有 活性部分；
(14)向步骤(13)得到的有活性的洗脱液中加入冻干保护剂，冻干，得 到凝血因子XIII冻干制品。
采用Bradford法检测洗脱液中的蛋白浓度C3(表1)；
(15)根据(14)中的检测结果，采用PEG浓缩至溶液中的蛋白浓度为5mg/ml, 加入保护剂，制剂中成分组成为：
凝血因子XIII5mg/ml
葡萄糖2mg/ml
甘氨酸2mg/ml
(16)分装，每支分装1.5ml，分装完成后进行冻干，冻干出柜后立即进行 轧盖，最后对冻干品进行钴-60辐照，即可得到凝血因子XIII制品B3(表2)。
(17)将步骤(16)中的凝血因子XIII冻干制品进行分装、真空度检测和 轧盖后，在98～100℃水浴保温30分钟的条件下对凝血因子XIII制品中的非脂 包膜病毒进行干热病毒灭活；
(18)将步骤(17)热灭活后的凝血因子XIII制品进行钴-60辐照，得到医 用凝血因子XIII无菌制品。
实施例4分别取人凝血因子XIII缺乏纤维蛋白原或血浆、不同稀释度的 标准人血浆或供试品(1：2～1：256)、人凝血酶/CaCl2溶液(用0.05mol/LCaCl2复溶冻干人凝血酶至50IU/ml)各0.1ml混匀，即形成凝块。37℃：保温60分钟， 加lml1％一氯乙酸，在混合器上振摇，使底部凝块上浮，每10分钟振摇1次， 观察不溶凝块。30分钟后记录凝块还没溶解的标准血浆和供试品的最大稀释度。 按下式计算样品中人凝血因子XIII效价，应不低于1.0U/ml。人凝血因子XIII 效价(U/ml)＝供试品可观察到凝块或悬浮物最大稀释度/标准血浆可观察到凝块 或悬浮物最大稀释度。标准血浆FXIII活性按1U/ml计，即可得到待测样品的 FXⅢ活性值，其结果如表1所示。
实施例5按照《中华人民共和国药典》2015版四部通则“蛋白质测定法” 中第五法“考马斯亮蓝法”检测凝血因子XIII的蛋白浓度，其结果如表1所示。 参照《中华人民共和国药典》2015版三部第274～275页的有关“人纤维蛋白原” 标准，对制品中的“热原”、“磷酸三丁酯”以及“吐温-80”等检测项进行检测， 其结果如表2所示。
表1
表2
备注：医用凝血因子XIII冻干制品采用1ml蒸馏水作为复溶剂。
综上所述，本发明提供的凝血因子XIII的制备方法的有益效果在于：在溶 解时加入不同的溶解剂，同时使得沉淀中的凝血因子XIII溶解充分同时大大缩 短溶解时间，减少细菌滋生；提取效率高，每升血浆能提取10毫克以上的凝血 因子XIII；制得的凝血因子XIII冻干制品中，凝血因子XIII纯度在90％以上； 操作简单，生产周期短，在2天时间内即可完成凝血因子XIII的制备；制得的 凝血因子XIII冻干制品的复溶时间短，稳定性好，保存时间长。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利 用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术 领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。