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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610021319.1 (22)申请日 2016.01.13 C12N 9/42(2006.01) C12N 15/56(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 1/15(2006.01) C12N 1/19(2006.01) A23L 29/00(2016.01) A23K 20/189(2016.01) (71)申请人 云南师范大学 地址 650500 云南省昆明市呈贡雨花片区 1 号地 (72)发明人 许波 戴利铭 黄遵锡 李俊俊 唐湘华 杨云娟 (74)专利代。
2、理机构 北京众合诚成知识产权代理 有限公司 11246 代理人 裴娜 (54) 发明名称 高木糖耐受性双功能半纤维素降解酶、 其编 码基因及其制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种高木糖耐受性双功能半 纤维素降解酶及其制备方法和应用， 其氨基酸编 码序列如 SEQ ID NO.2 所示， 共 542 个氨基酸， 其理论分子量为 61.85kDa。本发明提供的高木 糖耐受性双功能半纤维素降解酶 (XylRBM26) 有 -D- 木糖苷酶活性和 -L- 阿拉伯呋喃糖苷酶 活性， 能够在高木糖环境下保持较高的活性 (Ki 值 500mM)， 其最适 pH 为 6.5， 最适温度为 50； 在 4。
3、5条件下耐受 60min， 仍能保持 95以上活性， 能将木二糖、 木三糖、 木四糖彻底水解成木糖。该 酶可做为一种新型的酶制剂， 可广泛用于食品、 饲 料、 能源工业等。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书9页 序列表5页 附图4页 CN 105543197 A 2016.05.04 CN 105543197 A 1.一种高木糖耐受性的双功能半纤维素降解酶， 其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。 2.一种编码权利要求1所述的双功能半纤维素降解酶的基因。 3.根据权利要求2所述的基因， 其特征在于， 其核苷酸序列如SEQ。
4、IDNO.1所示。 4.一种包含权利要求2所述的基因的重组表达载体。 5.一种利用权利要求4所述的重组表达载体转化宿主细胞所得的重组菌株。 6.根据权利要求5所述的重组菌株， 其特征在于， 所述宿主细胞为大肠杆菌、 酿酒酵母、 毕赤酵母、 枯草芽孢杆菌、 乳酸菌或丝状真菌。 7.包含权利要求1所述的双功能半纤维素降解酶的酶制剂。 8.包含权利要求1所述的双功能半纤维素降解酶的食品。 9.包含权利要求1所述的双功能半纤维素降解酶的饲料。 10.一种如权利要求1所述的双功能半纤维素降解酶的制备方法， 其特征在于， 包括以 下步骤： 将双功能半纤维素降解酶基因的重组表达载体转化宿主细胞得到重组菌株，。
5、 培养重组 菌株， 诱导重组双功能半纤维素降解酶的表达； 回收并纯化所表达的双功能半纤维素降解酶， 得到高木糖耐受性的双功能半纤维素降 解酶。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105543197 A 2 高木糖耐受性双功能半纤维素降解酶、 其编码基因及其制备 方法 技术领域 0001 本发明属于基因工程技术领域， 尤其涉及一种高木糖耐受性双功能半纤维素降解 酶、 其编码基因及其制备方法。 背景技术 0002 木聚糖为植物半纤维素的主要组分， 木糖是其完全降解的终产物， 完成整个水解 过程需要木聚糖酶系的协同作用。 木聚糖酶主要包括： 内切1， 4- -D-木聚糖酶(endo-l， 4- -D。
6、-xylanohydrolase， EC3.2.1.8)， 它主要是随机切割木聚糖的主链生成不同长度的木 寡糖； -木糖苷酶( -D-xylosidase， EC3.2.1.37)， 作用于低聚糖和木二糖使其最终降解 为木糖； 而a-D-葡萄糖醛酸苷酶(a-D-glucatronidase， EC3.2.1.139)、 乙酰木聚糖酯酶 ( acetylxylanesterase ， EC3 .1 .1 .72 )、 a-L-阿拉 伯呋喃糖苷酶( a-L- arabinofuranosidase， EC3 .2.1 .55)、 阿魏酸酯酶(ferulicacidesterase， EC 3.1.。
7、1.73)等酶在去除侧链取代基团发挥作用。 通过这些酶的协同作用， 木聚糖能够有效地 被水解(Collinsetal.FEMSMicrobiolRev， 2005， 29:3-23)。 0003 -木糖苷酶在整个协同水解过程中可以降低木聚糖的水解产物从而可以较大程 度的解除产物对木聚糖酶的抑制， 是木聚糖水解过程中的限速酶。 -L-阿拉伯呋喃糖苷酶 可以催化水解以 -1， 3、 -1， 2或 -1， 5键连在木糖主链上的阿拉伯糖单体或低聚体侧枝。 研 究表明， -L-阿拉伯呋喃糖苷酶与木聚糖酶和木糖苷酶等存在协同作用能促进木聚糖的降 解。 有些木聚糖主链在侧链没有降解前， 其糖苷键无法被木聚糖。
8、酶完全水解。 另一方面， 一 些只能降解侧链的辅助酶， 需要在木聚糖主链部分水解后才能发挥作用(Dumbrepatilet al.JMicrobiolBiotechnol， 2012， 12:1724-1730)。 0004 木糖是 -木糖苷酶的一种强抑制剂， -木糖苷酶将低聚木聚糖降解为木糖或协助 木聚糖酶将木聚糖降解为木糖的过程中， 随时间增加， 终产物木糖的产量也增加， 当积累到 一定量时， 会使酶促反应速率降低并抑制反应的继续进行。 一般不同来源的 -木糖苷酶的 木糖耐受性都是极低的， 尤其是真菌仅能耐受210mM的木糖(Zanoeloetal.JInd MicrobiolBiotec。
9、hnol， 2004， 31： 170-176)， 因此， 高木糖耐受性的 -木糖苷酶在半纤维素 降解过程中有巨大潜在应用价值。 0005 L-阿拉伯糖是一种没有热量的甜料， 能抑制水解双糖的酶， 抑制因摄入蔗糖而导 致的血糖升高， 因此可以抑制肥胖、 预防并治疗与高血糖相关的疾病； 此外， L-阿拉伯糖可 用于合成核苷类似物等抗病毒药物， 治疗白血病、 癌症的化疗药物等。 L-阿拉伯糖的工业提 取方法一般是采用碱提取植物中的半纤维素， 然后酸水解， 但该方法工艺成本高， 环境污染 严重。 因此， 高效、 节能、 环保的生物转化方法生产L-阿拉伯糖， 对我国的生物能源产业和功 能糖产业都有非常。
10、重大的意义。 0006 中国专利公开号102051350A， 公开了一种适冷木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶和编码该 酶的基因。 该酶不仅有阿拉伯糖苷酶和木糖苷酶的功能， 而且能够在低温的环境下保持较 说明书 1/9 页 3 CN 105543197 A 3 高的活性， 但该酶的木糖耐受性较小， 其环境适宜能力依旧难以满足现有工业需要。 发明内容 0007 本发明的目的在于提供一种高木糖耐受性双功能半纤维素降解酶、 其编码基因及 其制备方法， 本发明提供的双功能半纤维素降解酶同时具有 -D-木糖苷酶和 -L-阿拉伯糖 苷酶活性， 能将木二糖、 木三糖、 木四糖彻底水解成木糖， 而且具有较高的木糖耐受性。。
11、 0008 本发明的目的之一在于提供一种高木糖耐受性的双功能半纤维素降解酶， 其氨基 酸序列如SEQIDNO.2所示， 共542个氨基酸， 其理论分子量为61.85kDa。 0009 本发明的高木糖耐受性的双功能半纤维素降解酶XylRBM26最适pH为6.5； 在 pH5.0-10.0的缓冲液处理1h， 酶活力剩余80以上； 最适反应温度为50， 在45和50下 处理1h， 活性分别能保持95、 83以上； 该酶具有较高的木糖耐受性， 木糖浓度高达500mM 时仍有50的相对剩余酶活。 在pH6.5及50下该酶能有效地水解4-Nitrophenyl- -D- xylopyranoside、 4。
12、-Nitrophenyl- -L-arabinofuranoside， 而不能水解燕麦木聚糖、 山毛 榉木聚糖、 羧甲基纤维素钠、 昆布多糖、 -葡聚糖、 微晶纤维素、 4-Nitrophenyl- -D- glucopyranoside、 4-Nitrophenyl- -D-galactopyranoside， 说明该酶同时具有 -D-木糖 苷酶和 -L-阿拉伯糖苷酶活性， 将该酶与木二糖、 木三糖、 木四糖反应24h， 发现水解产物均 为木糖。 0010 本发明的目的之二在于提供一种编码上述技术方案所述的双功能半纤维素降解 酶的基因， 其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。 0011 本发。
13、明通过Miseq基因组测序仪测序Massiliasp.RBM26的基因组DNA， 经序列分 析、 功能注释发现双功能酶的编码基因XylRBM26。 通过PCR的方法分离克隆基因XylRBM26， 其全长为1629bp， 起始密码为ATG， 终止密码为TAG， GC含量为67.8。 经NCBI网站的BLASTP 比对， 该酶XylRBM26与GenBank中Massiliatimonae来源的假想蛋白(WP005666758)具有最 高的一致性， 为92， 该假想蛋白归类于糖苷水解酶第43家族， 但其蛋白活性并未研究； 与 确定活性的Bifidobacteriumanimalissubsp.la。
14、ctisBB-12来源的GH43beta- xylosidase(ADC85541)一致性为42.37。 而与确定活性的堆肥宏基因组uncultured bacterium来源GH43beta-xylosidase(LC025936)一致性仅为12.73。 以上比对结果说明 该酶XylRBM26是一种新的糖苷水解酶。 0012 本发明的目的之三在于提供一种包含上述技术方案所述的基因的重组表达载体， 将上述基因插入到表达载体中， 使其核苷酸序列与表达调控序列相连接。 作为本发明的一 个最优选的实施方案， 将本发明的编码基因和表达载体pEasy-E2通过T-A方式相连接， 得到 重组大肠杆菌表达质。
15、粒pEasy-E2-XylRBM26。 0013 本发明的目的之四在于提供一种利用上述技术方案所述的重组表达载体转化宿 主细胞所得的重组菌株， 所述宿主细胞为大肠杆菌、 酿酒酵母、 毕赤酵母、 枯草芽孢杆菌、 乳 酸菌或丝状真菌。 获得的重组菌株优选为大肠杆菌、 酵母菌、 芽孢杆菌或乳酸杆菌， 优选为 重组菌株BL21(DE3)/XylRBM26。 0014 本发明的目的之五在于提供一种上述技术方案所述的双功能半纤维素降解酶的 制备方法， 包括以下步骤： 0015 将双功能半纤维素降解酶基因的重组表达载体转化宿主细胞得到重组菌株， 培养 说明书 2/9 页 4 CN 105543197 A 4。
16、 重组菌株， 诱导重组双功能半纤维素降解酶的表达； 0016 回收并纯化所表达的双功能半纤维素降解酶， 得到高木糖耐受性的双功能半纤维 素降解酶。 0017 其中， 所述双功能半纤维素降解基因按照以下方法获得： 0018 提取Massiliasp.RBM26基因组DNA， 其中Massiliasp.RBM26是本研究室2013年 从我国云南省维西县白马雪山国家级自然保护区的滇金丝猴粪便微生物中分离得到， 其 16srRNA基因序列比对结果与MassiliaaureashainAP13(NR_042502)的相似性为99； 0019 以Massiliasp.RBM26基因组DNA为模板， 以SE。
17、QIDNO.3所示的引物XylRBM26F和 SEQIDNO.4所示的引物XylRBM26R进行PCR扩增， 得到双功能半纤维素降解基因。 0020 其中， XylRBM26F的序列为ATGATCCACAACCCGATCCTGC； XylRBM26R的序列为 CAGCCGGCTGAGGTAGGGCC。 XylRBM26F和XylRBM26R均为扩增成熟肽的引物。 0021 具体而言， 所述双功能半纤维素降解酶按照以下方法获得： 0022 首先提取Massiliasp.RBM26基因组DNA： 将液体培养2d的菌液离心取菌体， 加入 1mL溶菌酶， 37处理1h， 再加入裂解液， 裂解液组成为：。
18、 50mMTris， 20mMEDTA， NaCl 500mM， 2SDS(w/v)， pH8.0， 70水浴裂解1h， 每隔10min混匀一次， 在4下10000rpm离心 5min。 取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白， 再取上清加入等体积异丙醇， 于室温静置5min 后， 4下10000rpm离心10min。 弃上清， 沉淀用70的乙醇洗涤两次， 真空干燥， 加入适量TE 溶解， 置于-20备用。 0023 用超声打断仪Biorupter将5 g的Massiliasp.RBM26的基因组打断为400600bp 的片段， 用GenomicDNAClean&Concentration试剂盒对打。
19、断的DNA片段进行纯化， 纯化后 用TureseqTMDNASamplePreparationKit进行DNA片段的末端补平、 3 端加A碱基和加接 头、 及DNA片段的PCR扩增(操作按试剂盒说明书进行)， 得到双功能半纤维素降解基因 XylRBM26， 该基因序列如SEQIDNO.1所示。 0024 根据双功能半纤维素降解基因XylRBM26序列分析结果设计扩增成熟肽的引物： XylRBM26F： ATGATCCACAACCCGATCCTGC； XylRBM26R： CAGCCGGCTGAGGTAGGGCC。 0025 以菌株Massiliasp.RBM26的基因组为模板， 上述引物通过P。
20、CR扩增目的基因。 PCR 反应参数为94预变性5min； 94变性30S， 72退火30S， 72延伸1min30S， 共20个循环； 94变性30S， 52退火30S， 72延伸1min30S， 共10个循环； 72扩增后延伸7min； 其中从 72到52每个循环温度下降1。 0026 将双功能半纤维素降解基因XylRBM26和表达载体pEasy-E2连接获得重组表达质 粒pEasy-E2-XylRBM26， 然后将pEasy-E2-XylRBM26转化大肠杆菌BL21(DE3)， 获得重组菌株 BL21(DE3)/XylRBM26。 0027 取含有重组质粒pEasy-E2-XylRBM。
21、26的重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/XylRBM26， 以0.1的接种量接种于LB(含100 gmL-1Amp)培养液中， 37快速振荡16h。 然后将此活化 的菌液以1接种量接种到新鲜的LB(含100 gmL-1Amp)培养液中， 快速振荡培养约2-3h (OD600达到0.6-1.0)后， 加入终浓度0.5mM的IPTG进行诱导， 于20继续振荡培养约20h。 12， 000rpm离心5min， 收集菌体。 用适量的pH7.0McIlvaine缓冲液悬浮菌体后， 于低温水浴 下超声波破碎菌体， 破碎后经13， 000rpm离心10min， 吸取上清进行SDS-PAGE分析。 SDS-。
22、PAGE 结果表明， 重组双功能半纤维素降解酶XylRBM26在大肠杆菌中得到了表达， 经Nickel-NTA 说明书 3/9 页 5 CN 105543197 A 5 Agarose纯化后为单一条带。 0028 得到双功能半纤维素降解酶XylRBM26后， 对其进行性质测定， 结果表明， 其最适pH 为6.5； 在pH5.0-10.0的缓冲液处理1h， 酶活力剩余80以上； 其最适温度为50； 在45、 50条件下耐受60min， 活性分别能保持95、 83以上， 在55条件下耐受3min， 酶活剩余 67； 在50及pH6.5条件下， 其对pNPX的Km、 Vmax和kcat分别为2.27。
23、mmol/L、 1.6 molmin- 1mg-1和2.34S-1， 对pNPA的Km、 Vmax和kcat分别为4.64mmol/L、 1.98 molmin-1mg-1和2.04S-1。 在50及pH6.5条件下， 即使在1mM的浓度下， Ag+、 SDS、 Hg2+也完全抑制该酶活性； 在10mM的 浓度下， Cu2+、 Zn2+、 Ni2+、 Fe2+对该酶的抑制较强， 而其余金属离子及化学试剂及对该酶活性 无影响或影响微弱； 在pH6.5及50下， 当木糖浓度为700mM时仍有39.2以上的相对剩余 酶活， 该酶的抑制常数为500mM； 在pH6.5及50下， 该酶对2mM合成底物4。
24、-Nitrophenyl- - D-xylopyranoside、 4-Nitrophenyl- -L-arabinofuranoside的酶活分别2.830.23、 1.28 0.03Uml-1， 而对燕麦木聚糖、 山毛榉木聚糖、 羧甲基纤维素钠、 昆布多糖、 -葡聚糖、 微晶 纤维素、 4-Nitrophenyl- -D-glucopyranoside、 4-Nitrophenyl- -D-galactopyranoside 均无酶活； 在处理24h后， 该酶水解木二糖、 木三糖、 木四糖的产物均为木糖。 0029 基于上述性质， 本发明提供的双功能半纤维素降解酶在酿酒工业中， 可有效降解。
25、 可溶性和不可溶性的阿拉伯木聚糖， 有效降低麦芽汁的粘度提高过滤效率澄清啤酒； 另外， 在白酒、 清酒的酿造中有助于增加酿酒过程中萜烯醇的浓度， 增加香味； 在饲料工业中可与 木聚糖酶协同作用， 有效降低因粘度增加而引起的抗营养作用。 因此， 所述双功能半纤维素 降解酶作为一种新型的酶制剂， 在食品、 饲料工业中的具有巨大的潜力。 0030 本发明的目的还在于提供一种包含上述技术方案所述的双功能半纤维素降解酶 的酶制剂。 0031 本发明的目的还在于提供一种包含上述技术方案所述的双功能半纤维素降解酶 的食品。 0032 本发明的目的还在于提供一种包含上述技术方案所述的双功能半纤维素降解酶 的饲。
26、料。 附图说明 0033 图1为在大肠杆菌中表达的重组酶XylRBM26的SDS-PAGE分析， 其中， M： 蛋白质 Marker； 1： 未纯化的重组酶XylRBM26粗酶液； 2： 500mM咪唑洗脱亲和于Nickel-NTAAgarose 中的重组酶XylRBM26； 0034 图2为纯化的重组双功能半纤维素降解酶XylRBM26的pH活性； 0035 图3为纯化的重组双功能半纤维素降解酶XylRBM26的pH稳定性； 0036 图4为纯化的重组双功能半纤维素降解酶XylRBM26的热活性； 0037 图5为纯化的重组双功能半纤维素降解酶XylRBM26的热稳定性； 0038 图6为纯。
27、化的重组双功能半纤维素降解酶XylRBM26的木糖耐受性； 0039 图7为纯化的重组双功能半纤维素降解酶XylRBM26分别与木二糖、 木三糖、 木四糖 反应24h的产物分析， 其中， M： 木四糖、 木三糖、 木二糖、 木糖； 1： 木二糖和失活的酶XylRBM26 (100下处理5min)， 2： 木二糖和酶XylRBM26在45反应24h， 3： 木三糖和失活的酶 XylRBM26， 4： 木三糖和酶XylRBM26在45反应24h， 5： 木四糖和失活的酶XylRBM26， 6： 木四 说明书 4/9 页 6 CN 105543197 A 6 糖和酶XylRBM26在45反应24h。。
28、 具体实施方式 0040 下面将结合本发明实施例中的附表， 对本发明实施例中的技术方案进行清楚、 完 整地描述， 显然， 所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例， 而不是全部的实施例。 基于 本发明中的实施例， 本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例， 都属于本发明保护的范围。 0041 试验材料和试剂 0042 1、 菌株及载体： Massiliasp.RBM26是本研究室2013年从我国云南省维西县白马 雪山国家级自然保护区的滇金丝猴粪便微生物中分离得到， 其16srRNA基因序列比对结果 与MassiliaaureashainAP13(NR_042502)的。
29、相似性为99。 大肠杆菌Escherichiacoli BL21(DE3)和表达载体pEasy-E2购于北京全式金生物技术有限公司。 0043 2、 酶类及其他生化试剂： DNA聚合酶和dNTP购自TaKaRa公司； 山毛榉木聚糖 (Beechwoodxylan)、 4-Nitrophenyl- -D-xylopyranoside(pNPX)、 4-Nitrophenyl- -L- arabinofuranoside(pNPA)、 4-Nitrophenyl- -D-glucopyranoside、 4-Nitrophenyl- -D- galactopyranoside购自Sigma公司； 。
30、燕麦木聚糖(Xylanfromoatspelts)购自SERVA公 司； GenomicDNAClean&Concentration试剂盒购自ZymoResearch公司， TureseqTMDNA SamplePreparationKit、 HiseqSequencingKit购自Illumima公司， 其它都为国产试剂 (均可从普通生化试剂公司购买得到)。 0044 3、 培养基： 0045 LB培养基： Peptone10g， Yeastextract5g， NaCl10g， 加蒸馏水至1000ml， pH自 然(约为7)。 固体培养基在此基础上加2.0(w/v)琼脂。 0046 说明：。
31、 以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法， 均参照 分子克隆实验 指南 (第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行， 或者按照试剂盒和产品说明书 进行。 0047 实施例1： 基因XylRBM26的克隆 0048 提取Massiliasp.RBM26基因组DNA： 将液体培养2d的菌液离心取菌体， 加入1mL溶 菌酶， 37处理1h， 再加入裂解液， 裂解液组成为： 50mMTris， 20mMEDTA， NaCl500mM， 2 SDS(w/v)， pH8.0， 70水浴裂解1h， 每隔10min混匀一次， 在4下10000rpm离心5min。 取上 清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白。
32、， 再取上清加入等体积异丙醇， 于室温静置5min后， 4下 10000rpm离心10min。 弃上清， 沉淀用70的乙醇洗涤两次， 真空干燥， 加入适量TE溶解， 置 于-20备用。 0049 用超声打断仪Biorupter将5 g的Massiliasp.RBM26的基因组打断为400-600bp 的片段， 用GenomicDNAClean&Concentration试剂盒对打断的DNA片段进行纯化， 纯化后 用TureseqTMDNASamplePreparationKit进行DNA片段的末端补平、 3 端加A碱基和加接 头、 及DNA片段的PCR扩增(操作按试剂盒说明书进行)。 用MiS。
33、eq基因组测序仪(Illumima公 司)对上述制备好的文库进行基因组测序。 0050 基因组测序得到的数据经读码框预测和本地BLAST比对， 得到木糖苷酶/阿拉伯糖 苷酶基因XylRBM26， 该基因序列如SEQIDNO.1所示。 说明书 5/9 页 7 CN 105543197 A 7 0051 实施例2： 重组双功能半纤维素降解酶XylRBM26的制备 0052 根据双功能半纤维素降解酶基因XylRBM26序列分析结果设计扩增成熟肽的引物： 0053 XylRBM26F： ATGATCCACAACCCGATCCTGC 0054 XylRBM26R： CAGCCGGCTGAGGTAGGGC。
34、C 0055 以菌株Massiliasp.RBM26的基因组为模板， 上述引物通过PCR扩增目的基因。 PCR 反应参数为94预变性5min； 94变性30S， 72退火30S， 72延伸1min30S， 共20个循环； 94变性30S， 52退火30S， 72延伸1min30S， 共10个循环； 72扩增后延伸7min； 其中从 72到52每个循环温度下降1。 0056 将双功能半纤维素降解酶基因XylRBM26和表达载体pEasy-E2连接获得重组表达 质粒pEasy-E2-XylRBM26， 然后将pEasy-E2-XylRBM26转化大肠杆菌BL21(DE3)， 获得重组菌 株BL21。
35、(DE3)/XylRBM26， 送华大基因测序中心测序以进行验证。 0057 取含有重组质粒pEasy-E2-XylRBM26的重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/XylRBM26， 以0.1的接种量接种于LB(含100 gmL-1Amp)培养液中， 37快速振荡16h。 然后将此活化 的菌液以1接种量接种到新鲜的LB(含100 gmL-1Amp)培养液中， 快速振荡培养约2-3h (OD600达到0.61.0)后， 加入终浓度0.5mM的IPTG进行诱导， 于20继续振荡培养约20h。 12000rpm离心5min， 收集菌体。 用适量的pH7.0McIlvaine缓冲液悬浮菌体后， 于低温。
36、水浴下 超声波破碎菌体， 破碎后经13000rpm离心10min， 吸取上清进行SDS-PAGE分析。 结果见图1， 图1为在大肠杆菌中表达的重组双功能半纤维素降解酶XylRBM26的SDS-PAGE分析， 其中， M： 蛋白质Marker； 1： 未纯化的重组双功能半纤维素降解酶XylRBM26粗酶液； 2： 500mM咪唑洗脱 亲和于Nickel-NTAAgarose中的重组双功能半纤维素降解酶XylRBM26。 由图1可知， 在大约 67KDa的位置， 含有重组载体的pEasy-E2-XylRBM26大肠杆菌菌体破碎上清液有明显条带， 经500mM的咪唑洗脱后， 产物为单一条带。 005。
37、8 实施例3纯化的重组双功能半纤维素降解酶XylRBM26的性质测定 0059 1、 纯化的重组双功能半纤维素降解酶XylRBM26的活性分析 0060 重组双功能半纤维素降解酶XylRBM26的活性测定方法采用pNPX法： 将pNPX溶于 0.1M缓冲液中， 使其终浓度为2mM。 450 L的2mM底物； 反应温度下预热5min后， 加入50 L适量 稀释的酶液， 反应10min后， 加2mL1MNa2CO3终止反应， 冷却至室温后在405nm波长下测定释 放出的pNP； 1个酶活单位(U)定义为每分钟分解pNPX产生1 molpNP所需的酶量(pNP底物的 酶活性测定方法同pNPX)。 对。
38、底物燕麦木聚糖、 山毛榉木聚糖、 羧甲基纤维素钠、 昆布多糖、 -葡聚糖、 微晶纤维素的活性测定采用3， 5二硝基水杨酸(DNS)法： 将底物溶于0.1M缓冲 液中， 使其终浓度为0.5(w/v)； 反应体系含100 L酶液， 900 L底物； 底物在反应温度下预 热5min后， 加入酶液后再反应10min， 然后加1.5mLDNS终止反应， 沸水煮5min， 冷却至室温 后在540nm波长下测定OD值。 1个酶活单位(U)定义为在一定的条件下每分钟分解底物产生1 mol还原糖(以木糖计)所需的酶量。 0061 2、 纯化的重组双功能半纤维素降解酶XylRBM26的pH活性和pH稳定性测定： 。
39、0062 酶的最适pH测定： 将重组双功能半纤维素降解酶XylRBM26在37下和0 .1M pH3.0-12.0的缓冲液中进行酶促反应。 酶的pH稳定性测定： 将酶液置于0.1MpH3.0-12.0的 缓冲液中， 在37下处理1h， 然后在pH6.5及37下进行酶促反应， 以未处理的酶液作为对 照。 缓冲液为： 0.1MMcIlvaine(pH3.0-8.0)， 0.1MTris/HCl(pH8.0-9.0)和0.1Mglycine/ 说明书 6/9 页 8 CN 105543197 A 8 NaOH(pH9.0-12.0)。 以pNPX为底物， 反应10min， 测定纯化的XylRBM26。
40、的酶学性质， 结果参见 图2和图3， 图2为纯化的重组双功能半纤维素降解酶XylRBM26的pH活性； 图3为纯化的重组 双功能半纤维素降解酶XylRBM26的pH稳定性。 由图2和图3可知， 本发明提供的双功能半纤 维素降解酶XylRBM26的最适pH为6.5； 在pH5.0-10.0的缓冲液处理1h， 酶活力剩余80以 上。 0063 3、 纯化的重组双功能半纤维素降解酶XylRBM26的热活性及热稳定性测定： 0064 酶的最适温度测定： 在pH6.5的缓冲液中， 于0-60下进行酶促反应。 酶的热稳定 性测定： 将同样酶量的酶液置于45、 50、 55和60中， 处理0-1h后， 在p。
41、H6.5及50进 行酶促反应， 以未处理的酶液作为对照。 以pNPX为底物， 反应10min， 测定纯化的重组双功能 半纤维素降解酶XylRBM26的酶性质， 结果参见图4和图5， 图4为纯化的重组双功能半纤维素 降解酶XylRBM26的热活性； 图5为纯化的重组双功能半纤维素降解酶XylRBM26的热稳定性。 结果表明： 重组双功能半纤维素降解酶XylRBM26的最适温度为50； 在45、 50条件下耐 受60min， 活性分别能保持95、 83以上， 在55条件下耐受3min， 酶活剩余67。 0065 4、 纯化的重组双功能半纤维素降解酶XylRBM26的动力学参数测定： 0066 酶的。
42、动力学参数一级反应时间测定： 在pH6.5及50下， 以0.5mM的pNPX和pNPA为 底物， 依次在酶促反应的1-30min内终止反应并测定酶活性， 计算出酶活性与反应时间的比 值， 若在一定时间内该比值保持稳定， 则此时间为一级反应时间。 用0.14.0mM的pNPX和 pNPA为底物， 在pH6.5、 50和一级反应时间下， 根据Lineweaver-Burk方法测定Km、 Vmax和 kcat。 经测定， 在50及pH6.5条件下， 重组双功能半纤维素降解酶XylRBM26对pNPX的Km、 Vmax和kcat分别为2.27mmol/L、 1.6 molmin-1mg-1和2.34S。
43、-1， 对pNPA的Km、 Vmax和kcat分别 为4.64mmol/L、 1.98 molmin-1mg-1和2.04S-1。 0067 5、 不同金属离子及化学试剂对纯化的重组双功能半纤维素降解酶XylRBM26活力 的影响： 0068 在酶促反应体系中分别加入18种不同的金属离子及化学试剂(终浓度为1mM和 10mM)， 研究其对酶活性的影响。 在50及pH6.5条件下， 以pNPX为底物测定酶活性(同样条 件下以未加金属离子及化学试剂的酶促反应作为对照)， 结果参见表1， 表1为18种不同金属 离子及化学试剂在两种浓度下对重组双功能半纤维素降解酶XylRBM26的影响， 结果表明， 。
44、即使在1mM的浓度下， Ag+、 SDS、 Hg2+也完全抑制XylRBM26的酶活性。 在10mM的浓度下， Cu2+、 Zn2+、 Ni2+、 Fe2+对该酶的抑制较强， 而其余金属离子及化学试剂及对该酶活性无影响或影响 微弱。 0069 表118种不同金属离子及化学试剂在两种浓度下对重组酶重组双功能半纤维素 降解酶XylRBM26的影响 说明书 7/9 页 9 CN 105543197 A 9 0070 0071 0072 6、 纯化的重组双功能半纤维素降解酶XylRBM26的木糖耐受性： 说明书 8/9 页 10 CN 105543197 A 10 0073 在酶促反应体系中加入不同浓。
45、度的木糖， 使其终浓度范围为0700mM的木糖， pH6.5及50下进行酶促反应， 结果参见图6， 图6为纯化的重组双功能半纤维素降解酶 XylRBM26的木糖耐受性。 由图6可知， 当木糖浓度为700mM时仍有39.2以上的相对剩余酶 活。 通过计算得出该酶的抑制常数为500mM。 0074 7、 纯化的重组双功能半纤维素降解酶XylRBM26对底物的降解： 0075 在pH6 .5及50下， 重组双功能半纤维素降解酶XylRBM26对2mM合成底物4- Nitrophenyl- -D-xylopyranoside、 4-Nitrophenyl- -L-arabinofuranoside的酶。
46、活分别 2.830.23、 1.280.03Uml-1， 而对燕麦木聚糖、 山毛榉木聚糖、 羧甲基纤维素钠、 昆布多 糖、 -葡聚糖、 微晶纤维素、 4-Nitrophenyl- -D-glucopyranoside、 4-Nitrophenyl- -D- galactopyranoside均无酶活。 0076 8、 纯化的重组双功能半纤维素降解酶XylRBM26水解木寡糖的产物分析： 0077 产物分析反应体系分别含900 L0.5(w/v)的木二糖、 木三糖、 木四糖， 100 L原 酶液。 在pH6.5及45下， 在酶促反应24h时终止反应并分析水解产物。 产物分析采用薄层层 析法(使用。
47、青岛海洋化工有限公司的高效薄层层析硅胶板G型)， 层析步骤如下所示： 0078 (1)配制展开剂(冰醋酸2mL， 双蒸水2mL， 正丁醇4mL， 混匀)， 取适量倒入展开槽， 静 置30min左右； 0079 (2)将硅胶板放在110烘箱中活化30min， 冷却后划线， 点样(每次0.5 L， 吹干， 共 点5次)； 0080 (3)将点样的一端硅胶板朝下放入展开槽中， 点样处不要没入展开剂； 0081 (4)待展开剂到距硅胶板上沿2cm时， 取出硅胶板， 吹干， 再展开一次； 0082 (5)第二次展开结束后， 硅胶板直接浸入适量显色剂(1g二苯胺溶于50mL丙酮中， 溶解后加入1mL苯胺及。
48、5mL85的磷酸， 混匀， 现用现配)； 0083 (6)30秒钟后， 立即取出硅胶板并放置于90烘箱中15min， 使斑点显色。 结果参见 图7， 图7为纯化的重组双功能半纤维素降解酶XylRBM26分别与木二糖、 木三糖、 木四糖反应 24h的产物分析， 其中， M： 木四糖、 木三糖、 木二糖、 木单糖； 1： 木二糖和失活的酶XylRBM26 (100下处理5min)， 2： 木二糖和酶XylRBM26在45反应24h， 3： 木三糖和失活的酶 XylRBM26， 4： 木三糖和酶XylRBM26在45反应24h， 5： 木四糖和失活的酶XylRBM26， 6： 木四 糖和酶XylRB。
49、M26在45反应24h。 图7表明： 在处理24h后， XylRBM26水解木二糖、 木三糖、 木 四糖的产物均为木糖。 0084 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。 说明书 9/9 页 11 CN 105543197 A 11 0001 序列表 1/5 页 12 CN 105543197 A 12 0002 序列表 2/5 页 13 CN 105543197 A 13 0003 序列表 3/5 页 14 CN 105543197 A 14 0004 序列表 4/5 页 15 CN 105543197 A 15 0005 序列表 5/5 页 16 CN 105543197 A 16 图1 说明书附图 1/4 页 17 CN 105543197 A 17 图2 图3 图4 说明书附图 2/4 页 18 CN 105543197 A 18 图5 图6 说明书附图 3/4 页 19 CN 105543197 A 19 图7 说明书附图 4/4 页 20 CN 10554。