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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610107494.2 (22)申请日 2016.02.26 C12P 21/06(2006.01) (71)申请人 天津现代职业技术学院 地址 300350 天津市津南区海河教育园区雅 观路 3 号 (72)发明人 刘皓 侯婷 王立晖 揣玉多 李达 刘鹏 杨庆伟 吕春晖 李晓阳 魏玮 傅维 范兆军 (74)专利代理机构 天津滨海科纬知识产权代理 有限公司 12211 代理人 张会雪 (54) 发明名称 酶解豆粕制备 ACE 抑制肽的方法 (57) 摘要 本发明提供了一种酶解豆粕制备 ACE 抑制 肽的方法， 包括如下步骤 ： (1。
2、) 将高温豆粕进行粉 碎、 过筛， 所得豆粕粉与水以质量比为 1 ： (4-6) 的 配比进行混合， 调节 pH 值为 8-10， 得到豆粕混合 物 ； (2) 调节豆粕混合物的 pH 值为 7-9， 加入复合 酶制剂， 混合均匀， 在 35-50温度下， 水解时间 5-8 小时， 水解完成后将水解液沸水浴煮沸灭酶， 得到混合液 ； (3) 调节混合液的 pH 值为 6.5-7.5， 取上清液， 通过超滤膜进行超滤处理， 得到滤过 液 ； (4) 将滤过液真空冷冻干燥， 得到 ACE 抑制肽 粉末。本发明所述的酶解豆粕制备 ACE 抑制肽的 方法工艺简单易行， 整个过程反应条件温和， 使用 复。
3、配好的复合酶制剂， 便于工业化加工操作。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 CN 105524966 A 2016.04.27 CN 105524966 A 1.一种酶解豆粕制备ACE抑制肽的方法， 其特征在于： 包括如下步骤： (1)豆粕预处理 将高温豆粕进行粉碎、 过筛， 所得豆粕粉与水以质量比为1： (4-6)的配比进行混合， 搅 拌均匀， 调节pH值为8-10， 进行超声， 得到豆粕混合物； (2)酶解 调节豆粕混合物的pH值为7-9， 加入豆粕混合物质量的3-5的复合酶制剂， 混合均 匀， 在35-50温度。
4、下， 水解时间5-8小时， 然后将水解液沸水浴煮沸灭酶， 冷却至室温， 得到 混合液； 其中， 复合酶制剂包括由碱性蛋白酶、 胰蛋白酶、 枯草杆菌蛋白酶、 中性蛋白酶、 木 瓜蛋白酶、 菠萝蛋白酶的原料制成； 其中， 碱性蛋白酶、 胰蛋白酶、 枯草杆菌蛋白酶、 中性蛋 白酶、 木瓜蛋白酶、 菠萝蛋白酶的质量比为(5-7)： (3-5)： (1-3)： (2-4)： (2-4)： (1-3)； (3)分离 调节混合液的pH值为6.5-7.5， 进行离心， 取上清液， 将上清液进行超滤处理， 得到滤过 液； (4)将滤过液真空冷冻干燥， 得到ACE抑制肽粉末。 2.根据权利要求1所述的酶解豆粕制备。
5、ACE抑制肽的方法， 其特征在于： 所述的步骤(1) 中过筛步骤的筛子选择60目筛。 3.根据权利要求1所述的酶解豆粕制备ACE抑制肽的方法， 其特征在于： 所述的步骤(1) 中超声步骤的条件为： 功率150-400W， 温度40-50， 时间10-20min。 4.根据权利要求1所述的酶解豆粕制备ACE抑制肽的方法， 其特征在于： 所述的步骤(1) 中粉碎步骤使用粉碎机。 5.根据权利要求1所述的酶解豆粕制备ACE抑制肽的方法， 其特征在于： 所述的步骤(2) 中沸水浴步骤的时间为10-20min。 6.根据权利要求1所述的酶解豆粕制备ACE抑制肽的方法， 其特征在于： 所述的步骤(3) 中。
6、离心步骤使用高速冷冻离心机。 7.根据权利要求6所述的酶解豆粕制备ACE抑制肽的方法， 其特征在于： 所述的步骤(3) 中离心步骤的条件为： 转速4000-4500r/min， 时间10-20min。 8.根据权利要求1所述的酶解豆粕制备ACE抑制肽的方法， 其特征在于： 所述的步骤(3) 中超滤步骤将上清液分别通过lOKDa、 6KDa、 3KDa的超滤膜进行超滤处理。 9.根据权利要求1-8中任一项所述的酶解豆粕制备ACE抑制肽的方法， 其特征在于： 所 述的步骤(3)中碱性蛋白酶的酶活为11000U/g， 胰蛋白酶的酶活为10000U/g， 枯草杆菌蛋白 酶的酶活为100000U/g， 。
7、中性蛋白酶为50000U/g， 木瓜蛋白酶的酶活为2000000U/g， 菠萝蛋 白酶的酶活为1000000U/g。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105524966 A 2 酶解豆粕制备ACE抑制肽的方法 技术领域 0001 本发明属于食品技术领域， 尤其是涉及一种酶解豆粕制备ACE抑制肽的方法。 背景技术 0002 ACE抑制肽， 即血管紧张素转化酶抑制肽(ACEIP,AngiotensinConverting EnzymeInhibitoryPeptides)， 是一些具有抑制血管紧张素转化酶(ACE)活性的多肽物 质， 这些多肽的氨基酸序列和肽链长度各有不同， 但都具有类似的功能，。
8、 即有降血压的功 能， 所以又称为降血压肽。 1981年第一个合成口服有效的肽类ACE抑制剂巯甲丙脯酸 (captopril)问世， 迄今已有许多化学合成的ACE抑制剂应用于临床。 然而这类药物作用时 间不长， 停药后会使血压反弹； 经肾脏排出易损害肾功能， 有一定的副作用。 国内外研究表 明， 食源性蛋白质酶解产物中的一些短肽具有广泛的生理调节功能， 特别是具有降血压活 性的ACE抑制肽受到广泛的关注， 这些降血压肽只对高血压患者起降压作用， 对血压正常者 无降压作用， 这些肽又是利用酶解技术从蛋白质中提取得到的， 安全性很高。 0003 高温豆粕是由大豆浸油后,经高温脱溶所得。 豆粕中约含。
9、45-50的蛋白质,以 及10-15的低聚糖、 20-25的多糖和纤维素,有很高的开发和利用价值。 我国是世界 产粮和产油大国,每年粮油加工中产生大量豆粕副产品， 豆粕资源丰富。 目前高温豆粕主要 用作饲料,在食品上的应用极少,只限于酿造食品。 酶水解豆粕是利用现代生物技术将大豆 蛋白通过蛋白酶酶解为可溶性蛋白和小分子多肽的混合物。 来源于大豆蛋白的ACE抑制肽 的降压效果虽然不及化学合成的降血压药,但其无毒副作用,安全性高,且对血压正常者无 降压作用,特别适用于作为口服药剂或功能性食品基料， 添加制成各种保健食品， 用来预 防、 缓解和辅助治疗高血压。 0004 目前， ACE抑制肽没有投入。
10、大规模的生产应用， 其主要原因是： 缺乏价廉有效、 便于 生产的酶制剂， 不能有效实现酶解产物分子量的控制， 严重影响后期纯化效果； 无法有效解 决酶解产物苦味问题， 限制其在食品领域的应用。 0005 为了提高豆粕资源的利用率,提高大豆肽的水解度,降低ACE抑制肽的生产成本， 生产稳定性好、 适用性广的ACE抑制肽粉末状产品， 本发明以大豆粕为原料， 选取价格低廉、 作用效果明显、 条件容易控制的酶制剂， 优化酶解条件， 探索有效地提纯方法， 提高ACE抑制 肽提取效率， 以期解决目前酶解法工业化制备ACE抑制肽急需解决的问题， 开拓ACE抑制肽 的工业化生产之路。 本发明一方面增加了豆粕的。
11、附加值， 创造良好的经济效益和市场价值； 另一方面,将豆粕ACE抑制肽的降压功能得到最大化利用， 具有良好的应用价值和社会效 益。 发明内容 0006 有鉴于此， 本发明旨在提出一种酶解豆粕制备ACE抑制肽的方法， 提升了现有豆粕 资源的利用价值,加工制备出食源性具有ACE抑制活性的豆粕蛋白肽。 0007 为达到上述目的， 本发明的技术方案是这样实现的： 说明书 1/6 页 3 CN 105524966 A 3 0008 一种酶解豆粕制备ACE抑制肽的方法， 包括如下步骤： 0009 (1)豆粕预处理 0010 将高温豆粕进行粉碎、 过筛， 所得豆粕粉与水以质量比为1： (4-6)的配比进行混。
12、 合， 搅拌均匀， 调节pH值为8-10， 进行超声， 得到豆粕混合物； 0011 (2)酶解 0012 调节豆粕混合物的pH值为7-9， 加入豆粕混合物质量的3-5的复合酶制剂， 混 合均匀， 在35-50温度下， 水解时间5-8小时， 然后将水解液沸水浴煮沸灭酶， 冷却至室温， 得到混合液； 其中， 复合酶制剂包括由碱性蛋白酶、 胰蛋白酶、 枯草杆菌蛋白酶、 中性蛋白 酶、 木瓜蛋白酶、 菠萝蛋白酶的原料制成； 其中， 碱性蛋白酶、 胰蛋白酶、 枯草杆菌蛋白酶、 中 性蛋白酶、 木瓜蛋白酶、 菠萝蛋白酶的质量比为(5-7)： (3-5)： (1-3)： (2-4)： (2-4)： (1-3。
13、)； 0013 (3)分离 0014 调节混合液的pH值为6.5-7.5， 进行离心， 取上清液， 将上清液进行超滤处理， 得到 滤过液； 0015 (4)将滤过液真空冷冻干燥， 得到ACE抑制肽粉末。 0016 进一步， ： 所述的步骤(1)中过筛步骤的筛子选择60目筛。 0017 进一步， 所述的步骤(1)中超声步骤的条件为： 功率150-400W， 温度40-50， 时间 10-20min。 0018 进一步， 所述的步骤(1)中粉碎步骤使用粉碎机。 0019 进一步， 所述的步骤(2)中沸水浴步骤的时间为10-20min。 0020 进一步， 所述的步骤(3)中离心步骤使用高速冷冻离心。
14、机。 0021 进一步， 所述的步骤(3)中离心步骤的条件为： 转速4000-4500r/min， 时间10- 20min。 0022 进一步， 所述的步骤(3)中超滤步骤将上清液分别通过lOKDa、 6KDa、 3KDa的超滤膜 进行超滤处理。 0023 进一步， 所述的步骤(3)中碱性蛋白酶的酶活为11000U/g， 胰蛋白酶的酶活为 10000U/g， 枯草杆菌蛋白酶的酶活为100000U/g， 中性蛋白酶为50000U/g， 木瓜蛋白酶的酶 活为2000000U/g， 菠萝蛋白酶的酶活为1000000U/g。 0024 相对于现有技术， 本发明所述的酶解豆粕制备ACE抑制肽的方法具有以。
15、下优势： 0025 本发明所述的酶解豆粕制备ACE抑制肽的方法采用的原料新， 资源丰富， 可以充分 开发高温豆粕的利用价值； 本发明的工艺简单易行， 整个过程反应条件温和， 使用复配好的 复合酶制剂， 便于工业化加工操作， 可制备成胶囊类制品， 方便保存和食用； 本发明的应用 范围广泛， 制备的食源性ACE抑制肽产品， ACE抑制率可达到3544， 食用安全性高， 可 作为药品、 功能性食品、 食品、 食品添加剂等进一步加工利用。 具体实施方式 0026 除非另外说明， 本文中所用的术语均具有本领域技术人员常规理解的含义， 为了 便于理解本发明， 将本文中使用的一些术语进行了下述定义。 002。
16、7 所有的数字标识， 例如pH、 温度、 时间、 浓度， 包括范围， 都是近似值。 要了解， 虽然 不总是明确的叙述所有的数字标识之前都加上术语 “约” 。 同时也要了解， 虽然不总是明确 说明书 2/6 页 4 CN 105524966 A 4 的叙述， 本文中描述的试剂仅仅是示例， 其等价物是本领域已知的。 0028 本发明中涉及到的ACE抑制率测定方法如下： 0029 取40 L待测液于试管中， 与含5mM马尿酰-组氨酰-亮氨酰(HHL)作底物的0.1M硼酸 缓冲液(含0.3MNaCl， pH值为8.3)相混合， 再与20 L酶液(0.1U/mL)混合。 将混合液在37反 应60min，。
17、 加入150 LlN盐酸终止反应。 再加入1.0mL乙酸乙酯， 振荡20秒， 3000r/min离心 10min， 分离上层0.8mL乙酸乙酯层。 将该层在120加热40min以挥去溶剂， 加3mL蒸馏水， 振 荡约20s。 提取出的马尿酸在228nm处测其吸收值。 0030 ACE抑制率以下列公式计算： 0031 ACE抑制率(A-B)/(A-C)100 0032 A： 228nm空白对照品吸收值 0033 B： 228nm待测样品吸收值 0034 C： 228nm既无酶又无样品吸收值 0035 下面结合实施例来详细说明本发明。 0036 实施例1 0037 一种酶解豆粕制备ACE抑制肽的方。
18、法， 包括如下步骤： 0038 (1)豆粕预处理 0039 将高温豆粕使用粉碎机进行粉碎、 过60目筛， 所得豆粕粉与水以1： 5的质量比混 合， 搅拌均匀， 调节pH值为9， 进行超声， 超声功率300W， 温度40， 时间15min得到豆粕混合 物； 0040 (2)酶解 0041 调节豆粕混合物的pH值为7.2， 加入豆粕混合物质量的4的复合酶制剂， 混合均 匀， 在40温度下， 水解时间6小时， 然后将水解液沸水浴煮沸灭酶10min， 冷却至室温， 得到 混合液； 其中， 复合酶制剂包括由碱性蛋白酶、 胰蛋白酶、 枯草杆菌蛋白酶、 中性蛋白酶、 木 瓜蛋白酶、 菠萝蛋白酶的原料制成； 。
19、碱性蛋白酶、 胰蛋白酶、 枯草杆菌蛋白酶、 中性蛋白酶、 木瓜蛋白酶、 菠萝蛋白酶的质量比为6： 4： 1： 3： 2： 1； 碱性蛋白酶的酶活为11000U/g， 胰蛋白 酶的酶活为10000U/g， 枯草杆菌蛋白酶的酶活为100000U/g， 中性蛋白酶为50000U/g， 木瓜 蛋白酶的酶活为2000000U/g， 菠萝蛋白酶的酶活为1000000U/g； 0042 (3)分离 0043 调节混合液的pH值为7， 使用高速冷冻离心机进行离心， 离心转速4000r/min， 时间 10min， 取上清液， 将上清液先后通过lOKDa、 6KDa、 3KDa的超滤膜进行超滤处理， 得到滤过 。
20、液； 0044 (4)将滤过液真空冷冻干燥， 得到ACE抑制肽粉末。 0045 将所述的ACE抑制肽粉末进行ACE抑制率的测定， 测定得到ACE抑制肽粉末的抑制 率为39。 0046 实施例2 0047 一种酶解豆粕制备ACE抑制肽的方法， 包括如下步骤： 0048 (1)豆粕预处理 0049 将高温豆粕使用粉碎机进行粉碎、 过60目筛， 所得豆粕粉与水以1： 4的质量比混 合， 搅拌均匀， 调节pH值为8， 进行超声， 超声功率400W， 温度40， 时间10min得到豆粕混合 说明书 3/6 页 5 CN 105524966 A 5 物； 0050 (2)酶解 0051 调节豆粕混合物的p。
21、H值为8， 加入豆粕混合物质量的5的复合酶制剂， 混合均匀， 在50温度下， 水解时间5小时， 然后将水解液沸水浴煮沸灭酶10min， 冷却至室温， 得到混 合液； 其中， 复合酶制剂包括由碱性蛋白酶、 胰蛋白酶、 枯草杆菌蛋白酶、 中性蛋白酶、 木瓜 蛋白酶、 菠萝蛋白酶的原料制成； 碱性蛋白酶、 胰蛋白酶、 枯草杆菌蛋白酶、 中性蛋白酶、 木 瓜蛋白酶、 菠萝蛋白酶的质量比为5： 5： 2： 3： 2： 3； 碱性蛋白酶的酶活为11000U/g， 胰蛋白酶 的酶活为10000U/g， 枯草杆菌蛋白酶的酶活为100000U/g， 中性蛋白酶为50000U/g， 木瓜蛋 白酶的酶活为20000。
22、00U/g， 菠萝蛋白酶的酶活为1000000U/g； 0052 (3)分离 0053 调节混合液的pH值为7.2， 使用高速冷冻离心机进行离心， 离心转速4200r/min， 时 间10min， 取上清液， 将上清液先后通过lOKDa、 6KDa、 3KDa的超滤膜进行超滤处理， 得到滤过 液； 0054 (4)将滤过液真空冷冻干燥， 得到ACE抑制肽粉末。 0055 将所述的ACE抑制肽粉末进行ACE抑制率的测定， 测定得到ACE抑制肽粉末的抑制 率为44。 0056 实施例3 0057 一种酶解豆粕制备ACE抑制肽的方法， 包括如下步骤： 0058 (1)豆粕预处理 0059 将高温豆粕。
23、使用粉碎机进行粉碎、 过60目筛， 所得豆粕粉与水以1： 6的质量比混 合， 搅拌均匀， 调节pH值为10， 进行超声， 超声功率150W， 温度50， 时间20min得到豆粕混合 物； 0060 (2)酶解 0061 调节豆粕混合物的pH值为9， 加入豆粕混合物质量的3的复合酶制剂， 混合均匀， 在35温度下， 水解时间8小时， 然后将水解液沸水浴煮沸灭酶10min， 冷却至室温， 得到混 合液； 其中， 复合酶制剂包括由碱性蛋白酶、 胰蛋白酶、 枯草杆菌蛋白酶、 中性蛋白酶、 木瓜 蛋白酶、 菠萝蛋白酶的原料制成； 碱性蛋白酶、 胰蛋白酶、 枯草杆菌蛋白酶、 中性蛋白酶、 木 瓜蛋白酶、 。
24、菠萝蛋白酶的质量比为7： 5： 3： 2： 4： 3； 碱性蛋白酶的酶活为11000U/g， 胰蛋白酶 的酶活为10000U/g， 枯草杆菌蛋白酶的酶活为100000U/g， 中性蛋白酶为50000U/g， 木瓜蛋 白酶的酶活为2000000U/g， 菠萝蛋白酶的酶活为1000000U/g； 0062 (3)分离 0063 调节混合液的pH值为7.5， 使用高速冷冻离心机进行离心， 离心转速4500r/min， 时 间10min， 取上清液， 将上清液先后通过lOKDa、 6KDa、 3KDa的超滤膜进行超滤处理， 得到滤过 液； 0064 (4)将滤过液真空冷冻干燥， 得到ACE抑制肽粉末。。
25、 0065 将所述的ACE抑制肽粉末进行ACE抑制率的测定， 测定得到ACE抑制肽粉末的抑制 率为35。 0066 实施例4 0067 一种酶解豆粕制备ACE抑制肽的方法， 包括如下步骤： 说明书 4/6 页 6 CN 105524966 A 6 0068 (1)豆粕预处理 0069 将高温豆粕使用粉碎机进行粉碎、 过60目筛， 所得豆粕粉与水以1： 5的质量比混 合， 搅拌均匀， 调节pH值为8， 进行超声， 超声功率200W， 温度45， 时间20min得到豆粕混合 物； 0070 (2)酶解 0071 调节豆粕混合物的pH值为8， 加入豆粕混合物质量的5的复合酶制剂， 混合均匀， 在40。
26、温度下， 水解时间7小时， 然后将水解液沸水浴煮沸灭酶10min， 冷却至室温， 得到混 合液； 其中， 复合酶制剂包括由碱性蛋白酶、 胰蛋白酶、 枯草杆菌蛋白酶、 中性蛋白酶、 木瓜 蛋白酶、 菠萝蛋白酶的原料制成； 碱性蛋白酶、 胰蛋白酶、 枯草杆菌蛋白酶、 中性蛋白酶、 木 瓜蛋白酶、 菠萝蛋白酶的质量比为6： 3： 2： 4： 3： 2； 碱性蛋白酶的酶活为11000U/g， 胰蛋白酶 的酶活为10000U/g， 枯草杆菌蛋白酶的酶活为100000U/g， 中性蛋白酶为50000U/g， 木瓜蛋 白酶的酶活为2000000U/g， 菠萝蛋白酶的酶活为1000000U/g； 0072 (。
27、3)分离 0073 调节混合液的pH值为7， 使用高速冷冻离心机进行离心， 离心转速4200r/min， 时间 10min， 取上清液， 将上清液先后通过lOKDa、 6KDa、 3KDa的超滤膜进行超滤处理， 得到滤过 液； 0074 (4)将滤过液真空冷冻干燥， 得到ACE抑制肽粉末。 0075 将所述的ACE抑制肽粉末进行ACE抑制率的测定， 测定得到ACE抑制肽粉末的抑制 率为41。 0076 实施例5 0077 一种酶解豆粕制备ACE抑制肽的方法， 包括如下步骤： 0078 (1)豆粕预处理 0079 将高温豆粕使用粉碎机进行粉碎、 过60目筛， 所得豆粕粉与水以1： 5的质量比混 。
28、合， 搅拌均匀， 调节pH值为9， 进行超声， 超声功率300W， 温度40， 时间15min得到豆粕混合 物； 0080 (2)酶解 0081 调节豆粕混合物的pH值为7.2， 加入豆粕混合物质量的4的复合酶制剂， 混合均 匀， 在40温度下， 水解时间6小时， 然后将水解液沸水浴煮沸灭酶10min， 冷却至室温， 得到 混合液； 其中， 复合酶制剂包括由碱性蛋白酶、 胰蛋白酶、 枯草杆菌蛋白酶、 中性蛋白酶、 木 瓜蛋白酶、 菠萝蛋白酶的原料制成； 碱性蛋白酶、 胰蛋白酶、 枯草杆菌蛋白酶、 中性蛋白酶、 木瓜蛋白酶、 菠萝蛋白酶的质量比为6： 4： 1： 3： 2： 1； 碱性蛋白酶的酶。
29、活为11000U/g， 胰蛋白 酶的酶活为10000U/g， 枯草杆菌蛋白酶的酶活为100000U/g， 中性蛋白酶为50000U/g， 木瓜 蛋白酶的酶活为2000000U/g， 菠萝蛋白酶的酶活为1000000U/g； 0082 (3)分离 0083 调节混合液的pH值为7， 使用高速冷冻离心机进行离心， 离心转速4000r/min， 时间 10min， 取上清液， 将上清液先后通过lOKDa、 6KDa、 3KDa的超滤膜进行超滤处理， 得到滤过 液； 0084 (4)将滤过液真空冷冻干燥， 得到ACE抑制肽粉末； 0085 (5)所述的ACE抑制肽粉末制成胶囊。 说明书 5/6 页 7 CN 105524966 A 7 0086 将所述的ACE抑制肽粉末进行ACE抑制率的测定， 测定得到ACE抑制肽粉末的抑制 率为39。 0087 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精 神和原则之内， 所作的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说明书 6/6 页 8 CN 105524966 A 8 。