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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610075915.8 (22)申请日 2016.02.03 C12P 33/00(2006.01) (71)申请人 常州可赛成功塑胶材料有限公司 地址 213164 江苏省常州市新北区昆仑路 (72)发明人 高玉梅 王志慧 (54) 发明名称 一种固定化脂肪酶催化合成绿原酸植物甾醇 酯的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种固定化脂肪酶催化合成绿 原酸植物甾醇酯的方法， 属于植物甾醇酯领域。 本 发明先从玉米中通过酶解、 超临界CO2萃取等工艺 得植物甾醇， 再从菊花中提取出绿原酸， 以固定化 脂肪酶为催化剂， 将植物甾醇和绿原酸。
2、进行酯化 反应， 得植物甾醇酯， 最后纯化即可， 本发明采用 生物酶法催化条件温和、 反应选择性高， 而且克服 了游离植物甾醇在水和油脂中溶解性差和活性低 的问题。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 CN 105524968 A 2016.04.27 CN 105524968 A 1.一种固定化脂肪酶催化合成绿原酸植物甾醇酯的方法， 其特征在于具体制备步骤 为： （1） 选取200300g干燥后的玉米， 将其研磨， 过100120目筛得玉米粉末， 将玉米粉末 加入5L反应釜中， 并向反应釜中加入总质量58%复合酶， 。
3、再按固液比1:101:15加入质量 浓度15%盐酸溶液， 混合搅拌均匀， 将反应釜升温至4560， 进行酶解35h， 将酶解液过 滤取滤渣， 所述的复合酶是按质量比3:2的纤维素酶和蛋白质酶进行混合； （2） 将上述得到的滤渣用榨汁机榨出多余水分， 将榨完后的滤渣用超临界CO2在室温下 进行萃取， 萃取压力为520MPa， 二氧化碳流量为160180kg/h， 萃取12h后， 从流体相中 分离得到甾醇固体， 留取， 备用； （3） 取5060g菊花花瓣， 先粉碎过6080目筛， 再将粉末置于300500mL质量分数85% 乙醇溶液中， 搅拌后移入超声提取装置中， 在6065和80120W下进行。
4、提取23h， 得提 取液， 将提取液在40005000r/min转速下离心分离， 取上清液， 将上清液移入圆底烧瓶中， 用旋转蒸发仪在5055下蒸发浓缩至乙醇完全去除， 将浓缩液转移到分液漏斗中， 按体 积比1： 2加入石油醚进行脱色23次， 分层得水相， 再用乙酸乙酯萃取35次， 取下层液体， 即为绿原酸； （4） 取23g步骤 （2） 的甾醇于250mL锥形瓶中， 按固液1:21:6向瓶中加入上述绿原 酸， 搅拌混合后再加入总质量410%固定化脂肪酶为催化剂、 0.10.3g二十六烷为内标和 4050mL甲醇为溶剂， 将锥形瓶放入恒温振荡器中， 在4065和80120r/min下进行酯 化。
5、反应35h； （5） 将上述酯化反应后的混合物按体积比1:51:8溶于正己烷中， 用硅胶柱层析分离， 分离后收集洗脱液， 并在6570进行旋转蒸发， 得到绿原酸甾醇酯浓缩液， 将浓缩液在45 55下干燥68h得到绿原酸甾醇酯粉末状固体。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105524968 A 2 一种固定化脂肪酶催化合成绿原酸植物甾醇酯的方法 技术领域 0001 本发明公开了一种固定化脂肪酶催化合成绿原酸植物甾醇酯的方法， 属于植物甾 醇酯领域。 背景技术 0002 植物甾醇是一种十分重要的具有生理活性的化合物， 广泛地应用于医药、 化妆品 和食品等行业。 植物甾醇和植物甾醇酯的生理功能包括。
6、： 可以降低血液中的胆固醇浓度、 可 以预防前列腺疾病、 可以作为抗癌物质、 有类激素作用、 具有促进动物生长、 退热和抗炎作 用、 皮肤美容和保健等其他作用。 植物甾醇的油溶性差， 为了能够在食品加工中应用， 需要 改变植物甾醇的形式并且不影响植物甾醇的生理功能。 植物甾醇脂肪酸酯大大改善了植物 甾醇的脂溶性。 0003 植物甾醇酯的合成一般有两种： 化学法和生物酶法： 化学法不仅能耗高， 而且在高 温下易造成脂肪酸的分解， 陈茂彬等采取化学方法合成植物甾醇油酸酯和植物甾醇硬脂酸 酯， 反应温度高， 不饱和脂肪酸容易氧化产生副产物； 此外， 王明霞等采取微波加热催化合 成 -亚麻酸植物甾醇酯。
7、， 操作简单， 反应时间短， 无溶剂污染， 但是产物颜色较深， 副产物较 多。 生物酶法催化条件温和、 反应选择性高、 产品比较环保， 因此广泛应用于食品、 化工、 医 药等行业。 目前， 国内已有利用共轭亚油酸、 亚麻酸和月桂酸与植物甾醇催化合成植物甾醇 酯的报道， 对棕榈酸植物甾醇酯的合成尚未见报道。 发明内容 0004 本发明主要解决的技术问题： 针对目前化学方法合成植物甾醇酯不仅能耗高， 而 且在高温下易造成脂肪酸的分解， 不饱和脂肪酸容易氧化产生副产物， 而且植物甾醇的水 不溶性和低油溶性的问题， 提供了一种固定化脂肪酶催化合成绿原酸植物甾醇酯的方法， 本发明先从玉米中通过酶解、 超。
8、临界CO2萃取得植物甾醇， 再从菊花中提取出绿原酸， 以固 定化脂肪酶为催化剂， 将植物甾醇和绿原酸进行酯化反应， 得植物甾醇酯， 最后纯化即可， 本发明采用生物酶法催化条件温和、 反应选择性高， 而且克服了游离植物甾醇在水和油脂 中溶解性差和活性低的问题。 0005 为了解决上述技术问题， 本发明所采用的技术方案是： （1） 选取200300g干燥后的玉米， 将其研磨， 过100120目筛得玉米粉末， 将玉米粉末 加入5L反应釜中， 并向反应釜中加入总质量58%复合酶， 再按固液比1:101:15加入质量 浓度15%盐酸溶液， 混合搅拌均匀， 将反应釜升温至4560， 进行酶解35h， 将酶。
9、解液过 滤取滤渣， 所述的复合酶是按质量比3:2的纤维素酶和蛋白质酶进行混合； （2） 将上述得到的滤渣用榨汁机榨出多余水分， 将榨完后的渣用超临界CO2在室温下进 行萃取， 萃取压力为520MPa， 二氧化碳流量为160180kg/h， 萃取12h后， 从流体相中分 离得到甾醇固体， 甾取， 备用； （3） 取5060g菊花花瓣， 先粉碎过6080目筛， 再将粉末置于300500mL质量分数85% 说明书 1/4 页 3 CN 105524968 A 3 乙醇溶液中， 搅拌后移入超声提取装置中， 在6065和80120W下进行提取23h， 得提 取液， 将提取液在40005000r/min转。
10、速下离心分离， 取上清液， 将上清液移入圆底烧瓶中， 用旋转蒸发仪在5055下蒸发浓缩至乙醇完全去除， 将浓缩液转移到分液漏斗中， 按体 积比1： 2加入石油醚进行脱色23次， 分层得水相， 再用乙酸乙酯萃取35次， 取下层液体， 即为绿原酸； （4） 取23g步骤 （2） 的甾醇于250mL锥形瓶中， 按固液1:21:6向瓶中加入上述绿原 酸， 搅拌混合后再加入总质量410%固定化脂肪酶为催化剂、 0.10.3g二十六烷为内标和 4050mL甲醇为溶剂， 将锥形瓶放入恒温振荡器中， 在4065和80120r/min下进行酯 化反应35h； （5） 将上述酯化反应后的混合物按体积比1:51:8。
11、溶于正己烷中， 用硅胶柱层析分离， 分离后收集洗脱液， 并在6570进行旋转蒸发， 得到绿原酸甾醇酯浓缩液， 将浓缩液在45 55下干燥68h得到绿原酸甾醇酯粉末状固体。 0006 本发明制备的方法： 本发明制得的绿原酸植物甾醇酯可以添加到保健品， 起到降 低血胆固醇、 消炎、 退热和抗氧化作用， 添加到食品中， 可以提高抗氧化能力， 延长食品食用 期时间。 0007 本发明的有益效果是： （1） 本发明采用生物酶法催化条件温和、 反应选择性高， 得到的产品具有广泛的应用； （2） 本发明克服了游离植物甾醇在水和油脂中溶解性差和活性低的问题， 而且原料来 源丰富， 成本低廉。 具体实施方式 0。
12、008 首先选取200300g干燥后的玉米， 将其研磨， 过100120目筛得玉米粉末， 将玉 米粉末加入5L反应釜中， 并向反应釜中加入总质量58%复合酶， 再按固液比1:101:15加 入质量浓度15%盐酸溶液， 混合搅拌均匀， 将反应釜升温至4560， 进行酶解35h， 将酶 解液过滤取滤渣， 所述的复合酶是按质量比3:2的纤维素酶和蛋白质酶进行混合； 将得到的 滤渣用榨汁机榨出多余水分， 将榨完后的渣用超临界CO2在室温下进行萃取， 萃取压力为5 20MPa， 二氧化碳流量为160180kg/h， 萃取12h后， 从流体相中分离得到甾醇固体， 甾 取， 备用； 取5060g菊花花瓣， 。
13、先粉碎过6080目筛， 再将粉末置于300500mL质量分数 85%乙醇溶液中， 搅拌后移入超声提取装置中， 在6065和80120W下进行提取23h， 得 提取液， 将提取液在40005000r/min转速下离心分离， 取上清液， 将上清液移入圆底烧瓶 中， 用旋转蒸发仪在5055下蒸发浓缩至乙醇完全去除， 将浓缩液转移到分液漏斗中， 按 体积比1： 2加入石油醚进行脱色23次， 分层得水相， 再用乙酸乙酯萃取35次， 取下层液 体， 即为绿原酸； 取23g甾醇于250mL锥形瓶中， 按固液1:21:6向瓶中加入上述绿原酸， 搅拌混合后再加入总质量410%固定化脂肪酶为催化剂、 0.10.3。
14、g二十六烷为内标和40 50mL甲醇为溶剂， 将锥形瓶放入恒温振荡器中， 在4065和80120r/min下进行酯化 反应35h； 将酯化反应后的混合物按体积比1:51:8溶于正己烷中， 用硅胶柱层析分离， 分离后收集洗脱液， 并在6570进行旋转蒸发， 得到绿原酸甾醇酯浓缩液， 将浓缩液在45 55下干燥68h得到绿原酸甾醇酯粉末状固体。 0009 实例1 说明书 2/4 页 4 CN 105524968 A 4 首先选取200g干燥后的玉米， 将其研磨， 过100目筛得玉米粉末， 将玉米粉末加入5L反 应釜中， 并向反应釜中加入总质量5%复合酶， 再按固液比1:10加入质量浓度15%盐酸溶。
15、液， 混合搅拌均匀， 将反应釜升温至45， 进行酶解3h， 将酶解液过滤取滤渣， 所述的复合酶是 按质量比3:2的纤维素酶和蛋白质酶进行混合； 将得到的滤渣用榨汁机榨出多余水分， 将榨 完后的渣用超临界CO2在室温下进行萃取， 萃取压力为5MPa， 二氧化碳流量为160kg/h， 萃取 1h后， 从流体相中分离得到甾醇固体， 甾取， 备用； 取50g菊花花瓣， 先粉碎过60目筛， 再将粉 末置于300mL质量分数85%乙醇溶液中， 搅拌后移入超声提取装置中， 在60和80W下进行提 取2h， 得提取液， 将提取液在4000r/min转速下离心分离， 取上清液， 将上清液移入圆底烧瓶 中， 用旋。
16、转蒸发仪在50下蒸发浓缩至乙醇完全去除， 将浓缩液转移到分液漏斗中， 按体积 比1： 2加入石油醚进行脱色2次， 分层得水相， 再用乙酸乙酯萃取3次， 取下层液体， 即为绿原 酸； 取2g甾醇于250mL锥形瓶中， 按固液1:2向瓶中加入上述绿原酸， 搅拌混合后再加入总质 量4%固定化脂肪酶为催化剂、 0.1g二十六烷为内标和40mL甲醇为溶剂， 将锥形瓶放入恒温 振荡器中， 在40和80r/min下进行酯化反应3h； 将酯化反应后的混合物按体积比1:51:8 溶于正己烷中， 用硅胶柱层析分离， 分离后收集洗脱液， 并在65进行旋转蒸发， 得到绿原 酸甾醇酯浓缩液， 将浓缩液在45下干燥6h得。
17、到绿原酸甾醇酯粉末状固体。 0010 实例2 首先选取250g干燥后的玉米， 将其研磨、 过110目筛得玉米粉末， 将玉米粉末加入5L反 应釜中， 并向反应釜中加入总质量7%复合酶， 再按固液比1:13加入质量浓度15%盐酸溶液， 混合搅拌均匀， 将反应釜升温至55， 进行酶解4h， 将酶解液过滤取滤渣， 所述的复合酶是 按质量比3:2的纤维素酶和蛋白质酶进行混合； 将得到的滤渣用榨汁机榨出多余水分， 将榨 完后的渣用超临界CO2在室温下进行萃取， 萃取压力为15MPa， 二氧化碳流量为170kg/h， 萃 取1.5h后， 从流体相中分离得到甾醇固体， 甾取， 备用； 取55g菊花花瓣， 先粉。
18、碎过70目筛， 再 将粉末置于400mL质量分数85%乙醇溶液中， 搅拌后移入超声提取装置中， 在63和100W下 进行提取2.5h， 得提取液， 将提取液在4500r/min转速下离心分离， 取上清液， 将上清液移入 圆底烧瓶中， 用旋转蒸发仪在53下蒸发浓缩至乙醇完全去除， 将浓缩液转移到分液漏斗 中， 按体积比1： 2加入石油醚进行脱色2次， 分层得水相， 再用乙酸乙酯萃取4次， 取下层液 体， 即为绿原酸； 取2.5g甾醇于250mL锥形瓶中， 按固液1:4向瓶中加入上述绿原酸， 搅拌混 合后再加入总质量6%固定化脂肪酶为催化剂、 0.2g二十六烷为内标和45mL甲醇为溶剂， 将 锥形。
19、瓶放入恒温振荡器中， 在55和100r/min下进行酯化反应4h； 将酯化反应后的混合物 按体积比1:6溶于正己烷中， 用硅胶柱层析分离， 分离后收集洗脱液， 并在67进行旋转蒸 发， 得到绿原酸甾醇酯浓缩液， 将浓缩液在50下干燥7h得到绿原酸甾醇酯粉末状固体。 0011 实例3 首先选取300g干燥后的玉米， 将其研磨、 过120目筛得玉米粉末， 将玉米粉末加入5L反 应釜中， 并向反应釜中加入总质量8%复合酶， 再按固液比1:15加入质量浓度15%盐酸溶液， 混合搅拌均匀， 将反应釜升温至60， 进行酶解5h， 将酶解液过滤取滤渣， 所述的复合酶是 按质量比3:2的纤维素酶和蛋白质酶进行。
20、混合； 将得到的滤渣用榨汁机榨出多余水分， 将榨 完后的渣用超临界CO2在室温下进行萃取， 萃取压力为20MPa， 二氧化碳流量为180kg/h， 萃 取2h后， 从流体相中分离得到甾醇固体， 甾取， 备用； 取60g菊花花瓣， 先粉碎过80目筛， 再将 粉末置于500mL质量分数85%乙醇溶液中， 搅拌后移入超声提取装置中， 在65和120W下进 说明书 3/4 页 5 CN 105524968 A 5 行提取3h， 得提取液， 将提取液在5000r/min转速下离心分离， 取上清液， 将上清液移入圆底 烧瓶中， 用旋转蒸发仪在55下蒸发浓缩至乙醇完全去除， 将浓缩液转移到分液漏斗中， 按 。
21、体积比1： 2加入石油醚进行脱色3次， 分层得水相， 再用乙酸乙酯萃取5次， 取下层液体， 即为 绿原酸； 取3g甾醇于250mL锥形瓶中， 按固液1:6向瓶中加入上述绿原酸， 搅拌混合后再加入 总质量10%固定化脂肪酶为催化剂、 0.3g二十六烷为内标和50mL甲醇为溶剂， 将锥形瓶放入 恒温振荡器中， 在65和120r/min下进行酯化反应5h； 将酯化反应后的混合物按体积比1:8 溶于正己烷中， 用硅胶柱层析分离， 分离后收集洗脱液， 并在70进行旋转蒸发， 得到绿原 酸甾醇酯浓缩液， 将浓缩液在55下干燥8h得到绿原酸甾醇酯粉末状固体。 说明书 4/4 页 6 CN 105524968 A 6 。