技术领域
本发明涉及一种DNA分子标记技术，具体涉及为油茶微卫星遗传标记的开发技术，适用 于油茶的遗传多样性研究，种质鉴定和亲缘关系分析。
背景技术
微卫星(Microsatellite)是指广泛散布于基因组中的以少数几个核苷酸(多数为2-4 个)为单位的多次串联重复的DNA序列，人们称之为简单重复序列(Simplesequencerepeats， SSR)，是基因组中变异率相对较高一类DNA序列。近些年来，SSR已经成为最流行的遗传标 记。作为检测效率较高的共显性标记，SSR标记集中了其它分子标记的优点，如典型的共显 性和多等位基因，具备高的多态性，能准确区分亲缘关系非常相近的个体；DNA的用量少， 扩增结果的重现性高，可以有效地实现简单，快速的PCR操作，同时基因型可通过琼脂糖凝 胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，也可通过引物的荧光标记进行自动分析。但是，SSR标 记的开发依赖于拥有大量的DNA序列基础，而在以往，传统的微卫星开发途径主要通过构建 基因组文库，费时耗力并且效率不高，局限了微卫星的运用。随着植物基因组学及生物信息 学的发展，大规模基因测序技术日新月异，第二代以454测序为标志的测序技术更是推动了 高通量基因组测序时代的来临。利用微卫星搜索工具从基因测序得到的大量DNA序列中查找 微卫星，已然成为开发微卫星标记最为便捷、有效的方式。目前已在如松柏类树种、杨柳科 树种、桉树、壳斗科树种及大部分蔷薇科树种等许多林木中开发并应用微卫星标记，并广泛 的运用于指纹分析、构建遗传连锁图谱、群体遗传结构和进化分析研究。
油茶(Camelliaoleifera)称之为东方的橄榄树而闻名于世，与油棕、油橄榄和椰子并 称为世界四大木本食用油料树种。油茶主产品茶油是优质高级食用油，其成分以油酸和亚油 酸为主的不饱和脂肪酸含量在90％以上，易于人体吸收，耐贮藏，不易酸败，且色美味香， 深受人民的喜爱。目前油茶优树在全国范围内集中决选，各主产区间存在相互引种栽培的普 遍现象，这就导致油茶各无性系的自然地域性特征不强，油茶良种、无性系及地方农家品种 等相互混杂在所难免，采用有效的分子标记在遗传学角度开展油茶品种真实性的分子甄别在 生产应用中变的尤为迫切；而为了研究油茶遗传变异规律，同时从大量的油茶遗传资源中选 育并丰富油茶良种，开展油茶分子标记辅助育种也是其行之有效的方法。当前油茶育种工作 者广泛采用的分子标记为现有的通用型分子标记，如RAPD、ISSR等均为显性标记，存在重复 性差的严重缺陷，及共迁移的缺点。与其它分子标记相比，SSR标记数量丰富，基因组覆盖度 高，呈现多基因特点，信息含量高，表现为共显性遗传，重复性好，且SSR分析对DNA数量及 纯度要求不高。然而迄今，油茶微卫星分子标记的开发利用研究甚少，国内只有少量利用茶 树微卫星标记引物随机扩增油茶基因组的报道(刘冰等，油茶SSR-PCR反应体系建立与优化. 安徽农业大学学报,2011,38(6):858-862)，此外除温强等(WenQetal.Developmentof polymorphicmicrosatellitemarkersinCamelliachekiangoleosa(Theaceae),American JournalofBotany,2012,5(1):e203-e205.)利用油茶类物种浙江红花油茶的EST序列开发 了18对浙江红花油茶的SSR标记外，未见利用油茶DNA序列开发油茶SSR标记的报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术尚未利用油茶DNA序列开发油茶微卫星标记的现状，利用 454测序技术获得普通油茶基因组序列与EST序列，应用生物信息学方法，开发出油茶微卫 星分子标记，建立油茶微卫星的技术体系，并应用于油茶优良高产无性系的遗传多样性研究 及DNA指纹图谱构建。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
(1)所述油茶SSR分子标记特征包括：微卫星分子标记编号、微卫星分子标记所对应的 核苷酸序列、微卫星分子标记所对应的12个位点的引物序列；
所述的微卫星标记编号为：CO_gSSR11、CO_gSSR12、CO_gSSR14、CO_gSSR16、CO_gSSR19、 CO_gSSR20、CO_eSSR01、CO_eSSR04、CO_eSSR16、CO_eSSR40、CO_eSSR44、CO_eSSR48；
所述微卫星分子标记所对应的核苷酸序列分别为：
CO_gSSR11：
CO_gSSR12：
CO_gSSR14：
CO_gSSR16：
CO_gSSR19：
CO_gSSR20：
CO_eSSR01：
CO_eSSR04：
CO_eSSR16：
CO_eSSR40：
CO_eSSR44：
CO_eSSR48：
所述12个位点为：CO_gSSR11、CO_gSSR12、CO_gSSR14、CO_gSSR16、CO_gSSR19、CO_gSSR20、 CO_eSSR01、CO_eSSR04、CO_eSSR16、CO_eSSR40、CO_eSSR44、CO_eSSR48，
各位点所对应的引物序列分别为：
CO_gSSR11F：GCACAATCCTTTCACTTT
CO_gSSR11R：TGTTTGAGGTACAACCGT
CO_gSSR12F：ACAAGGAGGAGAACGAAT
CO_gSSR12R：CACGCTCCCACTACATAA
CO_gSSR14F：TGGGGTATTCTTTTGCTT
CO_gSSR14R：CAGTACACCTCACTTGGA
CO_gSSR16F：CCATCTTCGTTGCTATTA
CO_gSSR16R：CGGTGATGACGAGGTGAG
CO_gSSR19F：TTAGTTTAGCCAAACTTG
CO_gSSR19R：ACTCTTTAGTTGATCAGATG
CO_gSSR20F：TGGTGGTCTGATAGTGCC
CO_gSSR20R：ATGCGAGCTTCATTGTTA
CO_eSSR01F：ACTCCCAGTCACCTCCCT
CO_eSSR01R：CAAAGCCTCGAAATCGTC
CO_eSSR04F：GTGGGCAAGGCAACAAAT
CO_eSSR04R：TGAGGGAGCAAAGGTAGA
CO_eSSR16F：AGAACCCTCCATTGAAAC
CO_eSSR16R：GTCCTCGTCCAAGAAGTA
CO_eSSR40F：CGCCAACAACCTCCGACAA
CO_eSSR40R：GCGGCAGAAAGCACAGCAA
CO_eSSR44F：ATTTGCGGGTATGGATGT
CO_eSSR44R：GTGGCTCAACTGGAAGGA
CO_eSSR48F：GAAAGCACAGCGAAGAGC
CO_eSSR48R：GCAGACACCGTGGACAAG
(2)SSR标记体系的特征包括：PCR反应体系和PCR反应程序；
PCR反应体系：10μl中含10×PCR缓冲液1ul，Mg2+2.5mM，dNTPs0.2mM，上下游引物 各0.2μM，Taq聚合酶1U，DNA30ng左右；
PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃，30s，Ta，30s，72℃，30s，30个循环；最后 72℃延伸1min，8度保存。各引物对应的退火温度(Ta)详见下表：
引物特性表：位点，引物序列，重复基序，片段大小，退火温度。
对经454测序得到的油茶基因组序列及EST序列进行整理，挖掘SSR位点信息，依据SSR 位点侧翼序列进行SSR-PCR引物设计、合成与引物筛选。从搜索到的油茶EST序列中的1815 个SSR位点及基因组序列中的3229个SSR位点所对应序列中各随机选择50条含不同简单序 列重复单元并符合条件的序列；最终获得12个扩增条带清晰，多态性较好的SSR标记，编号 分别为CO_gSSR11、CO_gSSR12、CO_gSSR14、CO_gSSR16、CO_gSSR19、CO_gSSR20、CO_eSSR01、 CO_eSSR04、CO_eSSR16、CO_eSSR40、CO_eSSR44、CO_eSSR48。
CO_gSSR11为325个核苷酸、CO_gSSR12为424个核苷酸、CO_gSSR14为432个核苷酸、 CO_gSSR16为519个核苷酸、CO_gSSR19为189个核苷酸、CO_gSSR20为408个核苷酸、CO_eSSR01 为333个核苷酸、CO_eSSR04为308个核苷酸、CO_eSSR16为476个核苷酸、CO_eSSR40为407 个核苷酸、CO_eSSR44为399个核苷酸、CO_eSSR48为388个核苷酸。
本发明的有益效果：本发明可应用于油茶种质资源的遗传多样性评价，适用于不同地理 种源的油茶品种、无性系、农家品种的遗传变异、种质鉴定及分子标记辅助育种研究，重复 性好、可靠性高，是一种非常有效的分子标记。
附图说明
图1CO_gSSR11位点扩增18个赣无系列油茶高产无性系的DNA样本的银染PAGE图；
图2CO_gSSR12位点扩增18个赣无系列油茶高产无性系的DNA样本的银染PAGE图；
图3CO_gSSR14位点扩增18个赣无系列油茶高产无性系的DNA样本的银染PAGE图；
图4CO_gSSR16位点扩增18个赣无系列油茶高产无性系的DNA样本的银染PAGE图；
图5CO_gSSR19位点扩增18个赣无系列油茶高产无性系的DNA样本的银染PAGE图；
图6CO_gSSR20位点扩增18个赣无系列油茶高产无性系的DNA样本的银染PAGE图；
图7CO_eSSR01位点扩增18个赣无系列油茶高产无性系的DNA样本的银染PAGE图；
图8CO_eSSR04位点扩增18个赣无系列油茶高产无性系的DNA样本的银染PAGE图；
图9CO_eSSR16位点扩增18个赣无系列油茶高产无性系的DNA样本的银染PAGE图；
图10CO_eSSR40位点扩增18个赣无系列油茶高产无性系的DNA样本的银染PAGE图；
图11CO_eSSR44位点扩增18个赣无系列油茶高产无性系的DNA样本的银染PAGE图；
图12CO_eSSR48位点扩增18个赣无系列油茶高产无性系的DNA样本的银染PAGE图。
具体实施方式
为了详细说明本发明油茶微卫星标记的技术内容、构造特征，以下结合实施方式并配合 附图作进一步说明。
实施例1：
1.油茶SSR分子标记的制备方法
1.1油茶DNA序列的获得及预处理
采用本研究组的方法(参照JiangCetal.EfficientextractionofRNAfromvarious Camelliaspeciesrichinsecondarymetabolitesfordeeptranscriptomesequencingand geneexpressionanalysis.AfricanJournalofBiotechnology,2011,10(74): 16769-16773.)提取油茶DNA及RNA，分别构建基因组及转录组文库，经各1/4个454GSFLX 高通量测序反应获得基因组及EST序列。EST序列采用SeqClean和Lucy软件去掉低质量序 列后经CAP3拼接，测序得到的基因组序列用454测序仪自带的Newbler软件进行处理和拼接。
1.2油茶DNA序列中SSR位点的筛选
采用MISA软件(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)检索各DNA序列中的SSR位 点。对454序列中的2-6核苷酸重复类型SSR进行检索，检索标准同时包括精确型(perfect) 及复合型(compound)SSR位点，含二、三、四、五和六核苷酸类型的重复序列长度≧18bp， 最小重复数分别为9、6、5、5和4次。得到一系列含SSR位点的序列。
1.3油茶SSR引物的设计与合成
采用PRIMER5.0软件对串联重复长度大于18bp的Unigene(无冗余独立基因序列)进 行SSR引物设计。引物设计的要求为：扩增产物长度100～500bp；引物长度18～24bp，各 距重复序列不少于20bp，GC含量40～60％，退火温度Tm值50℃～62℃，且上下游引物的 Tm值相差不大于5℃；尽量避免引物二聚体(dimer)、发夹结构(hairp-in)、错配(false primer)等。其中，利用油茶3065条具有微卫星的基因组及1696条具有微卫星的EST序列 随机设计gSSR引物与eSSR引物各50对，分别编号CO_gSSR1-50及CO_eSSR1-50。引物设计 完成后，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
1.4油茶SSR引物的筛选
试验所用所有样本的基因组总DNA的提取采用本研究组优化的CTAB法(参照JiangCet al.EfficientextractionofRNAfromvariousCamelliaspeciesrichinsecondary metabolitesfordeeptranscriptomesequencingandgeneexpressionanalysis.African JournalofBiotechnology,2011,10(74):16769-16773.)，选择5个赣无系列的油茶高产 无性系作为多态性引物筛选样本。
ABI9700(AppliedBiosystems，Carlsbad，California，USA)执行PCR程序。经优化 筛选，我们构建了一个在油茶物种中较为广谱的SSR标记体系。PCR反应体系：10μl中含 10×PCR缓冲液1ul，Mg2+2.5mM，dNTPs0.2mM，上下游引物各0.2μM，Taq聚合酶1U(5U/μl)， DNA30ng左右。PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃，30s，Ta，30s，72℃，30s，30个循 环；最后72℃延伸1min，8度保存，各引物对应的退火温度(Ta)详见表1。
采用8％聚丙烯酰胺凝胶(10mL灌胶液中含4.2g尿素，1.25ml10×TBE，70μlAPS，10μl TEMED，2.0ml40％胶(丙烯酰胺:甲叉丙烯酰胺＝39:1(w/w))，在垂直电泳槽(DYCZ-32型电 泳槽(北京六一))中进行电泳分离，50bpMarker(天根)作为标准分子量，电泳产物经银染 后对各位点进行数据判读。
银染检测步骤为：10μlPCR产物加6μl6×上样缓冲液，点样孔上样1μl，120V恒压 电泳1～2h后，拆玻板固定染色；固定10min(固定液10％乙醇，0.5％乙酸(v/v))，ddH2O漂 洗2次，每次2min；再用0.15％AgNO3(w/v)染色10min，ddH2O漂洗2次每次2min，最后 显影液(1.5％NaOH，0.00756％NaBO4，0.75％甲醛(w/v))显影至条带清晰，数码照相记录。 对扩增结果进行分析后，共得到12对扩增条带清晰、多态性丰富的SSR引物。
2.12对油茶SSR引物的遗产多样性分析
采用多态性性较好的12个SSR标记构建了18个赣无系列油茶高产无性系的SSR指纹图 谱。这18个高产无性系来至于江西油茶国家良种，编号为赣无系列，全部为6倍体物种。PCR 扩增反应体系和反应条件同步骤1.4。
对于多倍体材料，SSR的带型将会呈现丰富的变异。数据判读以如下标准，SSR扩增谱带 显带处记为“1”，缺失或模糊不清处记为“0”，建立0/1二元数据矩阵。运用POPGEN32软 件计算观察等位基因数目(A)、有效等位基因数目(Ne)、Nei基因多样度(h)、Shannon多 样性指数(I)，并统计位点的多态位点百分比(PPL)。以此来描述12个油茶SSR多态位点的 特征。
由说明书附图1-12中可看出，本发明的12个SSR位点在供试的18个油茶无性系样本表 现出较好的多态性扩增，由此可见，本发明的这12个SSR标记可用于油茶种质资源的遗传多 样性、分子指纹图谱构建，具有很好的重复性，高多态性，是一种可靠有效的分子标记。
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围， 因此依本发明权利所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。