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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310606951.9 (22)申请日 2013.11.25 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (73)专利权人 盎亿泰地质微生物技术 （北京） 有 限公司 地址 102200 北京市昌平区科技园华通路 11 号 4 层 (72)发明人 郝纯 邓诗财 梅海 李雪 (74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限 公司 11227 代理人 冯琼 CN 102399895A ,2012.04.04, Annette Mehling et al.Nucleot。
2、ide sequences of streptomycete 16s ribosomal DNA: towards a specific identification system for streptomycetes using PCR. Microbiology .1995, 第 141 卷 ( 第 9 期 ), 第 2139-2147 页 . (54) 发明名称 一种扩增链霉菌的 PCR 引物及检测链霉菌的 方法及试剂盒 (57) 摘要 本发明涉及微生物领域， 公开了一对用于扩 增链霉菌 DNA 的 PCR 引物， 其上游引物序列如 SEQ ID No.1所示， 下游引物序列如SEQ I。
3、D No.2所示。 本发明还提供检测链霉菌的方法及试剂盒。本发 明所述引物适合于纯化链霉菌扩增 DNA， 也适合 于从混合菌群扩增链霉菌 DNA， 扩增链霉菌安全、 准确、 快速、 稳定， 特异性强， 灵敏度高。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 程婷 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图1页 CN 103667461 B 2016.04.20 CN 103667461 B 1/1 页 2 1.一对扩增链霉菌 DNA 的 PCR 引物， 其特征在于， 其上游引物序列如 SEQ ID No.1 所 示， 下游引物序列。
4、如 SEQ ID No.2 所示。 2.一种检测链霉菌的试剂盒， 其特征在于， 包含用于扩增的 PCR 引物， 其上游引物序列 如 SEQ ID No.1 所示， 下游引物序列如 SEQ ID No.2 所示。 3.一种非诊断目的的检测链霉菌的方法， 包含以下步骤 ： 步骤 1 ： 配制 PCR 反应体系， 94预变性 10 分钟进行 30 个 PCR 循环， 循环完毕后 72 延伸10分钟 ； 所述PCR反应体系中上游引物序列如SEQ ID No.1所示， 下游引物序列如SEQ ID No.2 所示 ； 步骤 2 ： 检测扩增结果并进行测序比对 ； 步骤 1 所述 PCR 循环参数为 ： 9。
5、4变性 1min、 54复性 1min、 72延伸 1min ； 步骤 1 中所述 PCR 反应体系为 ： PCR 缓冲液 :5L dNTP:4L 上游引物 :1L 下游引物 :1L 样品 DNA:1L Taq:0.5L ddH2O:37.5L 其中， 样品 DNA 浓度为 10-200ng/L， 上游引物及下游引物浓度为 10-20pmol/L ； 步骤 2 所述检测为琼脂糖电泳检测 230bp 的条带出现。 权 利 要 求 书 CN 103667461 B 2 1/6 页 3 一种扩增链霉菌的 PCR 引物及检测链霉菌的方法及试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及微生物领域， 具体涉及一种。
6、用于扩增链霉菌的 PCR 引物及检测链霉菌 的方法及试剂盒。 背景技术 0002 链霉菌属属于放线菌目的一科， 链霉菌广泛存在于土壤中。由于链霉菌属的菌种 数最多， 分类鉴定比较困难， 一般认为孢子丝的形状、 孢子的表面结构、 孢子的颜色和在有 机培养基内是否产生类黑色素是最主要的分类指征。链霉菌大多在人工培养基上生长茂 盛， 少数是植物致病菌， 但在液体培养基中由于其产生的抗生素能抑制链霉菌的生长， 因此 一般不用液体培养基进行培养分离。 0003 链霉菌具有重要的应用价值， 其中许多种是抗生素 （如链霉素） 的产生菌而且产生 抗生素的种类最多而著名， 代表种为白色链霉菌。另外链霉菌能降解及。
7、利用一些环境污染 物及有机物， 比如含氮杂环化合物和原油， 因此链霉菌日益受到人们的关注。 0004 现有技术中， 有如下两种常用的对链霉菌进行鉴定的方法 ： 0005 1、 生理生化指标鉴定。此方法是目前许多生化实验室常用的方法， 此方法需要得 到菌株的纯培养物， 且实验周期长， 实验结果受人为观察影响因素较大， 准确性不高。 0006 2、 提取菌株 DNA 进行测序。目前是用 16SrRNA 基因引物进行 PCR 扩增， 将扩增出 的 DNA 片段进行测序。此方法结果比较准确。但仍需要得到菌株的纯培养物， 无法从混合 样品中快速鉴定是否含有链霉菌。目前本领域迫切需要开发出一种能够快速、 。
8、准确判定链 霉菌的方法。 发明内容 0007 本发明针对现有技术鉴定链霉菌试验周期长、 适用范围窄的不足， 提供一种能够 快速、 准确、 方便， 可对混合样品如土壤、 海底沉积物、 水中是否含有链霉菌进行快速判定的 方法。 0008 为了实现上述目的， 本申请的发明人设计了一对针对链霉菌 16SrDNA 基因部分片 段的 PCR 引物， 设计简并引物 ： Str-F ： 5 -GGGTCTAATACCGGATA-3 （如 SEQ ID No.1 所示） ， Str-R ： 5 -CCGTCGTCGCCTTGGT-3 （如 SEQ ID No.2 所示） 。 0009 所述 16S rDNA 基。
9、因是指基因组中编码 16S 核糖体 RNA（rRNA） 分子的对应的 DNA 序列， 也就是编码 16S rRNA 的基因。本发明所述引物的 16S rDNA 目的基因具体如下 ： 0010 TCCAGTAAAGTGACGTATTACCATGCAGTCGACGATGAACCA CTTCGGTGGGGATTAGTGGCGAACGG GTGAGTAACACGTGGGCA ATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATA CCGGATAACACT TCCACTCGCATGGGTGGAGGTTAAAAGCTCCGG CGGTGAAGGATGAGCCCGCGGC。
10、CTATCAGCTTGTTGGTGAGGT AA TGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGAC CGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCA GACTCCTACGGGAGG CAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGC GACGCCGCGTGAGGGA TGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTC AGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGC CGG 说 明 书 CN 103667461 B 3 2/6 页 4 CTAACTACGTGCC。
11、AGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAA GCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGT AGGCGGTCTG TCACGTCGGATGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATT CGATACGGGCAGACTAGAGT GTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTG GTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGC GAAGGC GGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGC GTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAC G。
12、CCGTAA ACGGTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCG CAGCTAACGCATTAAGTTCCCCG CCTGGGGGAGTACGGCCGCAAG GCTAAAACTCAAGAGAATTGGGAACGGGAA（如 SEQ ID No.3 所示） 。 0011 本发明的术语 “引物” 指作为合成引物延伸产物的起始位点的单链寡核苷酸序列， 其与待复制的核酸链互补， 长度和序列必须适合于延伸产物的合成。引物是一段短的单链 RNA 或 DNA 片段， 可结合在核酸链上与之互补的区域， 其功能是作为核苷酸聚合作用的起始 点， 核酸聚合酶可由其3端开始合。
13、成新的核酸链。 体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶 链反应、 测序和探针合成等。 0012 本发明还提供一种检测链霉菌的试剂盒， 包含用于扩增的 PCR 引物， 其上游引物 序列如 SEQ ID No.1 所示， 下游引物序列如 SEQ ID No.2 所示。 0013 本发明提供一种检测链霉菌的方法， 包含以下步骤 ： 0014 步骤 1 ： 配制 PCR 反应体系， 94预变性 10 分钟进行 30 个 PCR 循环， 循环完毕后 72延伸 10 分钟 ； 所述 PCR 反应体系中上游引物序列如 SEQ ID No.1 所示， 下游引物序列 如 SEQ ID No.2 所示 ； 0015 。
14、步骤 2 ： 检测扩增结果并进行测序比对。 0016 作为优选， 步骤 1 所述 PCR 循环参数为 ： 94变性 1min、 54复性 1min、 72延伸 1min。 0017 作为优选， 步骤 1 中所述 PCR 反应体系为 ： 0018 PCR 缓冲液 :5L 0019 dNTP:4L 0020 Primer F 上游引物 :1L 0021 Primer R 下游引物 :1L 0022 样品 DNA:1L 0023 Taq:0.5L 0024 ddH2O:37.5L 0025 其中， 样品 DNA 浓度为 10-200ng/L， 上游引物及下游引物浓度为 10-20pmol/ L。 0。
15、026 作为优选， 步骤 2 所述检测为琼脂糖电泳检测 230bp 的条带出现。 0027 本发明与现有的技术相比具有如下有益效果 ： 0028 1. 本发明所述的链霉菌属检测方法， 操作简单， 耗时少， 结果更精确。 0029 2. 本发明所设计的引物目标位于 16S rDNA 基因， 该基因在进化中较为保守， 是分 类学研究中常用的研究对象， 具有较好的特异性。 0030 3. 本发明试验周期短， 能在 3 小时内得出结果、 适用范围广， 无需分离纯菌株即可 对各种环境样品中是否含有链霉菌属细菌进行检测。 附图说明 说 明 书 CN 103667461 B 4 3/6 页 5 0031 图。
16、 1 为本发明所述引物以混合菌株 DNA 为模板的扩增产物凝胶电泳图 ； 0032 图 2 为本发明所述引物以土壤 DNA 为模板的扩增产物凝胶电泳图 ； 其中泳道 1-4 分别为不同土壤的 DNA 样品 ； 0033 图 3 为本发明所述引物以混合菌株 DNA 为模板的扩增产物凝胶电泳图 ； 其中泳道 1 和泳道 2 为同一 DNA 样品 ； 0034 图 4 为本发明所述引物以链霉菌 DNA 配制的梯度浓度的 DNA 为模板的扩增产物 凝胶电泳图 ； 其中泳道 1-6 中所含 DNA 含量分别为 200ng， 20010 1ng、 20010 2ng、 20010 3ng、 20010 4。
17、ng、 20010 5ng。 具体实施方式 0035 本发明公开了一种用于扩增链霉菌的 PCR 引物及检测链霉菌的方法及试剂盒， 本 领域技术人员可以借鉴本文内容， 适当改进工艺参数实现。 特别需要指出的是， 所有类似的 替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的， 它们都被视为包括在本发明。本发明的 产品、 方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述， 相关人员明显能在不脱离本发明内容、 精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合， 来实现和应用本发明 技术。 0036 为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案， 下面结合具体实施例对 本发明作进一步的详细说明。 0037。
18、 实施例 1 ： 以纯培养物基因组 DNA 为模板用本发明所述引物进行 PCR 扩增 0038 步骤 1 ： 选取含有链霉菌的混合菌培养物， 提取其基因组 DNA。提取方法参照 TAKARA 公司的细菌基因组 DNA 提取试剂盒， 得到混合菌的基因组 DNA. 0039 步骤 2 ： 以步骤 1 得到的 DNA 为模板， 配制为 100-200ng/L 的 DNA 样品， 与 10-20pmol/L 的 PCR 引物配成如下 50L 反应体系， 进行 PCR 扩增反应 ： 0040 PCR buffer ： 5L 0041 dNTP ： 4L 0042 Primer F 上游引物 ： 1L 0。
19、043 Primer R 下游引物 ： 1L 0044 DNA ： 1L 0045 Taq ： 0.5L 0046 ddH2O ： 37.5L 0047 步骤 3 ： 按照上述体系混合之后， 将 PCR 管放入 PCR 仪器进行扩增。PCR 程序如下 ： 0048 说 明 书 CN 103667461 B 5 4/6 页 6 0049 PCR 酶采用的是 Taq 酶 （TAKARA） 0050 步骤 4 ： 电泳观察。取出 PCR 终产物 5L 与 1L 上样缓冲液混合， 80V， 1% 琼脂糖 凝胶电泳30分钟， 在凝胶电泳成像仪下紫外观察。 结果见图1所示， 其中， 泳道M为marker，。
20、 泳道 1 为含有链霉菌的混合菌 DNA 样品， 可见泳道 1 特异扩增出 230bp 的条带。将扩增出 的条带回收后进行测序。测序结果表明， 所扩增的 230bp 条带即为引物设计时链霉菌属的 目标基因片段， 其序列如 SEQ ID No.3 所示 ； 230bp 条带为目标基因片段。 0051 实施例 2 ： 以土壤细菌基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增 0052 步骤 1 ： 取 1 至 2 克土壤样品， 提取其微生物总 DNA。提取方法参照 DNA Recovery from Soils of Diverse Composition(JIZHONG ZHOU， 1996)， 得到。
21、土壤总 DNA 溶液。 0053 步骤 2 ： 以步骤 1 得到的 DNA 为模板， 配制为 100-200ng/L 的 DNA 样品， 与 10-20pmol/L 的 PCR 引物配成如下 50L 反应体系， 进行 PCR 扩增反应 ： 0054 PCR buffer ： 5L 0055 dNTP ： 4L 0056 Primer F 上游引物 ： 1L 0057 Primer R 下游引物 ： 1L 0058 DNA ： 1L 0059 Taq ： 0.5L 0060 ddH2O ： 37.5L 0061 步骤 3 ： 按照上述体系混合之后， 将 PCR 管放入 PCR 仪器进行扩增。PC。
22、R 程序如下 ： 0062 0063 PCR 酶采用的是 Taq 酶 （TAKARA） 说 明 书 CN 103667461 B 6 5/6 页 7 0064 步骤 4 ： 电泳观察。取出 PCR 终产物 5L 与 1L 上样缓冲液混合， 80V， 1% 琼脂糖 凝胶电泳30分钟， 在凝胶电泳成像仪下紫外观察， 结果见图2所示， 其中， 泳道M为marker， 泳道 1-4 为土壤样品。可见泳道 1 和泳道 3 可特异性扩增出 230bp 的条带， 泳道 2 和泳道 4 未有目标条带出现。将扩增出的条带回收后进行测序。测序结果表明， 所扩增的 230bp 条 带即为引物设计时链霉菌属的目标基因。
23、片段， 其序列如SEQ ID No.3所示， 为链霉菌DNA扩 增产物。则据此判定泳道 1 和泳道 3 的土壤样品含有链霉菌， 泳道 2 和泳道 4 的土壤样品 则不含有红球菌。 0065 对泳道 1-4 的样品进行培养鉴定， 与用本发明所述引物进行 PCR 扩增的鉴定结果 一致。 0066 实施例 3 ： 本发明所述引物扩增链霉菌 DNA 的稳定性试验 0067 参照实施例 1 和实施例 2， 选取含有链霉菌的混合菌株纯培养物， 提取其基因组 DNA。 0068 步骤 2 ： 以步骤 1 得到的 DNA 为模板， 配制为 100-200ng/L 的 DNA 样品， 与 10-20pmol/L。
24、 的 PCR 引物配成如下 50L 反应体系， 进行 PCR 扩增反应 ： 0069 PCR buffer ： 5L 0070 dNTP ： 4L 0071 Primer F 上游引物 ： 1L 0072 Primer R 下游引物 ： 1L 0073 DNA ： 1L 0074 Taq ： 0.5L 0075 ddH2O ： 37.5L 0076 步骤 3 ： 按照上述体系混合之后， 将 PCR 管放入 PCR 仪器进行扩增。PCR 程序如下 ： 0077 0078 0079 PCR 酶采用的是 Taq 酶 （TAKARA） 0080 步骤 4 ： 电泳观察。取出 PCR 终产物 5L 与 。
25、1L 上样缓冲液混合， 80V， 1% 琼脂糖 凝胶电泳30分钟， 在凝胶电泳成像仪下紫外观察。 结果见图3所示， 其中， 泳道M为marker， 泳道 1 和 2 为同一混合菌基因组 DNA 样品。可见泳道 1 和泳道 2 均可特异性扩增出 230bp 的条带。将扩增出的条带回收后进行测序。将扩增出的 230bp 条带回收后进行测序。测序 结果表明， 所扩增的 230bp 条带为引物设计时链霉菌属的目标基因片段， 其序列如 SEQ ID No.3所示， 为链霉菌DNA扩增产物。 对样品进行培养鉴定， 与用本发明所述引物进行PCR扩 说 明 书 CN 103667461 B 7 6/6 页 8。
26、 增的鉴定结果一致。说明本发明所述引物扩增链霉菌 DNA 重复性好， 结果稳定。 0081 实施例 4 ： 本发明所述引物扩增链霉菌 DNA 的灵敏度试验 0082 取纯化的链霉菌基因组 DNA 配制梯度浓度的 DNA 溶液， 原液所含 DNA 为 200ng， 依 次稀释为 DNA 浓度为 20010 1ng、 20010 2ng、 20010 3ng、 20010 4ng、 20010 5ng， 参照实施例 1 所述方法进行 PCR 扩增， 取扩增产物进行凝胶电泳， 结果可见在 DNA 含量 在 20010 3ng 处， 仍可扩增出 450bp 目的条带， 而 DNA 含量在 20010 。
27、4ng 和 20010 5ng处， 无任何条带出现， 说明在DNA模板含量为200103ng时， 引物仍可准确扩增出红球 菌目标条带， 灵敏度高。 0083 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。 说 明 书 CN 103667461 B 8 1/2 页 9 0001 序 列 表 CN 103667461 B 9 2/2 页 10 0002 序 列 表 CN 103667461 B 10 1/1 页 11 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103667461 B 11 。