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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310559498.0 (22)申请日 2013.11.11 CGMCC No.7961 2013.07.22 CGMCC No.7962 2013.07.22 C12P 7/42(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (73)专利权人 天津大学 地址 300072 天津市南开区卫津路 92 号 (72)发明人 赵广荣 姚元锋 赵莹 王长松 (74)专利代理机构 天津市北洋有限责任专利代 理事务所 12201 代理人 王秀奎 CN 188。
2、4558 A,2006.12.27, CN 101186572 A,2008.05.28, 张彦文等 . 丹酚酸 A 衍生物的合成方法研 究. 天津药学 .2007,第19卷(第2期),72-74. Yao Yuan-Feng et al.Metabolic engineering of Escherichia coli for production of salvianic acid A via an artificial biosynthetic pathway. Metabolic Engineering .2013, 第 19 卷 79-87. (54) 发明名称 一种丹参素的生物生产。
3、方法 (57) 摘要 本发明公开了一种丹参素的生物生产方法， 对羟基苯丙酮酸在对羟基苯乙酸间位羟基化酶的 催化下合成3， 4-二羟基苯丙酮酸， 随后在D-乳酸 脱氢酶的催化下合成丹参素 ； 或者对羟基苯丙酮 酸现在 D- 乳酸脱氢酶的催化下合成对羟基苯乳 酸， 然后在经过对羟基苯乙酸间位羟基化酶的催 化， 合成丹参素。 本发明使用基因工程谷氨酸棒状 杆菌和大肠杆菌， 进行发酵生产丹参素， 不需底物 添加即可合成丹参素， 实现了丹参素的从头合成， 可解决丹参素的来源问题， 同时最大限度的降低 了生产成本， 有利于工业化生产。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员。
4、 李影 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书2页 说明书9页 序列表14页 附图4页 CN 103667371 B 2016.03.16 CN 103667371 B 1/2 页 2 1.一种丹参素的生物生产方法， 其特征在于， 按照下述步骤进行 ： 步骤 1， 设计并优化对羟基苯乙酸间位羟基化酶的基因序列， 并全合成所述目标基因 ； 所述对羟基苯乙酸间位羟基化酶的基因序列如序列表 SEQ ID No.1 所示 ； 步骤 2， 设计并优化 D- 乳酸脱氢酶 (D-LCH) 的基因序列， 并全合成所述目标基因， 并经 过位点突变， 获得 D- 乳酸脱氢酶基因序列的突。
5、变基因序列 D-LCH(Y52V) 和 D-LCH(Y52A) ； 所述 D- 乳酸脱氢酶 (D-LCH) 的基因序列如序列表 SEQ ID No.4 所示， 其对应的蛋白质序列 中第 52 位氨基酸为酪氨酸 ； 所述 D- 乳酸脱氢酶基因序列的突变基因序列 D-LCH(Y52V) 如 序列表SEQ ID NO.7所示， 其对应的蛋白序列如序列表SEQ ID NO.8所示， 与序列表SEQ ID No.4 编码的蛋白质相比， 在第 52 位氨基酸突变为缬氨酸 ； 所述 D- 乳酸脱氢酶基因序列的 突变基因序列 D-LCH(Y52A) 如序列表 SEQ ID NO.9 所示， 其对应的蛋白序列如。
6、序列表 SEQ ID NO.10所示， 与序列表SEQ ID No.4编码的蛋白质相比， 在第52位氨基酸突变为丙氨酸 ； 步骤 3， 设计并优化 T7RNA 聚合酶基因序列， 并全合成所述目标基因 ； 所述 T7RNA 聚合 酶基因序列如序列表SEQ ID NO.15所示， T7RNA聚合酶蛋白序列如序列表SEQ ID NO.16所 示 ； 步骤 4， 将获得的对羟基苯乙酸间位羟基化酶基因序列 SEQ ID No.1、 T7RNA 聚合酶基 因序列 SEQ ID NO.15， 与 D- 乳酸脱氢酶基因序列 SEQ ID No.4、 D- 乳酸脱氢酶基因序列 的突变基因序列 D-LCH(Y52。
7、V)SEQ ID NO.7、 或者 D- 乳酸脱氢酶基因序列的突变基因序列 D-LCH(Y52A)SEQ ID NO.9 之一的序列进行配合构建表达载体， 并转染大肠杆菌或者嵌入大 肠杆菌基因组 ； 所述大肠杆菌为高产酪氨酸大肠杆菌， 菌种名称为 SyBE-002447， 建议的分 类命名为大肠埃希氏菌 Escherichia coli， 现于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心保藏， 保藏中心登记入册编号为 CGMCC No.7962 ； 步骤 5， 利用步骤 4 得到的工程菌进行发酵生产丹参素 ； 将 50uL 测序正确的插入菌株保存的甘油菌， 甘油菌保存方法为 600uL 甘油和。
8、 600uL 菌 液混合， 放置-20度进行长期保藏 ； 接入5mL LB培养基， 加入相应抗生素氨苄青霉素100ug/ ml 中， 37， 220rmp 培养 12h， 后将 500ul 菌液转接至含有 15mL 的 MOPS 培养基中， MOPS 培 养基中含有 5g/l 葡萄糖， 1g/l 酵母提取物， 并加入相应的氨苄青霉素抗 生素 ： 100ug/ml， 37， 220rmp， 当 OD 0.6-0.8 时， 加入异丙基 -D- 硫代吡喃半乳糖苷， 每隔 12h 补充一 次葡萄糖至 5g/l， 发酵 48h。 2.根据权利要求 1 所述的一种丹参素的生物生产方法， 其特征在于， 在所。
9、述步骤 1 中， 选用大肠杆菌 BL21(DE3) 菌株的对羟基苯乙酸间位羟基化酶基因序列， 设计引物并克隆。 3.根据权利要求 1 所述的一种丹参素的生物生产方法， 其特征在于， 在所述步骤 2 中， 以植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)ATCC14917 的 D- 乳酸脱氢酶基因序列作为参 考， 设计 PCR 引物， 以植物乳杆菌 CICC21419 的基因组为模板进行 PCR 反应， 并克隆。 4.根据权利要求 1 所述的一种丹参素的生物生产方法， 其特征在于， 在所述步骤 3 中， 以大肠杆菌 BL21(DE3) 基因组序列中的 T7RNA 聚合酶序列为参考。
10、， 设计 PCR 引物， 以大肠杆 菌 BL21(DE3) 基因组为模板进行 PCR 反应， 得到 T7RNA 聚合酶基因以及其前面包含 LacUV5 启动子和 lacI 基因在内的一部分序列， 并将其克隆。 5.根据权利要求 1 所述的一种丹参素的生物生产方法， 其特征在于， 在所述步骤 4 中， 选择将对羟基苯乙酸间位羟基化酶基因序列 SEQ ID No.1 分别与 D- 乳酸脱氢酶基因序列 权 利 要 求 书 CN 103667371 B 2 2/2 页 3 SEQ ID No.4、 D- 乳酸脱氢酶基因序列的突变基因序列 D-LCH(Y52V)SEQ ID NO.7、 D- 乳酸 脱氢。
11、酶基因序列的突变基因序列D-LCH(Y52A)SEQ ID NO.9构建重组质粒， 将上述重组质粒 分别与利用 T7RNA 聚合酶基因序列 SEQ ID NO.15 构建的辅助质粒转染大肠杆菌。 6.根据权利要求 1 所述的一种丹参素的生物生产方法， 其特征在于， 在所述步骤 4 中， 将对羟基苯乙酸间位羟基化酶基因 hpaBC SEQ ID No.1、 突变基因序列 D-LCH(Y52A)SEQ ID NO.9 嵌入编号为 CGMCC No.7962 的高产酪氨酸大肠杆菌基因组中， 选择将 GAP 启动子、 RBS、 对羟基苯乙酸间位羟基化酶基因 hpaBC SEQ ID No.1、 D- 。
12、乳酸脱氢酶基因序列的突变 基因序列 D-LCH(Y52A)SEQ ID NO.9 和氯霉素基因 Cl SEQ ID NO.19 利用重叠延伸方法构 造 GAP-RBS-hpaBC-RBS-D-LCH-Cl 的串联片段， 用 Red 同源重组方法， 将该串联片段插 入到编号为CGMCC No.7962的高产酪氨酸的大肠杆菌基因组ybhB和ybhC基因中间， 经PCR 和测序筛选得到正确菌株。 7.根据权利要求5所述的一种丹参素的生物生产方法， 其特征在于， 在所述步骤4的转 染大肠杆菌过程中， 以对羟基苯乙酸间位羟基化酶基因序列SEQ ID No.1、 T7RNA聚合酶 基 因序列SEQ ID 。
13、NO.15与D-乳酸脱氢酶基因序列的突变基因序列D-LCH(Y52A)SEQ ID NO.9 转化编号为 CGMCC No.7962 的高产酪氨酸的大肠杆菌得到的工程菌， 取得相对较好的丹参 素产量， 将上述工程菌进行保藏， 保藏信息如下 ： 菌种名称为 SyBE-002444， 保藏中心登记 入册编号为 CGMCC No.7961， 建议的分类命名为大肠埃希氏菌 Escherichia coli。 8.根据权利要求 1 所述的一种丹参素的生物生产方法， 其特征在于， 在所述步骤 5 中， 选择添加前体物对羟基苯丙酮酸和诱导剂异丙基 -D- 硫代吡喃半乳糖苷。 9.一种大肠杆菌， 该菌种在中国。
14、微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏， 保 藏登记号为 CGMCC No.7961， 菌种名称为 SyBE-002444， 建议的分类命名为大肠埃希氏菌 Escherichia coli。 10.如权利要求 9 所述的大肠杆菌在制备丹参素中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103667371 B 3 1/9 页 4 一种丹参素的生物生产方法 技术领域 0001 本发明所属生物医药技术领域， 涉及一种丹参素的生产方法， 特别是丹参素的生 物生产方法。 背景技术 0002 丹参素 （SalvianicacidA,Danshensu） ， 属于酸性芳香类化合物， 其化学名为 -(3,4- 二。
15、羟基苯基） 乳酸， 也称丹参素甲， 分子式为 C9H10O5， 分子量为 198.17。其多为棕 黄色粉末或黄色粉末， 纯品为白色长针状结晶， 熔点 84 86， 密度 1.546。最近的药理药 效研究表明， 丹参素可抑制血小板合成、 聚集及释放 TXA2 等缩血管物质， 提高心肌耐缺氧 能力， 保护心肌， 增加冠脉流量。这些药理作用是丹参注射液治疗冠心病、 心肌缺血的主要 机制。因此丹参素在心脑血管疾病方面具有非常好的功能， 如 ： 抗血栓形成， 抗动脉粥样硬 化及降血脂， 扩张冠状动脉， 保护心肌线粒体免受氧自由基引发的脂质过氧化物的损伤等 作用。 同时一些研究也发现其在抗菌消炎及增强机体。
16、免疫， 防止创面的过度愈合， 治疗肝损 伤， 抗脑缺血损伤， 素抗肿瘤， 治疗银屑病等方面也有较好的作用。如天士力集团出品的复 方丹参滴丸的主要有效成分之一就是丹参素。因此， 丹参素拥有广阔的市场市场和前景。 丹参素属于酸性芳香类化合物， 是丹参水溶提取物的主要活性成分之一。 到目前为止， 从植 物丹参中提取仍是生产丹参素的最主要的方法。 我国目前是丹参素植物提取物的主要生产 国家。传统的提取方法为水提醇沉， 这也是目前制作注射液及口服液的主要提取方法。但 不足之处是乙醇浓度过高， 使原植物中的主要活性丹参素等酚性成分损失较大， 含量不稳 定。近年来出现了一些新的提取技术， 如酶提法、 CO2。
17、超临界萃取法、 微波萃取法、 超声萃取 法等等。 但仍然不能解决植物提取法面临的根本问题， 如植物原料受限和质量不稳定、 生产 能力低、 种植受到季节和地理位置的限制等等。 虽然已有化学全合成丹参素的报道， 但步骤 复杂， 产率低， 环境污染严重。 近年来， 随着合成生物学技术的不断进步， 使用重组微生物生 产丹参素成为备受关注的方法。 但目前为止还没有任何文献报道利用重组微生物合成丹参 素。 发明内容 0003 本发明的技术目的在于克服现有技术的不足， 首次设计并构建了丹参素的生物合 成途径， 并成功突破了丹参素重组微生物合成的瓶颈， 提供了一种全新的丹参素的生物生 产方法， 通过构建重组工。
18、程菌株， 实现丹参素的从葡萄糖或者其他生物质能源为起始的生 物合成， 使生产成本最低化。 0004 本发明的技术目的通过下述技术方案予以实现 ： 0005 一种丹参素的生物生产方法， 按照下述步骤进行 ： 0006 步骤 1， 设计并优化对羟基苯乙酸间位羟基化酶 （hpaB,hpaC） 的基因序列， 并全合 成所述目标基因 ； 0007 在所述步骤 1 中， 依据大肠杆菌 BL21（DE3） 菌株的对羟基苯乙酸间位羟基化酶 说 明 书 CN 103667371 B 4 2/9 页 5 （hpaB,hpaC） 基因序列， 设计引物并克隆， 所述对羟基苯乙酸间位羟基化酶 （hpaB,hpaC） 的。
19、 基因序列如序列表 SEQ ID No.1 所示 0008 步骤 2， 设计并优化 D- 乳酸脱氢酶 （D-LCH） 的基因序列， 并全合成所述目标基因， 并经过位点突变， 获得 D- 乳酸脱氢酶基因序列的突变基因序列 D-LCH（Y52V）和 D-LCH （Y52A） ； 0009 在所述步骤 2 中， 以植物乳杆菌 （Lactobacillusplantarum） ATCC14917 的 D- 乳 酸脱氢酶 （D-LCH） 基因序列作为参考， 设计 PCR 引物， 以植物乳杆菌 CICC21419 的基因组为 模板进行 PCR 反应， 并克隆 ； 所述 D- 乳酸脱氢酶 （D-LCH） 的。
20、基因序列如序列表 SEQ IDNo.4 所示， 其对应的蛋白质序列中第 52 位氨基酸为酪氨酸 （Y， Tyr） ； 所述 D-LCH（Y52V） 的 DNA 序列如序列表 SEQ ID NO.7 所示， 其对应的蛋白序列如序列表 SEQID NO.8 所示， 与序列表 SEQ IDNo.4 编码的蛋白质相比， 在第 52 位氨基酸突变为缬氨酸 （Val） ， 表示为突变基因序 列 D-LCH（Y52V） ； D-LCH（Y52A） 的 DNA 序列如序列表 SEQ IDNO.9 所示， 其对应的蛋白序列 如序列表 SEQ ID NO.10 所示， 与序列表 SEQ ID No.4 编码的蛋白。
21、质相比， 在第 52 位氨基酸 突变为丙氨酸 （Ala） ， 表示为突变基因序列 D-LCH（Y52A） 。 0010 步骤 3， 设计并优化 T7RNA 聚合酶基因序列， 并全合成所述目标基因 ； 0011 在所述步骤 3 中， 以大肠杆菌 BL21（DE3） 基因组序列中的 T7RNA 聚合酶序列为参 考， 设计 PCR 引物， 以大肠杆菌 BL21（DE3） 基因组为模板进行 PCR 反应， 得到 T7RNA 聚合酶 基因以及其前面包含 LacUV5 启动子和 lacI 基因在内的一部分序列， 并将其克隆 ； ， 所述 T7RNA 聚合酶基因序列如序列表 SEQ ID NO.15 所示，。
22、 RNA 聚合酶蛋白序列如序列表 SEQ ID NO.16 所示， 并以此序列构建表达载体。 0012 步骤 4， 将获得的对羟基苯乙酸间位羟基化酶基因序列 SEQ ID No.1、 T7RNA 聚合 酶基因序列 SEQ ID NO.15， 与 D- 乳酸脱氢酶基因序列 SEQ ID No.4、 突变基因序列 D-LCH （Y52V） SEQ ID NO.7、 或者突变基因序列 D-LCH（Y52A） SEQ ID NO.9 之一的序列进行配合 构建表达载体， 并转染大肠杆菌或者嵌入大肠杆菌基因组 0013 在所述步骤 4 中， 选择将对羟基苯乙酸间位羟基化酶基因序列 SEQ ID No.1 。
23、分别 与D-乳酸脱氢酶基因序列SEQ ID No.4、 突变基因序列D-LCH （Y52V） SEQ ID NO.7、 突变基因 序列 D-LCH （Y52A） SEQ ID NO.9 构建重组质粒 （例如 pCDF-hpaBC-D-LCH、 pCDF-hpaBC-D-LCH （Y52V） 、 pCDF-hpaBC-D-LCH（Y52A） ） ， 将上述重组质粒分别与利用 T7RNA 聚合酶基因序列 SEQ ID NO.15 构建的辅助质粒 （例如 pECXK99E-T7） 转染大肠杆菌 ； 所述大肠杆菌菌种名称 为 SyBE-002447， 建议的分类命名为大肠埃希氏菌 Escherichi。
24、acoli， 现于中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心保藏， 保藏中心登记入册编号为 CGMCCNo.7962， 保藏时间 为 2013 年 7 月 22 日， 地址为北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号中国科学院微生物研究所， 邮政编码 100101。 0014 在所述步骤 4 的转染大肠杆菌过程中， 以对羟基苯乙酸间位羟基化酶基因序列 SEQ ID No.1、 T7RNA 聚合酶基因序列 SEQ ID NO.15 与突变基因序列 D-LCH（Y52A） SEQ ID NO.9 转化高产酪氨酸的大肠杆菌 （CGMCC No.7962） 得到的工程菌， 取得相对较好的丹参素 产量， 。
25、将上述工程菌进行保藏， 保藏信息如下 ： 菌种名称为 SyBE-002444， 保藏中心登记入 册编号为CGMCC No.7961， 建议的分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli， 现于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏， 保藏时间为 2013 年 7 月 22 日， 地址为北京 说 明 书 CN 103667371 B 5 3/9 页 6 市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号中国科学院微生物研究所， 邮政编码 100101。 0015 在所述步骤 4 中， 将对羟基苯乙酸间位羟基化酶基因序列 SEQ ID No.1、 突变基因 序列 D-LCH（Y52A） SEQ。
26、 IDNO.9 嵌入高产酪氨酸大肠杆菌 （CGMCC No.7962） 基因组中， 选择 将GAP启动子、 RBS、 hpaBC基因 （对羟基苯乙酸间位羟基化酶基因序列SEQ ID No.1） ,D-LCH 基因 （突变基因序列 D-LCH（Y52A） SEQ ID NO.9） 和氯霉素基因序列 SEQ ID NO.19 利用重 叠延伸方法构造GAP-RBS-hpaBC-RBS-D-LCH的串联片段， 用Red同源重组方法， 将该串 联片段插入到高产酪氨酸的大肠杆菌 （CGMCC No.7962） 基因组 ybhB 和 ybhC 基因中间， 经 PCR 和测序筛选得到正确菌株。 0016 步骤。
27、 5， 利用步骤 4 得到的工程菌进行发酵生产丹参素 ； 0017 在所述步骤5中， 选择添加前体物对羟基苯丙酮酸和诱导剂异丙基-D-硫代吡 喃半乳糖苷 （IPTG） 。 0018 本发明设计的丹参素的生物合成途径属于莽草酸途径， 详细的合成途径如下 ： 以葡萄糖 / 甘油或者其他生物质为碳源， 经莽草酸途径合成对羟基苯丙酮酸。以芒草 酸为底物合成丹参素有两条途径。一 . 对羟基苯丙酮酸在对羟基苯乙酸间位羟基化酶 （hpaB,hpaC） 的催化下合成 3， 4- 二羟基苯丙酮酸， 随后在 D- 乳酸脱氢酶 （D-LCH） 的催化 下合成丹参素 ； 二 . 对羟基苯丙酮酸现在 D- 乳酸脱氢酶 。
28、（D-LCH） 的催化下合成对羟基苯乳 酸， 然后在经过对羟基苯乙酸间位羟基化酶 （hpaB,hpaC） 的催化， 合成丹参素。两条途径虽 然合成的中间产物不一样， 但实际上起催化作用的酶是一样的。本发明提供了一种用生物 发酵生产丹参素的方法， 使用基因工程谷氨酸棒状杆菌和大肠杆菌， 进行发酵生产丹参素， 不需底物添加即可合成丹参素， 实现了丹参素的从头合成。本发明可以解决丹参素的来源 问题， 同时最大限度的降低了生产成本， 有利于工业化生产。 附图说明 0019 图1是本发明使用的丹参素生物合成路线， 其中1为TyrA， 2为D-LCH， 3为hpaB&C。 图 2 是本发明 PCDF-hp。
29、aBC-D-LCH 质粒构建过程。 0020 图 3 是本发明产物验证的 HPLC 图谱， 其中标准品为丹参素标准品 （1g/L） ； 对照为 未加 IPTG 诱导基因基因表达 ； 野生型为 D-LCH 基因未突变的表达载体 ； 1 为 Y52V， 即 D-LCH （Y52V） 突变的表达载体 ； 2 为 Y52A， 即 D-LCH（Y52A） 突变的表达载体。 0021 图 4 是构建工程菌株发酵检测结果。 具体实施方式 0022 下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。各个使用质粒具体信息如 下 ： 质粒 pJET1.2 购自北京全式金生物技术有限公司 （北京市海淀区西小口路 66 。
30、号中关村 东升科技园 B-3 号楼四层） ； 质粒 pCDFDuet-1、 pECXK99E、 pKD46、 pKD3 和 pcp20 购自北京中 原公司 （北京市朝阳区东方东路 11 号） 。 0023 实施例 1 高产 L- 酪氨酸菌株的筛选 0024 以与日本交换所获得的大肠杆菌 BW25113 （由日本国家遗传研究所在 2009 年 2 月 通过赠送或交换获得， 提供者联系方式为矢田1111， 三岛， 静冈县411-8540， 日本） 为出发菌 株， 在 LB 培养基 （10g/lNaCl， 10g/l 蛋白胨， 5g/l 酵母提取物） 中进行 （紫外） 诱变培养， 并 说 明 书 C。
31、N 103667371 B 6 4/9 页 7 分离出候选菌株， 进行发酵检测 L- 酪氨酸产量。 0025 将 50uL 保存的候选菌株转接至含有 5mLpH=7.0 的 LB 培养基 （并加入相应的抗生 素 ： 氨苄青霉素 100ug/ml） 的试管中， 37， 220rmp 培养 12h， 后将 500ul 的过夜培养候选菌 株转接至含有 50mlpH=7.0 的 LB 培养基 （并加入相应的抗生素 ： 氨苄青霉素 100ug/ml） 的 250mL 摇瓶中， 37， 220rmp 培养。当 OD0.6-0.8 时， 加入终浓度为 0.5mM 的 IPTG， 继续培养 3h。 后将菌液离。
32、心， 并重新悬浮于MOPS培养基 （5g/l葡萄糖， 1g/l酵母提取物， K2HPO40.3g/ l， NH4Cl:2.54g/l， MgCl2:0.05g/l， K2SO4:0.05g/l， FeSO4:0.0015g/l， CaCl2:0.05g/l， NaCl:3g/l， MOPS:9.24g/l， 甘氨酸 ： 0.3g/l） 中， IPTG（IPTG ： 异丙基 -D- 硫代吡喃半乳 糖苷， 由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司购买， 地址 ： 北京市昌平区北七家镇北顺工业 园区东沙 384 号） 浓度为 0.5mM， 发酵 24h 后检测酪氨酸产量。 0026 发酵结束后， 取 1m。
33、L 发酵液 12000r/min 离心 5min， 取上清， 用 0.22um 的水系微 孔滤膜过滤后进行 HPLC 检测。色谱条件如下 ： 色谱柱 ： C18（4.6250mm） ； 流动相为 20% 甲醇 -80% 水 -0.1% 甲酸 ； 流速为 1mL/min ； 进样量 20ul ； 紫外检测器， 检测波长为 281nm。 最终获得 702.7mg/l 的酪氨酸， 即高产酪氨酸菌株， 建议的分类命名为大肠埃希氏菌 Escherichia coli， 现于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏， 菌种名称 为 SyBE-002447， 保藏中心登记入册编号为 CGMCC No.。
34、7962， 地址为北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号中国科学院微生物研究所， 邮政编码 100101。 0027 实施例 2 对羟基苯乙酸间位羟基化酶 （hpaB,hpaC） 序列获得和 pCDF-hpaBC 的构 建依据大肠杆菌 BL21（DE3） 菌株的对羟基苯乙酸间位羟基化酶 （hpaB,hpaC） 基因序列， 设 计引物， 并克隆 （即由大肠杆菌 BL21（DE3） 菌株提供对羟基苯乙酸间位羟基化酶的基因序 列） 。由于对羟基苯乙酸间位羟基化酶功能的实现需要 hpaB 和 hpaC 两个基因共同完成， 在 BL21(DE3) 基因组中， hpaB 和 hpaC 基因是相邻的， 故克。
35、隆时是一起克隆下来并表达的。所 述大肠杆菌 BL21（DE3） 由北京全式金生物技术有限公司提供， 北京市海淀区西小口路 66 号中关村东升科技园 B-3 号楼四层。对羟基苯乙酸间位羟基化酶 （hpaB,hpaC） 的基因序列 如序列表 SEQ ID No.1 所示。设计引物如下 ： 0028 hpaBC-U （up） ， 如序列表 SEQ ID NO.2 所示 ： CGCGGATCCGATGAAACCAGAAGATTTCCGCG （下 划 线 部 分 为 BamHI 酶 切 位 点） ； hpaBC-D（down） ， 如 序 列 表 SEQ ID NO.3 所 示 ： CCCAAGCTTA。
36、AATCGCAGCTTCCATTTCC（下划线部分为 HindIII 酶切位点） 0029 使用FASTpfu酶进行PCR， PCR反应条件为 ： 95， 5min， 1个循环 ； 95， 30s， 57， 30s， 72， 1min30s， 共 30 个循环 ； 72， 5min， 1 个循环 ； 4保存。PCR 得到 2000bp 左右的 目标片段。将得到的 PCR 产物进行纯化后用 BamHI 和 HindII 酶进行酶切 ； 连接到同样用 BamHI和HindII进行酶切的pCDFDuet-1载体上， 构建重组质粒pCDF-hpaBC载体， 并转化大 肠杆菌 BL21（DE3） 感受态。
37、 （需要说明的是此处仅仅用于验证基因的表达， 故可使用的大肠 杆菌为一般市售的大肠杆菌即可） 。37复苏完成后涂布链霉素抗性 LB 平板， 37培养 12 小时。然后以引物 hpaBC-U（up， 上段引物） 和 hpaBC-D（down， 下段引物） 进行菌落 PCR 验 证， 筛选阳性克隆， 并将验证得到的阳性克隆株进行测序验证。 0030 实施例 3D- 乳酸脱氢酶 （D-LCH） 序列获得以及 pCDF-hpaBC-D-LCH 表达载体的构 建 0031 以植物乳杆菌 （Lactobacillusplantarum） ATCC14917 的 D-LCH 基因序列作为参 说 明 书 CN。
38、 103667371 B 7 5/9 页 8 考， 设计 PCR 引物， 以植物乳杆菌 CICC21419（在中国普通微生物菌种保藏管理中心购买， 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号） 的基因组为模板进行 PCR 反应， 并克隆至 pJET1.2 载 体上， 送交测序。然后连接的以构建好的 pCDF-hpaBC 载体上， 最终获得的一个表达质粒 pCDF-hpaBC-D-LCH。经测序得到的 D-LCH 基因序列如序列表 SEQIDNO.4 所示， 设计引物如 下 ： 0032 D-LCH-U（up） ， 如序列表 SEQ ID NO.5 所示 ： GGGAATTCCATATGAAAATT。
39、ATTGCCTATGC TGTAC（下划线部分为 NdeI 酶切位点） ； D-LCH-D（down） ， 如序列表 SEQ ID NO.6 所示 ： CGG GGTACCCAGTGATAATCGAGATTAGTCAAACT( 下划线部分为 KpnI 酶切位点 ) 0033 使用FASTpfu酶进行PCR， PCR反应条件为 ： 95， 5min， 1个循环 ； 95， 30s， 58， 30s， 72， 45s， 共30个循环 ； 72， 5min， 1个循环 ； 4保存。 可得到1000bp左右片段。 将得 到的 PCR 产物进行纯化后， 按照 pJET1.2 克隆试剂盒说明， 将 PCR。
40、 片段连接到 pJET1.2 质粒 上得到 pJET1.2-D-LCH， 并转化大肠杆菌 BL21 （DE3） 感受态。37复苏完成后涂布氨苄青霉 素抗性 LB 平板， 37培养 12 小时。然后以引物 D-LCH-U （up， 上段引物） 和 D-LCH-D （down， 下段引物） 进行菌落 PCR 验证， 筛选阳性克隆。并将验证得到的阳性克隆株进行测序验证。 提取测序正确pJET1.2-D-LCH质粒， 用Kpn和Nde酶进行酶切， 回收D-LCH基因片段， 连 接到同样用 Kpn 和 Nde 酶切的 pCDF-hpaBC 质粒上， 构建重组质粒 pCDF-hpaBC-D-LCH， 并转。
41、化大肠杆菌 BL21（DE3） 感受态。37复苏完成后涂布链霉素抗性 LB 平板， 37培养 12 小时。然后以引物 D-LCH-U 和 D-LCH-D 进行菌落 PCR 验证， 筛选阳性克隆。并将验证得 到的阳性克隆株进行测序验证。 0034 实 施 例 4D-LCH 基 因 的 突 变 和 表 达 载 体 pCDF-hpaBC-D-LCH（Y52V）和 pCDF-hpaBC-D-LCH（Y52A） 的构建 0035 依据测序获得的植物乳杆菌 CICC21419（在中国普通微生物菌种保藏管理中心购 买， 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号） 的 D-LCH 的序列设计突变引物， 利用重叠。
42、延伸 PCR 技术， 获得催化活性和底物专一性都得到提高的 D-LCH（Y52V） 和 D-LCH（Y52A） 突变基因。 然后利用实施例 2 中类似的方法连接到 pCDF-hpaBC 上， 获得 CDF-hpaBC-D-LCH（Y52V） 和 pCDF-hpaBC-D-LCH（Y52A） 表达载体。上述实施例 3 中的 D-LCH 基因序列如序列表 SEQ ID NO.4 所示， 其对应的蛋白质序列中第 52 位氨基酸为酪氨酸 （Y， Tyr） ； D-LCH（Y52V） 的 DNA 序列如序列表SEQ ID NO.7所示， 其对应的蛋白序列如序列表SEQIDNO.8所示， 与上述实施 例 。
43、3 的 D-LCH 基因序列 SEQ ID NO.4 对应的蛋白质序列相比， 在第 52 位氨基酸突变为缬氨 酸 （Val） ， 表示为 Y52V ； D-LCH（Y52A） 的 DNA 序列如序列表 SEQ ID NO.9 所示， 其对应的蛋 白序列如序列表 SEQ ID NO.10 所示， 与上述实施例 3 的 D-LCH 基因序列 SEQ ID NO.4 对应 的蛋白质序列相比， 在第 52 位氨基酸突变为丙氨酸 （Ala） ， 表示为 Y52A。设计引物如下 ： 0036 D-LCH-U（up） ， 如序列表 SEQ ID NO.5 所示 ： GGGAATTCCATATGAAAATTA。
44、TTGCCTATG CTGTAC（下划线部分为 NdeI 酶切位点） ； D-LCH-D（down） ， 如序列表 SEQ ID NO.6 所示 ： CG GGGTACCCAGTGATAATCGAGATTAGTCAAACT（下划线部分为 KpnI 酶切位点） ； Y52V-D（down） ， 如 序 列 表 SEQ ID NO.11 所 示 ： TTGTTGGACTACATCGGCACCGTCGAAG ； Y52V-U（up） ， 如 序 列 表 SEQ ID NO.12 所示 ： TgCCgATgTAgTCCAACAAAAggAC ； Y52A-D（down） ， 如序列表 SEQ ID N。
45、O.13 所示 ： TTGTTGGGCTACATCGGCACCGTCGAAG ； Y52A-U （up） ， 如序列表 SEQ ID NO.14 所示 ： TgCCgATgTAgCCCAACAAAAggAC 说 明 书 CN 103667371 B 8 6/9 页 9 0037 以 Y52A 的点突变为例 ： 使用 FASTpfu 酶进行 PCR， 以 D-LCH-U、 Y52A-D 和 Y52A-U、 D-LCH-D 两对引物分别进行 PCR 反应， 以 pCDF-hpaBC-D-LCH 质粒为模板。由于反应条件相 差不大， 故一起做 PCR 反应。PCR 反应条件为 ： 95， 5min，。
46、 1 个循环 ； 95， 40s， 58， 30s， 72， 45s， 共 30 个循环 ； 72， 5min， 1 个循环 ； 4保存。PCR 得到一个 200bp 和一个 800bp 左右的片段。将此 PCR 产物回收后， 以这两个片段为模板， 以 D-LCH-U 和 D-LCH-D 引物进行 第二轮重叠延伸 PCR， 应条件如上。反应结束后将得到一个 1000bp 左右的条带。将此条带 回收后， 按照实施例 2 中类似的方法连接到 pCDF-hpaBC 上， 筛选阳性克隆病测序验证。最 终获得 pCDF-hpaBC-D-LCH（Y52V） 和 pCDF-hpaBC-D-LCH（Y52A）。
47、 两个表达载体。 0038 实施例 5 验证 hpaBC 基因、 D-LCH 基因、 D-LCH(Y52V) 基因、 D-LCH(Y52A) 基因功能 0039 将 实 施 例 3 和 4 中 获 得 pCDF-hpaBC-D-LCH、 pCDF-hpaBC-D-LCH（Y52V）和 pCDF-hpaBC-D-LCH（Y52A） 三个表达载体， 转化大肠杆菌 BL21（DE3） 菌株。然后从转化的 平板中挑取单菌落到 5mlLB 培养基中过夜培养。然后将将 100L 过夜培养的菌液转接进 入含有 50mlLB 培养基 （加入相应的链霉素抗生素 50ug/ml） 的 250ml 摇瓶中， 37，。
48、 220rpm 培养。当菌体 OD600 长至 0.6-0.8 时， 加入终浓度为 0.5mM 的 IPTG， 继续培养 3h， 然后将菌 液离心， 并重新悬浮于50mLM9培养基 （M9培养基配方 ： Na2HPO4 12H2O ： 17.1g/l ； KH2PO4： 3g/ l ； NaCl ： 0.5g/l ； NH4Cl ： 1g/l ； 1mol/lMgSO4： 2mL ； 20% 葡 萄 糖 ： 20mL ； 1mol/lCaCl 2： 0.1mL） 中， 并补充 500mg/L 的前体物 - 对羟基苯丙酮酸和 0.5mM 的 IPTG， 继续培养 24-48h 至发酵 结束。同时。
49、有一瓶菌株， 只加终浓度为 500mg/L 的对羟基苯丙酮酸而两个发酵阶段都不加 0.5mM 的 IPTG 作为对照。 0040 发酵结束后， 取 1mL 发酵液 12000r/min 离心 3 分钟， 取上清， 用 0.22m 的微孔 滤膜过滤后进行 HPLC 检测。色谱条件如下 ： 色谱柱 ： C18（4.6250mm） ； 流动相为 20% 甲醇 -80% 水 -0.1% 甲酸 ； 流速 1mL/min ； 进样量 20L ； 柱温室温 ； 紫外检测器， 检测波长 281nm。 依据液相的检测结果， 通过和标准品保留时间的对照， 确认合成的产物为丹参素， 并 通过峰面积的计算， 最终确认产量为 259mg/l（如附图 3 所示） 。 0041 实施例 6 辅助质粒的构造 0042 以大肠杆菌 BL21（DE3） 基因组序列中的 T7RNA 聚合酶序列为参考， 设计 PCR 引 物， 以大肠杆菌 BL21（DE3）基因组为模板进行 PCR 反应， 得到 T7RNA 聚合酶基因以及其 前面包含 LacUV5 启动子和 lacI 基因在内的一部分序列， 并将其克隆至 pJET1.2 载体上， 送交测序， 然后连接到 pECXK99E 载体上， 最终获得一个表达。