技术领域
本发明涉及生物转化领域，具体涉及利用环糊精及其衍生物或其他助溶剂提高棘 白菌素(Echinocandins)生物转化效率的方法。
背景技术
棘白菌素类抗生素是20世纪70年代发现的一类具有抑制β-1，3-葡聚糖合成酶酶 活性的天然产物，具有很好的抗真菌活性，其基本结构式见式1。由于天然棘白菌素 类化合物具有R2的脂肪酸侧链，在人体具有一定的溶血毒性，因此已经上市的米卡 芬净、阿尼芬净和还在临床研究的aminocandin等抗真菌药物都需要对脂肪酸侧链重 新修饰。而这一修饰的前提是需要将原有脂肪酸侧链脱去，这一过程采用化学法很难 完成，因此一般采用生物转化脱侧链。
式1：棘白菌素化合物基本结构式(R1：-CH3或-H；R2：C16-C18链；R3：-CH3或-H；R4：-OH或-OSO3H；R5：-OSO3H或-H；R6：-OH或-H；R7：CH3或CH2CONH2)
已经报道的脂肽类脱酰基酶(deacylase)均来源于犹他游动放线菌(Actinoplanes utahensis)或者环圈链霉菌(Streptomyces anulatus)，这些脱酰基酶在aculeacin A， daptomycin(LY 146032)，A40926等抗生素脱脂肪酸侧链的反应中得到广泛的应用。 其中作用于aculeacinA的脱酰基酶(US4293482)是最早关于棘白菌素化合物脱酰基 的文献，其使用的微生物为Actinoplanes sp.NRRL 12052，此后多数有关棘白菌素化 合物脱酰基研究都涉及到该微生物。文献报道的转化方法中，早期的研究是直接将底 物添加到发酵体系中转化，这一转化体系的缺点在于稳定性差。此后有研究者将该酶 在链霉菌中表达，制备成游离酶或者固定化酶，然后再建立稳定的转化体系，使得转 化过程更稳定，效率更高。但游离酶的制备和固定化都需要酶的纯化过程，而如果全 细胞能作为有效的催化剂则可以避免这些步骤，简化工艺，降低成本。
文献报道的一些脱酰基方法中，某些棘白菌素的溶解度问题也是多数研究者不可 避免的，以ECB(Echinocandin B)为例，纯度较高的ECB在水溶液中的溶解度就很 低，更不用说低纯度的底物，而在工业生产中多数情况下是需要面对这些低纯度底物。 为了解决这一问题，研究者考虑到添加助溶剂，如早期的研究中，研究者添加乙醇作 为助溶剂到发酵体系中，且浓度必须超过10％才有较好的效果，而溶剂浓度达到一定 程度后会对酶活力产生抑制，降低转化效果。还有研究者用二甲基亚砜(DMSO)作 为溶剂，当DMSO的添加量大于15％时才能达到0.5g/L的底物浓度，全细胞而言， DMSO的存在对细胞的破坏作用非常显著，严重影响转化效果。也有研究者将ECB 固定于树脂上，然后用游离脱酰基酶进行转化，然而对于主要位于细胞内的脱酰基酶 而言显然不实际。
环糊精是从淀粉得到以D-吡喃葡萄糖为单元，以α-1，4-糖苷建连接的具有环状疏 水圆锥型结构的化合物系列，按D-吡喃葡萄糖单元个数不同分为α-环糊精、β-环糊精 和γ-环糊精。由于环糊精的外部亲水而内腔疏水，因而它能够将疏水性化合物结合到 疏水腔，形成包合物而溶解于水溶液中。在α、β、γ-环糊精基础上，对其进行修饰如 酯化、醚化、烷基化、羟基化可以得到多种衍生物。这些基团的引入，可以改变环糊 精某些理化性质和包和能力，在药物包合以及疏水化合物生物转化中得到了广泛应 用。
多数棘白菌素类化合物不溶于水，且分子量较大，如何有效利用环糊精及其衍生 物的特性提高棘白菌素类化合物的生物转化效率是一个值得探索和研究的课题。
本发明将介绍一种利用全细胞作为催化剂，催化棘白菌素类化合物脱酰基的新的 转化体系，该体系利用环糊精包结技术，提高底物溶解性，提高反应速率和产物产率， 同时该体系也对其它有机溶剂添加过程进行了改进。
发明内容
本发明的目的之一是提供了一种棘白菌素的生物转化方法。
本发明所述的棘白菌素生物转化方法包括如下步骤：
(1)微生物细胞培养与酶的制备；
(2)棘白菌素生物转化：将棘白菌素类化合物、缓冲溶液以及助溶剂充分混合， 再加入步骤1)得到的细胞进行转化。
其特征在于步骤2)中的助溶剂为β-环糊精或其衍生物和/或其他有机溶剂或其混合 物，步骤1)所述微生物为放线菌或链霉菌。
上述步骤1中的微生物为放线菌或链霉菌，优选为Actinoplanes utahensis或 Streptomyces anulatus，培养基为蔗糖1-5％，棉籽饼粉2-4％，酵母粉1-4％，K2HPO40.05-0.2％，CaCO3 0.1-0.5％，KCl 0.1-0.4％，MgSO4·7H2O 0.05-0.2％，培养条件 为温度27-32℃、转速200-250r/min，培养时间72-120h。培养结束后，离心收集细胞， 用pH6，0.025M磷酸缓冲充分洗涤2次。
上述步骤2中，可以将棘白菌素类化合物溶解在添加有环糊精及其衍生物或其他 助溶剂缓冲溶液中，加入步骤1得到的细胞，培养24-48h，加入乙酸终止转化。
上述步骤2中的棘白菌素可以为Echinocandin B，aculeacin A，FR901379等具有 相似结构的脂肽类物。
上述步骤2中的环糊精及其衍生物为β-环糊精，二甲基-β-环糊精，羟丙基-β-环 糊精，其添加量与棘白菌素质量比为1∶0.17-1。
上述步骤2中的其他助溶剂可以为甲醇，乙醇或丙酮，优选不为DMSO，其最终 添加浓度为1-5％。
上述步骤2中全细胞脱酰基酶的添加量为0.5-5g干细胞/L，棘白菌素浓度为 0.5-5g/L，转化温度为25-50℃，转化体系pH为5-9，转化缓冲体系中缓冲盐浓度为 0.02-0.2M，缓冲盐可以是磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐和Tris盐(三(羟甲基)氨基甲烷 盐)。
本发明的目的之二是提供了一种全细胞催化剂
全细胞催化剂的培养与制备
菌种转接于新鲜查氏-蛋白胨斜面上，27-32℃培养7-10d，接种铲挑取0.5×1cm 大小菌落接种于25mL/250mL液体培养基中，培养基组成为：葡萄糖1-5％，麦芽糊 精1-3％，棉籽饼粉0.5-2％，酵母粉0.5-2％，蛋白胨0.5-2％，CaCO3 0.1-0.5％， 于27-32℃、200-250r/min条件下培养48-60h，作为发酵种子。
发酵培养基组成为：蔗糖1-5％，棉籽饼粉2-4％，酵母粉1-4％，K2HPO4 0.05 -0.2％，CaCO3 0.1-0.5％，KCl 0.1-0.4％，MgSO49·7H2O 0.05-0.2％，将上述种子 按2-10％接种量(v/v)接种于发酵培养基中，于27-32℃、200-250r/min条件下培养 72-120h。将发酵得到的发酵液离心，收集细胞，然后用pH 6的磷酸缓冲或其他缓冲 液洗涤数次，以除去细胞表面杂质，收集洗涤细胞作为全细胞催化剂，该细胞可冷冻 备用，在某些转化条件下可重复使用。
本发明的另一目的是提供了一种转化体系为添加有环糊精或其衍生物的缓冲体 系，缓冲体系可以是磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐和Tris盐(三(羟甲基)氨基甲烷盐)缓 冲液。环糊精及其衍生物可以为β-环糊精，二甲基-β-环糊精，羟丙基-β-环糊精，通 过改变棘白菌素与添加物质量比，测定溶液中的棘白菌素含量，最终确定环糊精及其 衍生物添加量与棘白菌素质量比为1∶0.17-1。
该体系具体制备过程如下：将环糊精或者其衍生物溶解于冷的或热的缓冲溶液 中，搅拌至充分溶解，将棘白菌素直接或者用少量乙醇、甲醇或丙酮溶解后加入到溶 液中，继续搅拌至棘白菌素完全溶解。
本发明另一种转化体系为添加有助溶剂的磷酸缓冲体系，助溶剂为甲醇，乙醇或 丙酮，其最终添加浓度为1-5％。HPLC测定发现，在这些条件下，棘白菌素溶解度仍 然很低，但在一定条件下仍可以进行转化，并能将底物完全转化。
该体系具体制备过程如下：将棘白菌素溶解于一定体积的甲醇、乙醇或丙酮溶液 中，充分溶解后缓慢加入到磷酸缓冲溶液中，转速1000r/min，搅拌10min。
相对于现有技术，本发明的优点在于：本发明采用全细胞生物催化剂用于棘白菌 素类化合物的生物转化，避免了酶的分离纯化等步骤，该酶在一定条件下还可以重复 使用，能有效降低生产成本。
同时在生物转化的体系中添加有环糊精或其衍生物和/或助溶剂后，底物浓度大 幅提高，范围在0.5-5g/L，转化周期缩短，由对照的48h缩短至24h，转化率均可以 达到90％以上，为棘白菌素类化合物的生物转化提供了新的途径。
附图说明
图1：2g/L ECB在含有不同浓度二甲基-β-环糊精的缓冲液中的溶解度
图2：2g/L ECB在含有不同浓度DMSO的缓冲液中的溶解度
具体实施方式
实施例1：全细胞催化剂的培养与制备
微生物为Actinoplanes utahensis AS 4.1543。
斜面培养基：查氏-蛋白胨琼脂
种子培养基(％)：葡萄糖2，麦芽糊精1，棉籽饼粉0.5，酵母粉1，蛋白胨0.5， CaCO3 0.1。
发酵培养基(％)：蔗糖4，棉籽饼粉3，酵母粉1，K2HPO4 0.1，CaCO3 0.2， KCl 0.2，MgSO4·7H2O 0.1。
培养方式：斜面于28℃培养7-10d，接种铲挑取0.5×1cm大小菌落接种于 25mL/250mL种子培养基中，于28℃、200-250r/min条件下培养48-60h，作为发酵种 子。将上述种子按2-10％接种量(v/v)接种于发酵培养基中，于27-32℃、200-250r/min 条件下培养72-120h。
全细胞催化剂的制备：将发酵得到的发酵液离心，收集细胞，然后用pH 6的磷 酸缓冲或其他缓冲液洗涤数次，以除去细胞表面杂质，收集洗涤细胞作为全细胞催化 剂，细胞可冷冻备用。
实施列2：基本方法同例1
微生物为Streptomyces anulatus CMCC 4.1421。
斜面培养基：查氏-蛋白胨琼脂
种子培养基(％)：葡萄糖1，麦芽糊精1，棉籽饼粉1，酵母粉1，蛋白胨0.5， CaCO3 0.2。
发酵培养基(％)：蔗糖3，棉籽饼粉2，酵母粉2，K2HPO4 0.1，CaCO3 0.2， KCl 0.2，MgSO4·7H2O 0.1。
培养方式：斜面于28℃培养7-10d，接种铲挑取0.5×1cm大小菌落接种于 25mL/250mL种子培养基中，于28℃、200-250r/min条件下培养48-60h，作为发酵种 子。将上述种子按2-10％接种量(v/v)接种于发酵培养基中，于27-32℃、200-250r/min 条件下培养72-120h。
全细胞催化剂的制备：将发酵得到的发酵液离心，收集细胞，然后用pH 6的磷 酸缓冲或其他缓冲液洗涤数次，以除去细胞表面杂质，收集洗涤细胞作为全细胞催化 剂，细胞可冷冻备用。
实施列3：二甲基-β-环糊精体系提高Echinocandin B(ECB)的溶解度
将二甲基-β-环糊精溶解于pH 7浓度0.02M的磷酸缓冲溶液中，充分溶解至溶液 澄清透明，环糊精浓度分别为，0.5g/L，1g/L，2g/L，3g/L，6g/L，9g/L，13.5g/L，18g/L。 将一定2g/L磨成粉末的的ECB分别分散于上述不同浓度的环糊精体系中，磁力搅拌 器1000r/min下搅拌60min使ECB充分溶解。取分散充分的液体，12000r/min，离心 5min，取上清HPLC分析。结果见图1，环糊精与ECB的浓度比在6∶1左右时能将 ECB溶解，也就是说6个环糊精分子可以将1个ECB分子包裹起来以达到溶解的目 的，因此只要提高环糊精的浓度，ECB的浓度也会相应提高。2g/L ECB在不同浓度 DMSO缓冲体系中的溶解度曲线见图2，ECB在缓冲溶液中的溶解度仅仅5mg/L，当 加入适量DMSO后，溶解度会适当增加，但增加幅度并不大，当DMSO含量达到20％ 时，ECB的溶解度突然增加。
实验结果表明，对于大分子量的疏水化合物ECB，二甲基-β-环糊精也能与其形 成包和物，实现ECB的溶解。利用二甲基-β-环糊精作为助溶剂，一方面可以减小溶 剂对全细胞酶的失活作用，另一方面底物浓度可以随着环糊精浓度成比例增加，可有 效增加时空产率。
实施例4：二甲基-β-环糊精体系中Echinocandin B(ECB)的转化方法
将二甲基-β-环糊精溶解于50L pH 6浓度0.2M的醋酸缓冲溶液中，充分溶解至溶 液澄清透明，环糊精浓度分别为12g/L，将一定100g磨成粉末的的ECB分别分散于 上述溶液中，磁力搅拌器1000r/min下搅拌60min使ECB充分溶解。加入相当于5g 干细胞/L浓度的实施例1中所述的全细胞催化剂，于25℃下转化48h后，加入乙酸 调节pH 3终止转化。
取转化液于12000r/min，离心5min，取上清HPLC分析，用ODS C18(8×100mm)， 流动相A：3％乙腈/0.5％NH4H2PO4，流动相B：50％乙腈/0.5％NH4H2PO4，洗脱条件： 5％B+95％A 3min，12min内线性增加B的含量至100％，100％B继续洗脱7min，流 速：1mL/min，检测波长220nm。按ECB的消耗量计算转化率为94.3％。
实施例5：β-环糊精体系中aculeacin A的转化方法
将β-环糊精溶解于50L pH 5浓度0.1M的磷酸缓冲溶液中，充分溶解至溶液澄清 透明，β-环糊精浓度分别为12g/L，将一定100g磨成粉末的的aculeacin A分别分散于 上述溶液中，磁力搅拌器1000r/min下搅拌60min使aculeacin A充分溶解。加入相 当于4g干细胞/L浓度的实施例2中所述的全细胞催化剂，于40℃下转化48h后， 加入乙酸调节pH 3终止转化。
取转化液于12000r/min，离心5min，取上清HPLC分析，(分析方法同实施例4)， 按aculeacin A的消耗量计算转化率为90％。
实施例6：乙醇为助溶剂体系中Echinocandin B的转化方法
将100g ECB溶解于1L无水乙醇中，充分溶解至溶液澄清透明，将该溶液缓慢 倒入49L pH 8浓度0.05M的Tris-HCl缓冲溶液中，充分搅拌。加入相当于3g干细胞 /L浓度的实施例1中所述的全细胞催化剂，于50℃下转化48h后，加入乙酸调节pH 3终止转化。
取转化液于12000r/min，离心5min，取上清HPLC分析(分析方法同实施例4)， 按ECB的消耗量计算转化率为90％。
实施例7：乙醇为助溶剂体系中FR 901379的转化方法
将200g FR 901379溶解于1L无水乙醇中，充分溶解至溶液澄清透明，将该溶液 缓慢倒入49L pH 7浓度0.02M的磷酸缓冲溶液中，充分搅拌。加入相当于2g干细胞 /L浓度的实施例1中所述的全细胞催化剂，于30℃下转化24h后，加入乙酸调节pH 3终止转化。
取转化液于12000r/min，离心5min，取上清HPLC分析(分析方法同实施例4)， 按FR 901379的消耗量计算转化率为97％。
实施例8：甲醇为助溶剂体系中aculeacin A的转化方法
将100g aculeacin A溶解于2L无水甲醇中，充分溶解至溶液澄清透明，将该溶液 缓慢倒入48L pH 5浓度0.05M的柠檬酸缓冲溶液中，充分搅拌。加入相当于1g干细 胞/L浓度的实施例2中所述的全细胞催化剂，于40℃下转化48h后，加入乙酸调节 pH 3终止转化。
取转化液于12000r/min，离心5min，取上清HPLC分析(分析方法同实施例4)， 按aculeacin A的消耗量计算转化率为85％。
实施例9：丙酮为助溶剂体系中Echinocandin B的转化方法
将100g ECB溶解于1.5L无水丙酮中，充分溶解至溶液澄清透明，将该溶液缓慢 倒入48.5L pH 9浓度0.2M的Tris-HCl缓冲溶液中，充分搅拌。加入相当于1g干细 胞/L浓度的实施例1中所述的全细胞催化剂，于35℃下转化48h后，加入乙酸调节 pH 3终止转化。
取转化液于12000r/min，离心5min，取上清HPLC分析(分析方法同实施例4)， 按ECB的消耗量计算转化率为87％。
实施例10：环糊精与甲醇混合体系中Echinocandin B的转化方法
将环糊精溶解于50L pH 6浓度0.2M的醋酸缓冲溶液中，充分溶解至溶液澄清透 明，环糊精浓度分别为12g/L。将100g ECB溶解于0.5L无水乙醇中，充分溶解至溶 液澄清透明，将该溶液倒入上述环糊精溶液中，充分搅拌。加入相当于0.5g干细胞/L 浓度的实施例1中所述的全细胞催化剂，于35℃下转化48h后，加入乙酸调节pH 3 终止转化。
取转化液于12000r/min，离心5min，取上清HPLC分析(分析方法同实施例4)， 按ECB的消耗量计算转化率为80％。
实施例11：环糊精体系与DMSO体系中全细胞催化剂的重复使用对比
将实施4中转化结束的转化液离心，收集体系中的细胞，然后用pH 6的磷酸缓 冲或其他缓冲液洗涤数次，以除去细胞表面杂质。将上述洗涤后的细胞重新添加到实 例4中所述的环糊精体系中，继续转化48h，取上清检测转化率。细胞重新收集，洗 涤并用于下一批次的转化。DMSO体系操作方法与环糊精体系相同，DMSO浓度为 20％，结果见表1，环糊精体系下细胞重复使用5次仍然保持60％的转化率，而以 20％DMSO助溶剂的对照体系细胞在重复使用第二次时转化率就降低至45％。
本实验结果表明，以环糊精为助溶剂的转化体系，对全细胞酶的失活作用小，能 有效增加细胞使用批次，减少生产成本。
表1：环糊精与DMSO体系中细胞水解ECB的重复使用批次