技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及基于磁珠法从植物叶片中 提取基因组DNA的试剂盒及其提取方法。
背景技术
随着分子生物学和生物医学的不断发展，基因组DNA成为了一个重要 的研究课题，基因组DNA对生物的生长、遗传、变异等生命过程起着控制 作用。对基因组DNA的研究，首先涉及到基因组DNA的提取。
对于植物来说，提取基因组DNA的主要步骤是：破壁、破膜、去除杂 质、漂洗和洗脱。首先，在提取的过程当中使用SDS或者CTAB等去污试 剂可以破坏细胞膜，使细胞内的蛋白质沉淀下来，从而将细胞内的基因组 DNA释放；其次，利用高盐沉淀的方法或者氯仿酚抽提的方法去除蛋白质、 多酚和多糖等杂质；然后，在提取的上清中加入适量体积的乙醇、异丙醇 和PEG等溶剂，使得基因组DNA吸附在硅胶柱、硅胶磁珠和玻璃珠离子 交换柱等介质上；再加入漂洗液进行漂洗，最后是加入洗脱液将基因组DNA 从介质上洗脱下来。
目前，市面上核酸纯化普遍使用的吸附介质是硅胶柱，硅胶柱采取的 固体介质为纤维状的硅胶膜，主要成分都是二氧化硅。基本原理为：核酸 在高盐，低温，低PH或者合适浓度的乙醇和异丙醇的情况下(不能低于 4.0)能够选择性地与硅胶柱或者磁珠结合，而在高温，低盐，高PH的情 况下，能够从硅胶柱上或者磁珠被洗脱下来。大部分情况下，核酸与硅胶 柱的结合需要加入一定量的乙醇或者异丙醇，片段越小，加入的量越大， 吸附率不高。
植物基因组DNA的提取方法一般有CTAB法、SDS法和高盐法。
CTAB法有很好的去污效果，因为CTAB是一种去污剂，在加热的情 况下，能有效的裂解植物细胞，同时CTAB还可以和糖类进行结合，并通 过离心作用将多糖去除。CTAB法也被应用于多种植物基因组DNA的提取， 但是目前通用的CTAB法试剂盒使用起来操作繁琐，而且，一般会与氯仿 酚等有毒的有机溶液配合使用。
SDS法是基因组DNA提取的传统方法，不但用于植物基因组DNA的 提取，也用于其他组织DNA的提取，比如细胞，动物组织，血液。SDS 是一种阴离子表面活性剂，在加热的情况下，可以裂解研磨过后的植物细 胞，并且SDS还可以与K离子反应，产生白色絮状物质，这种物质可以与 蛋白结合，通过离心一起沉淀。但是SDS法也有一定的缺陷，在裂解和离 开的过程当中消耗的时间较长。
提供一种现有技术中的植物基因组DNA的提取方法-CTAB法，其包 括如下步骤：
步骤1、取新鲜植物叶片(不超过100mg)或者干燥组织(不超过50 mg)，放于研钵，加入液氮研磨充分；
步骤2、研磨后材料全部转移到2mL离心管，加入，加入500μL CTAB裂解液(100mmol/L Tris-HCl，pH8.0；50mmol/L EDTA，pH8.0；1.0 mol/L NaCl；2％CTAB；2％PVP40)和20μLβ-巯基乙醇，瞬时涡旋后置 于60℃水浴锅中，水浴30min(干燥组织可酌情延长时间)；
步骤3、加入600μL氯仿/异戊醇(24∶1)，漩涡振荡混匀，并在 12,000rpm下离心10min；
步骤4、小心吸取300μL上清至一新的2mL离心管中，避免吸起沉 淀，加入混合液300μL无水乙醇和20μL磁珠溶液，充分涡旋混匀；
步骤5、室温静置5min，离心管上磁力架，静置1min；
步骤6、吸去上清，加入70％乙醇，离心管下磁力架，充分涡旋混匀， 静置1min，离心管上磁力架；
步骤7、重复操作步骤6一次；
步骤8、离心管置于磁力架上风干10min；
步骤9、加入100-150μL预热(65℃)洗脱液。离心管下磁力架，充 分涡旋混匀，在65℃水中进行水浴5min；
步骤10、离心管置于磁力架上，静置2min；
步骤11、小心将上清吸出，备用。
该技术方案仍然存在一些缺点：
1、通用性不强。对于提取水稻，小麦等普通植物的基因组DNA效果 良好，但是对于提取棉花，葡萄，黑加仑这些多糖、多酚、单宁、脂质等 次生代谢物含量丰富的植物叶片组织的基因组DNA的时候，其纯化成功率 较低，无法彻底去除多酚，多酚类物质。多酚在提取的过程中会有氧化而 产生褐变，多糖等物质与基因组DNA结合后会产生粘稠的胶状物，这2种 情况都容易造成基因组DNA降解，导致提取的基因组DNA纯度不高。
2、裂解液在裂解研磨后的叶片组织，需要在60℃水浴加热30min， 同时需要离心时间10min，这些步骤消耗的时间过多。
3、提取棉花等次生代谢物含量丰富的植物叶片组织的基因组DNA 时，需要加入有害的有机溶剂氯仿等，对于操作人员的健康不利，同时产 生的废液也会造成污染。
发明内容
本发明的目的是要提供一种可以适用于棉花，葡萄，黑加仑等植物的 基于磁珠法从植物叶片中提取基因组DNA的试剂盒及其提取方法。
根据本发明的一个方面，提供的基于磁珠法从植物叶片中提取基因组 DNA的试剂盒，其包括：预处理溶液，快速裂解液，DNA结合液、磁珠 悬浮液和洗脱液，
预处理溶液：0.05M～0.2M Tris-Hcl、0.01～0.05M EDTA(乙二胺四乙 酸)、体积比为1％～3％的巯基乙醇、质量/体积比为0.5％～2％的PVP(聚 乙烯吡咯烷酮)，
快速裂解液：50～100mmol/L KAC(醋酸钾)，PH＝5.2、10～50mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)、4～6M GHCL(盐酸胍)、5～25mM sodium citrate (柠檬酸钠)、1％～5％Tween 20(聚氧乙烯去水山梨醇单月桂酸酯)，
DNA结合液：质量/体积比为5％～10％的PEGS000(聚乙二醇8000)、 1.5-4M GITC(异硫氰酸胍)，0.5-1M NaCl，
磁珠悬浮液：磁珠溶于超纯水中，其中磁珠的浓度为50-100mg/mL，
洗脱液：1～10mM Tris-HCl、1-2mM EDTA(乙二胺四乙酸)，pH＝8.0。
其有益效果是，预处理溶液可以有效的破解细胞壁和细胞膜，但是不 能破坏细胞核，由于基因组DNA位于细胞核内，而多糖、多酚、单宁等则 存在于细胞质中，由于多糖、多酚、单宁会溶于预处理溶液内，所以通过 预处理溶液可以有效的去除多糖、多酚、单宁等杂质对于基因组DNA提取 的干扰。
裂解液以盐酸胍和Tween 20为主要成分，常温条件下能够在2min内 充分裂解植物细胞，并且后续的离心步骤只要2min即可，大大节约了操作 时间。盐酸胍为强变性剂，其裂解细胞的效果远好于CTAB和SDS。
采用2倍体积的5％PEG，4M GITC和0.5M NaCl溶液代替无水乙醇 作为DNA结合液，效果更好，得率更高。
而且，本发明采用的技术方案当中，不需要加入有机溶剂氯仿等，不 会对操作人员产生危害，安全可靠。
在一些实施方式中，磁珠的颗粒直径为100-200nm，磁珠表面包被硅 羟基。
其有益效果是，通过磁珠对基因组DNA产生吸附作用，从而实现对基 因组DNA的提取操作，由于纳米级别的磁珠外表面为一层二氧化硅，由于 磁珠颗粒小，比表面积大，磁珠法的得率一般都要高于硅胶柱式法，更为 重要的是，磁珠方更容易实行自动化和高通量。
根据本发明的另一方面，提供的基于磁珠法从植物叶片中提取基因组 DNA的试剂盒的提取方法，其包括：
步骤一、取植物叶片放于研钵内研磨充分，研磨时间为1-2min；
步骤二、若所取植物叶片为棉花，黑加仑，草莓，葡萄等多糖、多酚、 单宁、脂质含量丰富类的植物叶片，加入500μL预处理液，若所取植物 为水稻，小麦或者玉米类简单植物叶片，则直接进入步骤三；
步骤三、加入500μL快速裂解液；
步骤四、在8,000-12,000rpm下离心1-3min；
步骤五、小心吸取400μL上清至一新的2mL离心管中，避免吸起沉 淀，加入混合液400-1000μL DNA结合液和10-50μL磁珠悬浮液，充分 涡旋混匀；
步骤六、在18-25℃下静置5-10min后，将离心管置于磁力架上，静 置1-3min；
步骤七、吸去上清，加入体积比为70％的乙醇，将离心管从磁力架上 取下，充分涡旋混匀后静置1-3min，再将离心管置于磁力架上；
步骤八、将离心管置于磁力架上风干5-15min；
步骤九、加入100-150μL预热65℃的DNA结合液，将离心管从磁 力架上取下，充分涡旋混匀，并在55-80℃水中水浴2-8min；
步骤十、将离心管置于磁力架上，静置1-2min；
步骤十一、小心将上清吸出，备用。
其有益效果是，本发明的提取方法尤其适用于棉花，葡萄，黑加仑这 些多糖、多酚、单宁、脂质等次生代谢物含量丰富的植物叶片组织的基因 组DNA提取。
在一些实施方式中，在步骤一中，
若所取植物叶片为新鲜植物叶，则取量不超过100mg，
若所取植物叶片为干燥组织，则取量不超过50mg，。
其有益效果是，因为新鲜植物叶中含水份较多，所以取量稍大些，而 干燥组织的含水量较少，所以取量可以稍小些。
在一些实施方式中，在步骤一中，在研钵内加入液氮后再进行研磨。
其有益效果是，利用液氮创造一个低温环境，一方面，低温可以抑制 核酸酶的活性，使得基因组DNA免受核酸酶的侵袭，另一方面，低温可以 使物体的脆性增强，从而更便于研磨，而且研磨时也更省力。
在一些实施方式中，在步骤七与步骤八之间还包括一步骤，吸去上清， 加入体积比为70％乙醇，将离心管从磁力架上取下，充分涡旋混匀后静置 1-3min，再将离心管置于磁力架上。
其有益效果是，通过两次同样的重复操作，使得提取的基因组DNA的 纯度更加的高。
附图说明
图1是本发明的试剂盒及其提取方法提取的基因组DNA的琼脂糖电泳 对比图；其中M道为标记泳道，1，2泳道为实验1-1中CTAB方法提取的棉 花新鲜嫩叶基因组DNA条带，3，4泳道为实验1-1中采用本发明提取的棉 花新鲜嫩叶基因组DNA条带，5，6泳道为实验1-2中CTAB方法提取的棉 花老叶基因组DNA条带，7，8泳道为实验1-2中采用本发明提取的棉花老 叶基因组DNA条带。
图2是本发明的试剂盒及其提取方法提取的基因组DNA的又一琼脂糖 电泳对比图；其中，1，2泳道为实验2中采用CTAB方法提取的水稻叶片基 因组DNA条带；3，4泳道为实验2中采用本发明提取的水稻叶片基因组DNA 条带。
具体实施方式
下面结合具体的实施例来进一步的阐述本发明，应当理解，这些实施 例仅用于解释说明本发明，可以有不同形式的等效替换，本实施例不能限 制本发明的保护范围。
1、试剂盒
一种基于磁珠法从植物叶片中提取基因组DNA的试剂盒，其包括：预 处理溶液，快速裂解液，DNA结合液、磁珠悬浮液和洗脱液，
预处理溶液包括：0.2M tris-HCL、0.05M EDTA、体积比为2％的巯基 乙醇和质量/体积比为2％的PVP，
快速裂解液包括：100mmol/L KAC，PH＝5.2、50mmol/L EDTA、6M GHCl、5mM sodium citrate、2％Tween 20，
DNA结合液包括：5％PEG8000、4M GITC，0.5M NaCl，
磁珠悬浮液包括：磁珠溶于超纯水中，其中磁珠的浓度为50mg/mL， 磁珠的颗粒直径为100-200nm，磁珠表面包被硅羟基，
洗脱液包括：5mM Tris-HCl、1M EDTA，pH＝8.0。
其中tris-HCL采用加拿大生物技术公司(BBI)的BB0079，EDTA采 用美国西格玛公司(Sigma)的E6758，PVP采用加拿大生物技术公司(BBI) 的#PB0436，KAC采用加拿大生物技术公司(BBI)的PB0438，GHCL采 用美国西格玛公司(Sigma)的#G3272，sodium citrate采用美国西格玛公司 (Sigma)的#C8532，Tween 20采用美国西格玛公司(Sigma)的#P9416， PEG8000采用加拿大生物技术公司(BBI)的#PB0433，GITC采用美国西 格玛公司(Sigma)的#G9277，NaCl采用加拿大生物技术公司(BBI)的 ST1218。
2、基因组DNA提取方法
采用该试剂盒从植物当中提取基因组DNA的方法，其步骤包括：
步骤一、取植物叶片放于研钵内，并加入液氮研磨充分，研磨时间为 2min；
步骤二、若所取植物叶片为棉花，黑加仑，草莓，葡萄等多糖、多酚、 单宁、脂质含量丰富类的植物叶片，加入500μL预处理液，若所取植物 为水稻，小麦或者玉米类简单植物叶片，则直接进入步骤三；
步骤三、加入500μL快速裂解液；
步骤四、在12,000rpm下离心2min；
步骤五、小心吸取400μL上清至一新的2mL离心管中，在吸取的时 候避免吸起沉淀，加入混合液800μL DNA结合液和20μL磁珠悬浮液， 充分涡旋混匀；
步骤六、在20℃下静置5min后，将离心管置于磁力架上，静置1min；
步骤七、吸去上清，加入70％乙醇，将离心管从磁力架上取下，充分 涡旋混匀后静置1min，再将离心管置于磁力架上；
步骤八、重复步骤七的全部操作一次
步骤九、将离心管置于磁力架上风干10min；
步骤十、加入150μL预热65℃的DNA洗脱液，将离心管从磁力架 上取下，充分涡旋混匀，并在65℃水中水浴5min；
步骤十一、将离心管置于磁力架上，静置2min；
步骤十二、小心将上清吸出，备用。
3、结果对比分析
将本发明技术方案的实验结果与现有技术的CTAB方法的实验结果进 行对比分析。
实验1-1
选用100mg棉花新鲜嫩叶进行基因组DNA的提取。同时采用本发明 的提取方法与现有技术的CTAB方法同时进行。最后均用150μL洗脱液
实验结果的数据对比如表所示：
实验结果的图像对比如图1所示(2％琼脂糖胶电泳，)。
实验结论：本发明提取方法的提取效果要明显好于现有技术的CTAB 方法。
实验1-2
选用50mg棉花老叶进行基因组DNA的提取。同时采用本发明的提取 方法与现有技术的CTAB方法同时进行。最后均用150μL洗脱液洗脱。
实验结果的数据对比如表所示：
实验结果的图像对比如图1所示。
实验结论：现有技术的CTAB方法基因组DNA提取的量很少，纯度也 很低，而本发明的提取方法仍然能够提取到较多的基因组DNA，而且纯度 也比CTAB方法高很多。
实验2
选用100mg水稻新鲜叶片进行基因组DNA的提取。同时采用本发明 的提取方法与现有技术的CTAB方法同时进行。最后均用150μL洗脱液洗 脱。
实验结果的数据对比如表所示：
实验结果的图像对比如图2所示。
实验结论：对于水稻等植物，两种方法的效果差别不大，但是在时间 上，本发明所需要的时间比现有技术的CTAB方法要少的多。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域普 通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若 干相似的变形和改进，这些也应视为本发明的保护范围之内。