基于磁珠法从植物叶片中提取基因组DNA的试剂盒及其提取方法.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102618532 A (43)申请公布日 2012.08.01 CN 102618532 A *CN102618532A* (21)申请号 201210131323.5 (22)申请日 2012.05.02 C12N 15/10(2006.01) (71)申请人 易春 地址 201100 上海市闵行区水清路 332 号 申请人 姬云 李凯 李宗飞 (72)发明人 李宗飞 (54) 发明名称 基于磁珠法从植物叶片中提取基因组 DNA 的 试剂盒及其提取方法 (57) 摘要 本发明属于分子生物学技术领域， 尤其涉及 基于磁珠法从植物叶片中提取基因组 DNA 的试剂 盒及

2、其提取方法， 基于磁珠法从植物叶片中提取 基因组 DNA 的试剂盒， 其包括 ： 预处理溶液， 快速 裂解液， DNA 结合液、 磁珠悬浮液和洗脱液， 通过 预处理溶液可以有效的破解细胞壁和细胞膜， 通 过预处理溶液可以有效的去除多糖、 多酚、 单宁等 杂质对于基因组 DNA 提取的干扰。快速裂解液以 盐酸胍和 Tween 20 为主要成分， 常温条件下能够 在 2min 内充分裂解植物细胞， 并且后续的离心步 骤只要 2min 即可， 大大节约了操作时间。盐酸胍 为强变性剂， 其裂解细胞的效果好， 而且， 本发明 中不需要加入有机溶剂氯仿等， 不会对操作人员 产生危害， 安全可靠。 (51)

3、Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 基于磁珠法从植物叶片中提取基因组 DNA 的试剂盒， 其包括 ： 预处理溶液， 快速裂解 液， DNA 结合液、 磁珠悬浮液和洗脱液， 预处理溶液 ： 0.05M0.2M Tris-Hcl、 0.010.05M EDTA(乙二胺四乙酸)、 13 巯基乙醇、 0.5 2 PVP( 聚乙烯吡咯烷酮 )， 快速裂解液 ： 50 100mmol/L KAC( 醋酸钾 )， PH 5.2、 10 50mmol

4、/LEDTA( 乙二胺 四乙酸 )、 4 6M GHCL( 盐酸胍 )、 5 25mM sodium citrate( 柠檬酸钠 )、 1 5 Tween 20( 聚氧乙烯去水山梨醇单月桂酸酯 )， DNA结合液 ： 510PEG8000(聚乙二醇8000)、 1.5-4M GITC(异硫氰酸胍)， 0.5-1M NaCl， 磁珠悬浮液 ： 磁珠溶于超纯水中， 其中磁珠的浓度为 50-100mg/mL， 洗脱液 ： 1 10mM Tris-HCl、 1-2mM EDTA( 乙二胺四乙酸 )， pH 8.0。 2.根据权利要求1所述的基于磁珠法从植物叶片中提取基因组DNA的试剂盒， 其中， 磁

5、珠的颗粒直径为 100-200nm， 磁珠表面包被硅羟基。 3.权利要求1或2所述的基于磁珠法从植物叶片中提取基因组DNA的试剂盒的提取方 法， 其包括 ： 步骤一、 取植物叶片放于研钵内研磨充分， 研磨时间为 1-2min ； 步骤二、 若所取植物叶片为多糖、 多酚、 单宁、 脂质含量丰富类的植物叶片， 加入 500L 预处理液， 若所取植物为水稻， 小麦或者玉米类简单植物叶片， 则直接进入步骤三 ； 步骤三、 加入 500L 快速裂解液 ； 步骤四、 在 8,000-12,000rpm 下离心 1-3min ； 步骤五、 小心吸取 400L 上清至一新的 2mL 离心管中， 避免吸起沉淀，

6、 加入混合液 400-1000L DNA 结合液和 10-50L 磁珠悬浮液， 充分涡旋混匀 ； 步骤六、 在 18-25下静置 5-10min 后， 将离心管置于磁力架上， 静置 1-3min ； 步骤七、 吸去上清， 加入体积比为 70的乙醇， 将离心管从磁力架上取下， 充分涡旋混 匀后静置 1-3min， 再将离心管置于磁力架上 ； 步骤八、 将离心管置于磁力架上风干 5-15min ； 步骤九、 加入100-150L预热65的DNA结合液， 将离心管从磁力架上取下， 充分涡旋 混匀， 并在 55-80水中水浴 2-8min ； 步骤十、 将离心管置于磁力架上， 静置 1-2min ；

7、步骤十一、 小心将上清吸出， 备用。 4.根据权利要求3所述的基于磁珠法从植物叶片中提取基因组DNA的提取方法， 其中 ： 步骤一中， 若所取植物叶片为新鲜植物叶， 则取量不超过 100mg， 若所取植物叶片为干燥组织， 则取量不超过 50mg。 5.根据权利要求4所述的基于磁珠法从植物叶片中提取基因组DNA的提取方法， 其中， 步骤一中， 在研钵内加入液氮后再进行研磨。 6.根据权利要求3或4或5所述的基于磁珠法从植物叶片中提取基因组DNA的提取方 法， 其中， 步骤七与步骤八之间还包括一步骤， 吸去上清， 加入体积比为 70的乙醇， 将离心 管从磁力架上取下， 充分涡旋混匀后静置 1-3m

8、in， 再将离心管置于磁力架上。 权 利 要 求 书 CN 102618532 A 2 1/6 页 3 基于磁珠法从植物叶片中提取基因组 DNA 的试剂盒及其提 取方法 技术领域 0001 本发明属于分子生物学技术领域， 尤其涉及基于磁珠法从植物叶片中提取基因组 DNA 的试剂盒及其提取方法。 背景技术 0002 随着分子生物学和生物医学的不断发展， 基因组 DNA 成为了一个重要的研究课 题， 基因组 DNA 对生物的生长、 遗传、 变异等生命过程起着控制作用。对基因组 DNA 的研究， 首先涉及到基因组 DNA 的提取。 0003 对于植物来说， 提取基因组 DNA 的主要步骤是 ： 破壁

9、、 破膜、 去除杂质、 漂洗和洗 脱。首先， 在提取的过程当中使用 SDS 或者 CTAB 等去污试剂可以破坏细胞膜， 使细胞内的 蛋白质沉淀下来， 从而将细胞内的基因组 DNA 释放 ； 其次， 利用高盐沉淀的方法或者氯仿酚 抽提的方法去除蛋白质、 多酚和多糖等杂质 ； 然后， 在提取的上清中加入适量体积的乙醇、 异丙醇和PEG等溶剂， 使得基因组DNA吸附在硅胶柱、 硅胶磁珠和玻璃珠离子交换柱等介质 上 ； 再加入漂洗液进行漂洗， 最后是加入洗脱液将基因组 DNA 从介质上洗脱下来。 0004 目前， 市面上核酸纯化普遍使用的吸附介质是硅胶柱， 硅胶柱采取的固体介质为 纤维状的硅胶膜， 主

10、要成分都是二氧化硅。基本原理为 ： 核酸在高盐， 低温， 低 PH 或者合适 浓度的乙醇和异丙醇的情况下(不能低于4.0)能够选择性地与硅胶柱或者磁珠结合， 而在 高温， 低盐， 高 PH 的情况下， 能够从硅胶柱上或者磁珠被洗脱下来。大部分情况下， 核酸与 硅胶柱的结合需要加入一定量的乙醇或者异丙醇， 片段越小， 加入的量越大， 吸附率不高。 0005 植物基因组 DNA 的提取方法一般有 CTAB 法、 SDS 法和高盐法。 0006 CTAB 法有很好的去污效果， 因为 CTAB 是一种去污剂， 在加热的情况下， 能有效的 裂解植物细胞， 同时 CTAB 还可以和糖类进行结合， 并通过离

11、心作用将多糖去除。CTAB 法也 被应用于多种植物基因组 DNA 的提取， 但是目前通用的 CTAB 法试剂盒使用起来操作繁琐， 而且， 一般会与氯仿酚等有毒的有机溶液配合使用。 0007 SDS 法是基因组 DNA 提取的传统方法， 不但用于植物基因组 DNA 的提取， 也用于其 他组织 DNA 的提取， 比如细胞， 动物组织， 血液。SDS 是一种阴离子表面活性剂， 在加热的情 况下， 可以裂解研磨过后的植物细胞， 并且SDS还可以与K离子反应， 产生白色絮状物质， 这 种物质可以与蛋白结合， 通过离心一起沉淀。但是 SDS 法也有一定的缺陷， 在裂解和离开的 过程当中消耗的时间较长。 0

12、008 提供一种现有技术中的植物基因组 DNA 的提取方法 -CTAB 法， 其包括如下步骤 ： 0009 步骤1、 取新鲜植物叶片(不超过100mg)或者干燥组织(不超过50mg)， 放于研钵， 加入液氮研磨充分 ； 0010 步骤 2、 研磨后材料全部转移到 2mL 离心管， 加入， 加入 500LCTAB 裂解液 (100mmol/L Tris-HCl， pH8.0 ； 50mmol/L EDTA， pH8.0 ； 1.0mol/L NaCl ； 2 CTAB ； 2 PVP40) 和 20L- 巯基乙醇， 瞬时涡旋后置于 60水浴锅中， 水浴 30min( 干燥组织可酌 说 明 书 C

13、N 102618532 A 3 2/6 页 4 情延长时间 ) ； 0011 步骤 3、 加入 600L 氯仿 / 异戊醇 (24 1)， 漩涡振荡混匀， 并在 12,000rpm 下离 心 10min ； 0012 步骤 4、 小心吸取 300L 上清至一新的 2mL 离心管中， 避免吸起沉淀， 加入混合液 300L 无水乙醇和 20L 磁珠溶液， 充分涡旋混匀 ； 0013 步骤 5、 室温静置 5min， 离心管上磁力架， 静置 1min ； 0014 步骤 6、 吸去上清， 加入 70乙醇， 离心管下磁力架， 充分涡旋混匀， 静置 1min， 离 心管上磁力架 ； 0015 步骤 7、

14、 重复操作步骤 6 一次 ； 0016 步骤 8、 离心管置于磁力架上风干 10min ； 0017 步骤 9、 加入 100-150L 预热 (65 ) 洗脱液。离心管下磁力架， 充分涡旋混匀， 在 65水中进行水浴 5min ； 0018 步骤 10、 离心管置于磁力架上， 静置 2min ； 0019 步骤 11、 小心将上清吸出， 备用。 0020 该技术方案仍然存在一些缺点 ： 0021 1、 通用性不强。对于提取水稻， 小麦等普通植物的基因组 DNA 效果良好， 但是对于 提取棉花， 葡萄， 黑加仑这些多糖、 多酚、 单宁、 脂质等次生代谢物含量丰富的植物叶片组织 的基因组 DNA

15、 的时候， 其纯化成功率较低， 无法彻底去除多酚， 多酚类物质。多酚在提取的 过程中会有氧化而产生褐变， 多糖等物质与基因组DNA结合后会产生粘稠的胶状物， 这2种 情况都容易造成基因组 DNA 降解， 导致提取的基因组 DNA 纯度不高。 0022 2、 裂解液在裂解研磨后的叶片组织， 需要在 60水浴加热 30min， 同时需要离心 时间 10min， 这些步骤消耗的时间过多。 0023 3、 提取棉花等次生代谢物含量丰富的植物叶片组织的基因组 DNA 时， 需要加入有 害的有机溶剂氯仿等， 对于操作人员的健康不利， 同时产生的废液也会造成污染。 发明内容 0024 本发明的目的是要提供一

16、种可以适用于棉花， 葡萄， 黑加仑等植物的基于磁珠法 从植物叶片中提取基因组 DNA 的试剂盒及其提取方法。 0025 根据本发明的一个方面， 提供的基于磁珠法从植物叶片中提取基因组 DNA 的试剂 盒， 其包括 ： 预处理溶液， 快速裂解液， DNA 结合液、 磁珠悬浮液和洗脱液， 0026 预处理溶液 ： 0.05M0.2M Tris-Hcl、 0.010.05M EDTA(乙二胺四乙酸)、 体积 比为 1 3的巯基乙醇、 质量 / 体积比为 0.5 2的 PVP( 聚乙烯吡咯烷酮 )， 0027 快速裂解液 ： 50 100mmol/L KAC( 醋酸钾 )， PH 5.2、 10 50

17、mmol/LEDTA( 乙 二胺四乙酸 )、 4 6M GHCL( 盐酸胍 )、 5 25mM sodium citrate( 柠檬酸钠 )、 1 5 Tween 20( 聚氧乙烯去水山梨醇单月桂酸酯 )， 0028 DNA 结合液 ： 质量 / 体积比为 5 10的 PEGS000( 聚乙二醇 8000)、 1.5-4M GITC( 异硫氰酸胍 )， 0.5-1M NaCl， 0029 磁珠悬浮液 ： 磁珠溶于超纯水中， 其中磁珠的浓度为 50-100mg/mL， 0030 洗脱液 ： 1 10mM Tris-HCl、 1-2mM EDTA( 乙二胺四乙酸 )， pH 8.0。 说 明 书

18、CN 102618532 A 4 3/6 页 5 0031 其有益效果是， 预处理溶液可以有效的破解细胞壁和细胞膜， 但是不能破坏细胞 核， 由于基因组 DNA 位于细胞核内， 而多糖、 多酚、 单宁等则存在于细胞质中， 由于多糖、 多 酚、 单宁会溶于预处理溶液内， 所以通过预处理溶液可以有效的去除多糖、 多酚、 单宁等杂 质对于基因组 DNA 提取的干扰。 0032 裂解液以盐酸胍和 Tween 20 为主要成分， 常温条件下能够在 2min 内充分裂解植 物细胞， 并且后续的离心步骤只要 2min 即可， 大大节约了操作时间。盐酸胍为强变性剂， 其 裂解细胞的效果远好于 CTAB 和 S

19、DS。 0033 采用 2 倍体积的 5 PEG， 4M GITC 和 0.5M NaCl 溶液代替无水乙醇作为 DNA 结合 液， 效果更好， 得率更高。 0034 而且， 本发明采用的技术方案当中， 不需要加入有机溶剂氯仿等， 不会对操作人员 产生危害， 安全可靠。 0035 在一些实施方式中， 磁珠的颗粒直径为 100-200nm， 磁珠表面包被硅羟基。 0036 其有益效果是， 通过磁珠对基因组DNA产生吸附作用， 从而实现对基因组DNA的提 取操作， 由于纳米级别的磁珠外表面为一层二氧化硅， 由于磁珠颗粒小， 比表面积大， 磁珠 法的得率一般都要高于硅胶柱式法， 更为重要的是， 磁珠

20、方更容易实行自动化和高通量。 0037 根据本发明的另一方面， 提供的基于磁珠法从植物叶片中提取基因组 DNA 的试剂 盒的提取方法， 其包括 ： 0038 步骤一、 取植物叶片放于研钵内研磨充分， 研磨时间为 1-2min ； 0039 步骤二、 若所取植物叶片为棉花， 黑加仑， 草莓， 葡萄等多糖、 多酚、 单宁、 脂质含量 丰富类的植物叶片， 加入 500L 预处理液， 若所取植物为水稻， 小麦或者玉米类简单植物 叶片， 则直接进入步骤三 ； 0040 步骤三、 加入 500L 快速裂解液 ； 0041 步骤四、 在 8,000-12,000rpm 下离心 1-3min ； 0042 步

21、骤五、 小心吸取400L上清至一新的2mL离心管中， 避免吸起沉淀， 加入混合液 400-1000L DNA 结合液和 10-50L 磁珠悬浮液， 充分涡旋混匀 ； 0043 步骤六、 在 18-25下静置 5-10min 后， 将离心管置于磁力架上， 静置 1-3min ； 0044 步骤七、 吸去上清， 加入体积比为 70的乙醇， 将离心管从磁力架上取下， 充分涡 旋混匀后静置 1-3min， 再将离心管置于磁力架上 ； 0045 步骤八、 将离心管置于磁力架上风干 5-15min ； 0046 步骤九、 加入100-150L预热65的DNA结合液， 将离心管从磁力架上取下， 充分 涡旋混

22、匀， 并在 55-80水中水浴 2-8min ； 0047 步骤十、 将离心管置于磁力架上， 静置 1-2min ； 0048 步骤十一、 小心将上清吸出， 备用。 0049 其有益效果是， 本发明的提取方法尤其适用于棉花， 葡萄， 黑加仑这些多糖、 多酚、 单宁、 脂质等次生代谢物含量丰富的植物叶片组织的基因组 DNA 提取。 0050 在一些实施方式中， 在步骤一中， 0051 若所取植物叶片为新鲜植物叶， 则取量不超过 100mg， 0052 若所取植物叶片为干燥组织， 则取量不超过 50mg， 。 0053 其有益效果是， 因为新鲜植物叶中含水份较多， 所以取量稍大些， 而干燥组织的含

23、 说 明 书 CN 102618532 A 5 4/6 页 6 水量较少， 所以取量可以稍小些。 0054 在一些实施方式中， 在步骤一中， 在研钵内加入液氮后再进行研磨。 0055 其有益效果是， 利用液氮创造一个低温环境， 一方面， 低温可以抑制核酸酶的活 性， 使得基因组 DNA 免受核酸酶的侵袭， 另一方面， 低温可以使物体的脆性增强， 从而更便 于研磨， 而且研磨时也更省力。 0056 在一些实施方式中， 在步骤七与步骤八之间还包括一步骤， 吸去上清， 加入体积比 为 70乙醇， 将离心管从磁力架上取下， 充分涡旋混匀后静置 1-3min， 再将离心管置于磁 力架上。 0057 其有

24、益效果是， 通过两次同样的重复操作， 使得提取的基因组 DNA 的纯度更加的 高。 附图说明 0058 图 1 是本发明的试剂盒及其提取方法提取的基因组 DNA 的琼脂糖电泳对比图 ； 其 中M道为标记泳道， 1， 2泳道为实验1-1中CTAB方法提取的棉花新鲜嫩叶基因组DNA条带， 3， 4 泳道为实验 1-1 中采用本发明提取的棉花新鲜嫩叶基因组 DNA 条带， 5， 6 泳道为实验 1-2 中 CTAB 方法提取的棉花老叶基因组 DNA 条带， 7， 8 泳道为实验 1-2 中采用本发明提取 的棉花老叶基因组 DNA 条带。 0059 图 2 是本发明的试剂盒及其提取方法提取的基因组 D

25、NA 的又一琼脂糖电泳对比 图 ； 其中， 1， 2 泳道为实验 2 中采用 CTAB 方法提取的水稻叶片基因组 DNA 条带 ； 3， 4 泳道为 实验 2 中采用本发明提取的水稻叶片基因组 DNA 条带。 具体实施方式 0060 下面结合具体的实施例来进一步的阐述本发明， 应当理解， 这些实施例仅用于解 释说明本发明， 可以有不同形式的等效替换， 本实施例不能限制本发明的保护范围。 0061 1、 试剂盒 0062 一种基于磁珠法从植物叶片中提取基因组 DNA 的试剂盒， 其包括 ： 预处理溶液， 快 速裂解液， DNA 结合液、 磁珠悬浮液和洗脱液， 0063 预处理溶液包括 ： 0.2

26、M tris-HCL、 0.05M EDTA、 体积比为 2的巯基乙醇和质量 / 体积比为 2的 PVP， 0064 快速裂解液包括 ： 100mmol/L KAC， PH 5.2、 50mmol/L EDTA、 6MGHCl、 5mM sodium citrate、 2 Tween 20， 0065 DNA 结合液包括 ： 5 PEG8000、 4M GITC， 0.5M NaCl， 0066 磁珠悬浮液包括 ： 磁珠溶于超纯水中， 其中磁珠的浓度为 50mg/mL， 磁珠的颗粒直 径为 100-200nm， 磁珠表面包被硅羟基， 0067 洗脱液包括 ： 5mM Tris-HCl、 1M

27、EDTA， pH 8.0。 0068 其中 tris-HCL 采用加拿大生物技术公司 (BBI) 的 BB0079， EDTA 采用美国西格 玛公司 (Sigma) 的 E6758， PVP 采用加拿大生物技术公司 (BBI) 的 #PB0436， KAC 采用加拿 大生物技术公司 (BBI) 的 PB0438， GHCL 采用美国西格玛公司 (Sigma) 的 #G3272， sodium citrate 采用美国西格玛公司 (Sigma) 的 #C8532， Tween 20 采用美国西格玛公司 (Sigma) 说 明 书 CN 102618532 A 6 5/6 页 7 的 #P9416

28、， PEG8000 采用加拿大生物技术公司 (BBI) 的 #PB0433， GITC 采用美国西格玛公司 (Sigma) 的 #G9277， NaCl 采用加拿大生物技术公司 (BBI) 的 ST1218。 0069 2、 基因组 DNA 提取方法 0070 采用该试剂盒从植物当中提取基因组 DNA 的方法， 其步骤包括 ： 0071 步骤一、 取植物叶片放于研钵内， 并加入液氮研磨充分， 研磨时间为 2min ； 0072 步骤二、 若所取植物叶片为棉花， 黑加仑， 草莓， 葡萄等多糖、 多酚、 单宁、 脂质含量 丰富类的植物叶片， 加入 500L 预处理液， 若所取植物为水稻， 小麦或者

29、玉米类简单植物 叶片， 则直接进入步骤三 ； 0073 步骤三、 加入 500L 快速裂解液 ； 0074 步骤四、 在 12,000rpm 下离心 2min ； 0075 步骤五、 小心吸取 400L 上清至一新的 2mL 离心管中， 在吸取的时候避免吸起沉 淀， 加入混合液 800L DNA 结合液和 20L 磁珠悬浮液， 充分涡旋混匀 ； 0076 步骤六、 在 20下静置 5min 后， 将离心管置于磁力架上， 静置 1min ； 0077 步骤七、 吸去上清， 加入 70乙醇， 将离心管从磁力架上取下， 充分涡旋混匀后静 置 1min， 再将离心管置于磁力架上 ； 0078 步骤八、

30、 重复步骤七的全部操作一次 0079 步骤九、 将离心管置于磁力架上风干 10min ； 0080 步骤十、 加入150L预热65的DNA洗脱液， 将离心管从磁力架上取下， 充分涡旋 混匀， 并在 65水中水浴 5min ； 0081 步骤十一、 将离心管置于磁力架上， 静置 2min ； 0082 步骤十二、 小心将上清吸出， 备用。 0083 3、 结果对比分析 0084 将本发明技术方案的实验结果与现有技术的 CTAB 方法的实验结果进行对比分 析。 0085 实验 1-1 0086 选用 100mg 棉花新鲜嫩叶进行基因组 DNA 的提取。同时采用本发明的提取方法与 现有技术的 CTA

31、B 方法同时进行。最后均用 150L 洗脱液 0087 实验结果的数据对比如表所示 ： 0088 0089 实验结果的图像对比如图 1 所示 (2琼脂糖胶电泳， )。 0090 实验结论 ： 本发明提取方法的提取效果要明显好于现有技术的 CTAB 方法。 0091 实验 1-2 说 明 书 CN 102618532 A 7 6/6 页 8 0092 选用 50mg 棉花老叶进行基因组 DNA 的提取。同时采用本发明的提取方法与现有 技术的 CTAB 方法同时进行。最后均用 150L 洗脱液洗脱。 0093 实验结果的数据对比如表所示 ： 0094 0095 实验结果的图像对比如图 1 所示。

32、0096 实验结论 ： 现有技术的CTAB方法基因组DNA提取的量很少， 纯度也很低， 而本发明 的提取方法仍然能够提取到较多的基因组 DNA， 而且纯度也比 CTAB 方法高很多。 0097 实验 2 0098 选用 100mg 水稻新鲜叶片进行基因组 DNA 的提取。同时采用本发明的提取方法与 现有技术的 CTAB 方法同时进行。最后均用 150L 洗脱液洗脱。 0099 实验结果的数据对比如表所示 ： 0100 0101 实验结果的图像对比如图 2 所示。 0102 实验结论 ： 对于水稻等植物， 两种方法的效果差别不大， 但是在时间上， 本发明所 需要的时间比现有技术的 CTAB 方法要少的多。 0103 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本领域普通技术人员来说， 在不脱离本发明创造构思的前提下， 还可以做出若干相似的变形和改进， 这些也应视为本 发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 102618532 A 8 1/1 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102618532 A 9