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1、(10)申请公布号 CN 102618499 A (43)申请公布日 2012.08.01 CN 102618499 A *CN102618499A* (21)申请号 201210052961.8 (22)申请日 2012.03.02 CGMCC No.5321 2011.09.29 C12N 5/09(2010.01) C12Q 1/02(2006.01) A01K 67/027(2006.01) (71)申请人 北京市神经外科研究所 地址 100050 北京市东城区天坛西里 6 号 (72)发明人 万虹 张俊廷 冯洁 历俊华 吴震 王亮 孙异临 郝淑煜 李德志 (74)专利代理机构 北京正。
2、理专利代理有限公司 11257 代理人 李超 (54) 发明名称 脊索瘤细胞株及其用途 (57) 摘要 本发明公开了一株脊索瘤细胞株及其用途， 属于肿瘤生物学领域。人脊索瘤细胞系 (BHC2)， 保藏号为 CGMCC NO ： 5321。该细胞系从颅底脑脊 索瘤患者手术切除的脊索瘤组织中分离培养获 得， 在体外传代培养超过 14 代。该细胞具有脊索 来源细胞的生物学特性 ： 光学显微镜下呈条索状 排列的空泡细胞， 透射电子显微镜下胞浆中存在 大量的空泡结构， 表达多种脊索来源细胞的标志 蛋 白 Brachyury、 S100、 Galectin-3、 Fascin-1。 该细胞具有染色体为异倍。
3、体核型的肿瘤特性 ； 细 胞周期各时相的百分率分别为 G1 期 51.3、 S 期 23.6、 G2-M期25、 G2/G12， 表现出肿瘤细胞 增殖特征 ； 细胞注入裸鼠体内后有成瘤能力。由 于其在体外可长期培养并保持细胞特性不变， 是 研制靶向脊索瘤肿瘤药物的有力工具。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 4 页 1/1 页 2 1. 人脊索瘤细胞系 (BHC2)， 其特征在于 ： 所述细胞系在中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微。
4、生物中心的保藏号为 CGMCC NO ： 5321。 2. 根据权利要求 1 所述的人脊索瘤细胞系， 其特征在于所述细胞系的生物学特性为 ： 细胞呈长梭型， 贴壁生长， 胞浆存在大量空泡。 3. 根据权利要求 1 所述的人脊索瘤细胞系， 其特征在于 ： 所述细胞系有 Brachyury、 S100、 Galectin-3、 Fascin-1 多种脊索来源细胞特异性标志蛋白的表达。 4. 根据权利要求 1 所述的人脊索瘤细胞系， 其特征在于 ： 所述细胞系的染色体为异倍 体核型。 5. 根据权利要求 1 所述的人脊索瘤细胞系， 其特征在于， 该细胞周期各时相的细胞百 分率分别 G1 期 51.3。
5、、 S 期 23.6、 G2-M 期 25、 G2/G1 2， 表现出肿瘤细胞增殖特性。 6. 权利要求 1 所述的人脊索瘤细胞系 (BHC2) 的用途， 其特征在于 ： 用于制备肿瘤诊断 试剂。 7. 权利要求 1 所述的人脊索瘤细胞系 (BHC2) 的用途， 其特征在于 ： 用于筛选和 / 或制 备抗肿瘤药物。 8. 权利要求 1 所述的人脊索瘤细胞系 (BHC2) 的用途， 其特征在于 ： 用于制备肿瘤动物 模型。 9. 权利要求 1 所述的人脊索瘤细胞系 (BHC2) 的用途， 其特征在于 ： 用于开发肿瘤药物 靶点。 10. 权利要求 1 所述的人脊索瘤细胞系 (BHC2) 的用途，。
6、 其特征在于 ： 用于肿瘤的体外 研究。 权 利 要 求 书 CN 102618499 A 2 1/5 页 3 脊索瘤细胞株及其用途 技术领域 0001 本发明涉及脊索瘤细胞株及其用途， 属于肿瘤生物学领域， 更具体地， 涉及一种人 脑脊索瘤细胞系 (BHC2) 的建立及其用途。 背景技术 0002 脊索瘤来源于脊索胚胎残余组织产生的原发性骨性肿瘤， 是一种少见的慢性进展 的恶性肿瘤， 占全部原发恶性肿瘤的 3 4， 居原发性恶性骨肿瘤第 4 位。有约 1/3 起 源于颅底部， 其余可起源于脊柱、 骶尾部或中线以外的位置。该肿瘤发展缓慢且具有恶性 肿瘤的生长方式， 常生长于斜坡骨质， 部位深在。
7、， 且常呈广泛性生长， 部分还有分隔， 并毗邻 重要的血管和神经， 彻底切除非常困难， 而且该肿瘤对放、 化疗不敏感， 因此颅底脊索瘤治 疗极其困难， 复发率高且预后相对较差， 中位生存期约为 6 年， 10 年生存率仅为 40， 大约 50-70的患者无治而终， 对患者及其家庭乃至社会都造成一定程度的危害。因此， 开发更 为有效的肿瘤治疗方案和治疗药物是非常重要的。 0003 脊索瘤从组织形态学将其分为普通型脊索瘤、 软骨样脊索瘤和低分化型脊索瘤。 光镜下呈条索状排列的空泡细胞。脊索瘤的确诊依赖免疫组织化学染色。目前常用的 标志蛋白有 S-100、 上皮细胞膜抗原 (Epithelial M。
8、embrane Antigen， EMA)、 细胞角蛋白 (Cytokeratin， CK) 以及 vmientin 蛋白。Vujovic 等人对胚胎脊索组织、 53 例脊索瘤及其 它 323 例肿瘤组织 ( 包括 163 例软骨肿瘤 ) 进行了 Brachyury 蛋白的免疫组化研究， 发现 胚胎脊索组织和所有脊索瘤细胞均 Brachyury 蛋白 (+)， 而所有其它肿瘤及正常组织均为 (-)。这个研究表明脊索瘤组织中的软骨样细胞和脊索样细胞都是来源于脊索细胞， 所以 Brachyury 蛋白可作为鉴别脊索组织及脊索组织来源的肿瘤特异性标志物。Schwab 等人 比较了 6 例经典脊索瘤和。
9、 14 例原发脊索肉瘤， 发现 Brachury 和 CD24 只在脊索瘤中表达。 Brachury 是新近发现的一种脊索瘤相关分子标志物， 其它的生物标志蛋白还有癌胚抗原 (Carcino Embryonic Antigen， CEA)、 半乳糖苷酶结合蛋白 (Galenctin-3)、 Fascin-1、 生长 因子类(Growth factors， GFs)、 基质金属蛋白酶类(Matrix Metalloproteinase， MMPs)等。 0004 脊索瘤细胞系是研究肿瘤生物学特性的重要工具， 并且是研究抗肿瘤药物的有用 工具。将来的治疗策略应该是靶向清除脊索瘤细胞， 从而获得对肿。
10、瘤的有效治疗。开发靶 向药物首先需要一个性质稳定的脊索瘤细胞系， 以此脊索瘤细胞系为基础才可能研发出特 异性靶向脊索瘤的药物， 但目前这种细胞系国内尚未见报道。 发明内容 0005 本发明要解决的第一个技术问题是提供一株能够在体外长期传代培养的、 性质稳 定的脊索瘤细胞系 (BHC2)。 0006 为实现上述目的， 本发明采用以下技术方案 ： 0007 人脑脊索瘤细胞系 (BHC2)， 其特征在于 ： 所述细胞系在中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心的保藏号为 CGMCC NO ： 5321。 说 明 书 CN 102618499 A 3 2/5 页 4 0008 所述的人脊索瘤细胞系。
11、， 生物学特性为 ： 细胞呈长梭型， 贴壁生长， 胞浆存在大量 空泡。 0009 所述的人脊索瘤细胞系， 有 Brachyury、 S100、 Galectin-3、 Fascin-1 多种脊索来 源细胞特异性标志蛋白的表达。 0010 所述细胞系的染色体为异倍体核型。 0011 所述的人脊索瘤细胞系， 该细胞周期各时相的细胞百分率分别 G1 期 51.3、 S 期 23.6、 G2-M 期 25、 G2/G1 2， 表现出肿瘤细胞增殖特性。 0012 本发明提供一种人脊索瘤细胞系， 该人脊索瘤细胞系 HBC2 已于 2011 年 9 月 29 日 保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物。
12、中心 ( 其简称为 CGMCC)， 其保藏编号为 CGMCC No.5321， 建议的分类名为 ： 人脊索瘤细胞。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路 1 号 院 3 号， 中国科学院微生物研究所， 邮政编码 100101。 0013 本发明所述的人脑脊索瘤细胞系 HBC2 是发明人从颅底脑脊索瘤患者的肿瘤组织 中分离培养获得， 该细胞通过细胞因子依赖法和反复贴壁法筛选纯化后获得增殖能力很强 的 HBC2 细胞， 在体外经过超过 14 次的传代培养， 细胞仍保持脊索肿瘤特性。该细胞具有脊 索细胞的超微结构， 并表达多种脊索来源组织的标志蛋白， 同时也具有肿瘤特性和成瘤能 力。 0014 通过光学显微。
13、镜和电子显微镜方法证实， 本发明所述的人脊索瘤细胞系在胞浆中 存在特征性空泡结构。 0015 通过免疫组织化学方法证实， 本发明所述的人脊索瘤细胞系表达多种脊索来源组 织的标志蛋白 Brachyury、 S100、 Galectin-3、 Fascin-1。 0016 通过流式细胞术方法证实， 本发明所述的人脊索瘤细胞系细胞周期各时相的细胞 百分率 ： G1 期 51.3、 S 期 23.6、 G2-M 期 25、 G2/G1 2。 0017 本发明所述的人脊索瘤细胞系染色体呈多倍体核型， 而且接种 BALB/C 免疫缺陷 鼠后具有成瘤能力。 0018 本发明所要解决的另一个技术问题是提供人脊。
14、索瘤细胞系在制备或筛选靶向肿 瘤细胞药物中的应用。 将本发明所述的人脊索瘤细胞系用于研发靶向脊索瘤的药物， 例如， 制备并筛选出HBC2特异抗体， 通过体外实验挑选出具有抑制和杀伤HBC2细胞的抗体， 可以 将此抗体作为抗脊索瘤药物的主要成份 ； 或挑选出特异识别 HBC2 的抗体并作为靶向工具， 制备抗脊索瘤的靶向药物。 0019 人脊索瘤细胞系 (BHC2) 的用途， 包括但不限于以下用途 ： 0020 用于制备肿瘤诊断试剂。 0021 用于筛选和 / 或制备抗肿瘤药物。 0022 用于制备肿瘤动物模型。 0023 用于开发肿瘤药物靶点。 0024 用于肿瘤的体外研究。 0025 本发明所。
15、述的人脊索瘤细胞系主要优势在于 ： 0026 1. 本发明所述的人脊索瘤细胞系既具有胞浆空泡结构， 表达多种脊索来源组织的 标志蛋白 ； 同时也具有染色体呈多倍体核型、 细胞周期中 S 期细胞百分率大于 14和成瘤 能力的肿瘤细胞特性。 说 明 书 CN 102618499 A 4 3/5 页 5 0027 2. 本发明所述的人脊索瘤细胞系可以体外传代培养 14 代而保持脊索瘤性质不 变， 适合作为研发脊索瘤相关药物的细胞材料。 0028 以下通过附图和具体实施例详细说明本发明技术方案， 并不以此限定本发明的实 施范围。 附图说明 0029 图 1 为病人病理诊断 ： 细胞片状样排列， 核圆形。
16、或椭圆形， 胞质略透明， 含大量皂 泡样结构 (HE， 200) 0030 图 2 为培养第 14 代的 HBC2. 细胞呈多角形， 有长短不等的突起 ； 胞核圆形， 位 于中央， 见明显的核仁， 偶见双核 ； 胞浆内见大量大小不等的空泡和黑色颗粒 ( 相差显微 镜， 400) 0031 图 3 为透射电镜检测 HBC2 超微结构 . 胞膜表面大量微绒毛， 胞核形态不规则， 核 膜凹陷， 核仁大、 明显， 胞浆内大量低电子密度的粘液空泡 (6000) 0032 图 4 为免疫组织化学染色检测 HBC2S100、 Galectin-3、 Fascin-1、 Brachyury 标志蛋白的表达 .。
17、 阳性细胞为胞浆中充满致密的棕褐色颗粒， S100 蛋白表达呈强阳性， Galectin-3 蛋白表达呈弱阳性， Fascin-1 蛋白中等表达， Brachyury 蛋白表达呈强阳性 (DAB， 200) 0033 图 5 为 HBC2 染色体核型分析 . 染色体为 84 条异倍染色体核型 ( 油镜， 1000) 0034 图 6 为流式细胞术分析 HBC2 细胞周期 0035 图 7 为 HBC2 体内成瘤实验 .1.8107个细胞注射到裸鼠腋下皮下， 第 4 周时见裸 鼠腋下有 2 厘米大小的肿瘤 具体实施方式 0036 实施例 1 ： 人脊索瘤细胞系的建立 0037 HBC2 原代培养。
18、 ： 本发明所述细胞系是从手术病人颅底脑脊索瘤组织分离培养获 得。肿瘤组织取自首都医科大学附属北京天坛医院神经外科中心的一位患者手术标本， 病理诊断为脑脊索瘤， 显微镜下细胞片状样排列， 核圆形或椭圆形， 胞质略透明， 含大量皂 泡样结构 ( 图 1)。具体方法如下 ： 无菌超净台内用含破红液的 Hank s(1 1) 将组织 块洗 2 次， 去除血管和坏死组织， 用组织剪将组织块剪成约 1mm3大小， 加入 3ml 0.04 EDTA/0.5胰蛋白酶， 37水浴消化 10 分钟， 显微镜下观察， 待消化成单细胞后， 加入 300ul 胎牛血清终止消化。用 200 目的金属筛网过滤， 去除未消。
19、化的组织。过滤后的细胞 悬液在无血清 DMEM 溶液中通过离心 (800rpm/ 分， 10 分钟 ) 洗涤 2 次， 收集离心管底部的 沉淀细胞， 将细胞悬浮于含有生长因子的培养液 ( 培养液的配制 ： 90 NeurocultNS-A Basal Medium(Human)， 10 Neurocult NS-A proliferation supplement(Human)， 终浓度 为 10ng/ml 的碱性成纤维细胞生长因子 (basic Fibroblast Growth Factor， bFGF)， 终浓 度为 20ng/ml 的表皮生长因子 (Epidermal Growth F。
20、actor， EGF) 中， 接种于 T25 培养瓶内， 置于 37、 5 CO2培养箱中培养。 0038 细胞纯化 ： 细胞培养 24h 后弃悬浮细胞， 贴壁细胞换含 20胎牛血清的 DMEM/F12 继续培养， 待细胞生长接近 90汇合时， Hank s 洗 2 次， 加入 0.4ml 0.04 EDTA/0.5胰 说 明 书 CN 102618499 A 5 4/5 页 6 蛋白酶消化3分钟， 加上述培养液吹打分瓶， 37培养30分钟， 收集悬浮细胞， 弃贴壁细胞， 悬浮细胞 37培养 30 分钟， 待细胞再次贴壁后， 收集悬浮细胞， 弃贴壁细胞， 悬浮细胞再 37培养 30 分钟， 通。
21、过反复贴壁法， 最终去除成纤维细胞。 0039 传代培养 ： 纯化后的细胞生长达 90汇合时， 加入 0.4ml 0.04 EDTA/0.5胰蛋 白酶消化 2 分钟， 加上述培养液吹打、 分瓶， 37、 5 CO2培养箱中传代培养。重复上述过 程， 直至传 14 代， 行以下各项检测。 0040 相差显微镜下第 14 代 HBC2 细胞生长特性 ： 细胞呈多角形， 有长短不等的突起 ； 胞核圆形， 位于中央， 见明显的核仁， 偶见双核 ； 胞浆内见大量大小不等的空泡和黑色颗粒 ( 图 2)。 0041 实施例 2 ： 透射电子显微镜观察细胞的超微结构 0042 HBC2 细胞传代培养 14 代。
22、时， 待细胞生长达 90汇合时， 弃培养液， 加入 3ml 0.1M PBS(PH7.4)， 用橡皮细胞刮刮取细胞， 收集细胞， 离心 (800rpm/ 分， 10 分钟 )， 弃上清， 戊二 醛/四氧化锇前固定2小时， 0.1M PBS(PH7.4)洗3次， 10分钟/次。 然后行标本的后固定、 脱水、 浸透、 包埋、 切超薄切片和重金属染色 ( 北京市神经外科研究所电镜室完成 )。 0043 透射电镜观察 HBC2 超微结构， 可见胞膜表面大量微绒毛， 胞核形态不规则， 核膜 凹陷， 核仁大、 明显， 胞浆内大量低电子密度的粘液空泡 ( 图 3)。 0044 实施例 3 ： 免疫组织化学染。
23、色检测脊索组织来源的标志蛋白 0045 HBC2 细胞传代培养 14 代时， 待细胞生长达 90汇合后， 用 Hank s 洗 2 次。加 入 3ml 0.04 EDTA/0.5胰蛋白酶消化约 2 分钟， 加 2ml 含血清培养基终止反应， 离心 (800rpm/ 分， 10 分钟 ) 洗涤 1 次， 收集离心管底部的沉淀细胞。将细胞重悬于 5ml 含 20 血清的 DMEM/F12 培养液中， 接种于铺有盖玻片的培养皿中培养， 待细胞生长 90汇合后 弃培养液， 0.1M PBS(PH7.4) 洗 3 次， 加入冷丙酮 4固定 10 分钟， 0.1M PBS(PH7.4) 洗 3 次， 5 。
24、分钟 / 次， 3过氧化氢室温 10 分钟 ( 消除内源性过氧化物酶 )。0.1MPBS (PH7.4) 洗 3 次， 5 分钟 / 次， 封闭液 (1羊血清， 0.5血清白蛋白， 0.1 TritonX-100， 0.1MPBS) 封闭 30 分钟， 37， 弃封闭液， 加 Brachyury、 S100、 Galectin-3 和 Fascin-1 单克隆抗体 (1 100 稀释 )， 4过夜， 对照培养皿加 0.1M PBS(PH7.4)。次日用含 Tween-20 的 PBS 洗 3 次， 分别加 1 滴鼠 Polymer Helper( 即用型 )(S100、 Galectin-3、。
25、 Fascin-1) 和 1 滴兔 Polymer Helper( 即用型 )(Brachyury)37孵育 30 分钟， 用含 Tween-20 的 PBS 洗 3 次， 分 别加 Poly-HRP anti-mouse IgG(S100、 Galectin-3、 Fascin-1) 和 Poly-HRP anti-rabbit IgG(Brachyury)37孵育 30 分钟， 用含 Tween-20 的 PBS 洗 3 次， DAB 显色， 自来水冲洗， 苏 木素复染， 脱水、 透明、 封片。 0046 显微镜下观察， 阳性细胞的特点为胞浆中充满致密的棕褐色颗粒， S100 蛋白表达 呈。
26、强阳性， Galectin-3 蛋白表达呈弱阳性， Fascin-1 蛋白中等表达， Brachyury 蛋白表达呈 强阳性 ( 图 4)。 0047 实施例 4 ： HBC2 细胞的肿瘤特性分析 0048 (1) 染色体核型分析 ： HBC2 细胞传代培养 14 代时， 待细胞生长达 90汇合后， 换 液并加入终浓度为 0.5ug/ml 的秋水仙素工作液使细胞停止在分裂中期， 4h 后收获细胞， KCl(0.075M) 低渗处理 30 分钟， 37， 新鲜配置的甲醇冰醋酸 (3 1) 预固定细胞 30 分 钟， 离心 (800rpm/ 分， 10 分钟 ) 弃上清， 再加新鲜配置的甲醇冰醋酸。
27、 (3 1) 固定细胞 说 明 书 CN 102618499 A 6 5/5 页 7 30 分钟， 离心 (800rpm/ 分， 10 分钟 ) 弃上清， 留 300ul 固定液吹打、 滴片， 80烤片 2 小时， 吉姆萨染色。显微镜 (Nikon 80i 型， 日本 ) 和 PCI 图像采集系统采集图像， 行染色体核型 分析。 0049 油镜下观察并染色体计数， 见染色体为异倍体核型， 84 条染色体 ( 图 5)。 0050 (2)流式细胞术检测细胞周期 ： HBC2细胞传代培养14代时， 取对数生长期细胞， 弃 培养液， 胰酶消化细胞， 加培养液， 离心 (800rpm/ 分， 14 分。
28、钟 )， 去上清。PBS 洗 2 次， 0.5ml PBS 吹打， 用 5ml 注射器吸取细胞， 然后用力打入 5ml 70 ( 预冷 ) 乙醇中， 封口膜封口， 4固定过夜。离心 (800rpm/ 分， 14 分钟 )， 收集固定细胞， PBS 洗 2 次， 0.4ml PBS 重悬细 胞并轻轻吹打 ( 防止细胞破碎 )。加 RNase-A 约 3l( 终浓度为 50g/ml)， 37水浴消化 30 分钟， 加 50l PI( 终浓度为 65g/ml)， 冰浴中避光染色 30 分钟， 300 目 ( 孔径 40 50 微米 ) 尼龙网过滤， 上机检测 ( 图 6)。 0051 HBC2 细胞。
29、周期各时相的细胞百分率为 ： G1 期 51.3、 S 期 23.6、 G2-M 期 25、 G2/G1 2。 0052 (3) 成瘤能力检测 ： 为了检测细胞的成瘤能力， 将 1.8107个 HBC2 细胞接种于 NOD/SCID裸鼠腋下皮下， 接种后每天观察肿瘤的生长情况， 记录成瘤潜伏期和肿瘤大小。 结 果发现在第 10 天时裸鼠腋下有肿瘤出现， 第 4 周时肿瘤大小达 2 厘米 ( 图 7)。 说 明 书 CN 102618499 A 7 1/4 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102618499 A 8 2/4 页 9 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102618499 A 9 3/4 页 10 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102618499 A 10 4/4 页 11 图 7 说 明 书 附 图 CN 102618499 A 11 。