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小立碗藓抗低温胁迫基因PpHap5a-like及其蛋白、和载体
技术领域
本发明属于生物基因工程领域，具体地，本发明涉及一种小立碗藓抗低温胁迫基因基因PpHap5a-like及其编码的蛋白质、含有该基因的载体、和转基因细胞系。
背景技术
低温、干旱、高盐是限制植物生长发育、地理分布、形态建成等的重要环境胁迫因素。这些胁迫因素作用的结果均导致植物细胞失水，影响植物细胞的渗透压，进而影响植物正常的生理代谢，严重时导致植物的死亡。通过对一些模式植物的研究发现这三种胁迫因素诱导表达的功能蛋白及转录因子相互交差，因此，寻求同时具有忍耐低温、干旱、高盐胁迫的绿色植物来研究植物的非生物胁迫极有必要。
对苔藓植物的基础研究标明：苔藓植物是极地低温度环境的先锋植物之一，同时它也分布在极端干旱的沙漠。在漫长的生物进化历程中，苔藓植物形成了一套独特的适应低温干燥等恶劣环境的机制。对小立碗藓非生物胁迫研究发现(Frank等，2005)，与其他高等植物相比，小立碗藓(Physcomitrella patens)可以忍耐极端的生态环境。如，拟南芥在100mM的NaCl处理下即受到伤害(Sunkar等，2003)，而小立碗藓可以忍耐350mM的NaCl溶液，在缓慢的逐渐提高的盐处理条件下，小立碗藓可以忍耐600mM的NaCl胁迫。500mM的山梨醇处理三天后，小立碗藓仍可以幸存。当小立碗藓失水92％时仍可恢复正常生长发育。在脱水、盐渍和渗透胁迫条件下，Frank等(2003)分析鉴定了一系列上调基因，其编码的蛋白主要有胆碱脱氢酶(choline dehydrogenase)、甜菜碱(glycine betaine)、三氢吡咯羧酸盐(deltal1-pyrroline-5-carboxylate)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)、钙依赖蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase)、促分裂素原活化蛋白激酶(MAP kinase)等。在0℃低温胁迫七天后小立碗藓仍可恢复生长(Minami等，2005)，且在冷驯化过程中激活了LEA(late-embryogenesis-abundant)蛋白的转录，提高了其冰冻耐受能力。
因此从苔藓植物中克隆抗逆相关基因并进一步通过转基因等技术应用于提高农作物的抗逆性是目前研究的热点之一。
发明内容
为了解决上述问题提出并完成了本发明。
本发明的目的是提供一种高效的抗低温胁迫相关基因。
本发明的另一目的是提供上述基因编码的蛋白质。
本发明的再一目的是提供含有上述基因的载体。
本发明的再一目的是提供表达上述基因的转基因细胞系。
具体地，本发明的发明人将培养至15叶左右的小立碗藓茎叶体在0℃下经过不同时间的处理与非处理小立碗藓茎叶体组成差异材料，通过cDNA-AFLP技术得到差异表达的EST，随后在分子水平进行表达分析或蛋白质水平的分析，挑选出了一种具有显著抗逆特性的基因-小立碗藓抗逆基因PpHap5a-like，其碱基序列如SEQ ID No.1所示，其cDNA序列如SEQ ID No.2所示。
进一步，本发明还提供了上述基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
在本发明的完成过程中，还提供了包含上述基因的载体、以及表达该基因的转基因细胞系。
本发明获得的基因具有高效的抗逆性。通过常用的基因工程技术，可以利用该基因培育出优质的转基因农作物，从而提高农作物的抗逆性。
附图说明
图1为PpHap5a-like基因的cDNA-AFLP图谱，其中，Maker：分子量标记；1、未驯化的24小时的材料；2、未驯化的12小时的材料；3、冷驯化的24小时的材料；4、冷驯化的12小时的材料。
图2为PpHap5a-like基因的Real-time RT-PCR相对表达量变化图。
具体实施方式
1、小立碗藓的培养及冷胁迫处理
将小立碗藓培养至15叶左右，移入0℃处理0、3、6、12、24、48、72小时，分别取材用于cDNA-AFLP分析。
附：小立碗藓培养基配方及制备：
大量元素：
Ca(NO₃)₂·4H₂O   0.8g/L
FeSO₄·7H₂O      0.0125g/L
MgSO₄·7H₂O      0.25g/L
微量元素：
CuSO₄·5H₂O      0.055mg/L
ZnSO₄·7H₂O      0.055mg/L
H₃BO₃            0.614mg/L
MnCl₂·4H₂O      0.389mg/L
CoCl₂·6H₂O      0.055mg/L
KI               0.028mg/L
Na₂MoO₄·2H₂O    0.025mg/L
Glucose          5g/L
酒石酸铵         0.5g/L
磷酸盐缓冲液     1ml/L
微量元素配制成1000X母液，4℃存放。
固体基本培养基，加入浓度为0.8％琼脂粉。
磷酸缓冲液的配制：取25g KH₂PO₄溶解于100ml蒸馏水，用4M KOH调整pH7.0，4℃存放。
2、cDNA-AFLP分析
cDNA-AFLP方法参照Christian，1998。
1)小立碗藓RNA提取(TE3D法)和DNase I处理
2)mRNA的分离
mRNA从总RNA中分离，按照Promega公司试剂盒PolyAmRNAIsolation system介绍的方法进行。
3)cDNA的合成
cDNA按照TaKaRa公司试剂盒cDNA Synthesis Kit(M-MLV Version)介绍的方法进行。
4)双酶切
采用EcoRI和MseI两种限制性内切酶对cDNA进行双酶切。
模板cDNA(200ng/μl)    1.25μl
缓冲液(10X)            2μl
EcoRI    5U/μl        1μl
MseI     5U/μl        1μl
ddH2O                  14.75μl
总体积：               20μl
混匀离心，37℃酶切至少3个小时，最好过夜直至cDNA被完全酶切；
酶切完全后，反应混合物置65℃加热15min，使限制性内切酶失火，之后将反应管置冰上冷却；
1.5％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，呈现均匀弥散为较好酶切效果。
5)接头连接
采用EcoRI adaptor和MseI adaptor两种接头连接，所用接头见表2.1。
酶切反应液             20μl
缓冲液(10X)            2μl
T4-连接酶(10U/μl)     0.1μl
ATP(10mM)              0.2μl
EcoRI接头50pmol/μl    1μl
MseI接头50pmol/μl     1μl
ddH₂O                  5.7μl
总体积：               30μl
混合离心，37℃至少连接3小时，-20℃可长期保存。
6)预扩增
以E0和M0为引物做预扩增，所用引物见表2.1。加入以下试剂于反应管中：
模板DNA(连接反应液)    2.0μl
缓冲液(10X)            2.0μl
MgCl2(25mM)            1.2μl
EcoRI引物(E0，50ng/μl)0.6μl
MseI引物(M0，50ng/μl) 0.6μl
Taq酶(5U/μl)          0.2μl
dNTP(10mM)             0.2μl
H₂O                    13.2μl
总体积：               20μl
PCR反应程序：94℃、3min；94℃、30s，56℃、30s，72℃、1min，15个循环；68℃、10min；4℃保存。
取5μl预扩增产物加入95μl TE稀释，其余扩增产物-20℃保存。
表2.1：cDNA-AFLP实验的接头序列和预扩增、选择性扩增引物序列

  名称  寡核苷酸序列(5’to 3’) EcoRI adaptor  MseI adaptor  5′-CTCGTAGACTGCGTACC-3′  3′-CATCTGACGCATGGTTAA-5′  5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′  3′-TACTCAGGACTCAT-5′ EcoRI预扩增引物(E0) MseI预扩增引物(M0)  5′-GACTGCGTACCAATTC-3′  5′-GATGAGTCCTGAGTAA-3′ EcoRI选扩增引物(E1) E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 MseI选扩增引物(M1) M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8  GACTGCGTACCAATTCAA  GACTGCGTACCAATTCAC  GACTGCGTACCAATTCAG  GACTGCGTACCAATTCAT  GACTGCGTACCAATTCTA  GACTGCGTACCAATTCTC  GACTGCGTACCAATTCTG  GACTGCGTACCAATTCTT  GATGAGTCCTGAGTAACAA  GATGAGTCCTGAGTAACAC  GATGAGTCCTGAGTAACAG  GATGAGTCCTGAGTAACAT  GATGAGTCCTGAGTAACTA  GATGAGTCCTGAGTAACTC  GATGAGTCCTGAGTAACTG  GATGAGTCCTGAGTAACTT
7)选择性扩增
以E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8和M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8为引物做选择性扩增，所用引物见表2.1。加入以下试剂于反应管中：
模板DNA(预扩稀释物)       5.0μl
缓冲液(10X)               2.0μl
MgCl₂(25mM)              1.2μl
dNTP(10mM)                0.2μl
EcoRI引物(Ex，50pmol/μl) 0.6μl
MseI引物(Mx，50pmol/μl)  0.6μl
Taq酶(5U/μl)             0.2μl
H₂O                       10.2μl
总体积：                  20μl
PCR反应采用“touch down”策略。程序如下：
94℃    1min
94℃    30s
65℃    30s    7个循环(每个循环降低0.7℃)
72℃    1min
94℃    30s    20个循环
56℃    30s
72℃    1min
68℃    10min
4℃     保存
8)电泳检测——银染技术
记录试验结果：拍照或扫描，统计检测位点数及其多态性位点。
以冷驯化3h，6h，12h，24h，48h，72h和未驯化0h的小立碗藓为材料，进行cDNA-AFLP分析。统计200bp～1000bp之间的可读带，结果表明小立碗藓冷驯化和未冷驯化的基因表达存在着明显差异。有些cDNA片段在冷驯化后表达量逐渐增加，有些cDNA片段表现出先增加后降低，有些cDNA片段表达量先降低后增加，还有少数表达量明显降低。
3、Pp Hap5a-like全长基因的获得
1)RT-PCR分析：
将由cDNA-AFLP分析得到的差异片段与P.patens EST数据库(http://moss.nibb.ac.jp/blast/blast.html)进行BLAST比对后，进行聚类分析和功能分类，显示小立碗藓在冷驯化过程中细胞内的代谢活性和生长状态发生了极大的变化。特别值得一提的是，发现了与伤害损伤修复相关的转录本，编码PpHap5a-like。通过同源序列设计引物，通过RT-PCR反应扩增得到Pp Hap5a-like。Pp Hap5a-like基因的上游引物序列为：AGATTCGAATTAACGCGCACCAAAAAAGTG；下游引物序列为：GGGATTTTACACATTTTCCTACCA。PCR反应体系如下：
cDNA                   3μl
10×LA PCR缓冲液      2μl
dNTP(2.5mM)            1.6μl
primerF(50pmol/μl)    0.15μl
primerF(50pmol/μl)    0.15μl
LA Polymerase          0.1μl
ddH₂O                  13μl
总体积                 20μl
PCR反应程序：
95℃    1min
95℃    45s
65℃    45s    32个循环
68℃    2min
72℃    10min
4℃     保存
2)纯化后的差异片段与pGEM-T easy(Promega)载体连接
3)连接产物的转化
5)阳性克隆的测序
以载体两端的T7或SP6引物进行序列测定。测序仪为ABI 3100(AppliedBiosystems)。
该基因的基因序列如下SEQ ID No.1：
AAATTTACAAATTGAAAAAAATAAAATAATGTTGTCAATATTTTATGTATTGGAGAATTCAAAACCATACACATGAATATTAAAGCATGAAAATTTCCAATACACTCTTTCATCAATGCAAATTTTAAAAACTCACAACAATTGTGATGACACCAGATTCGAATTAACGCGCACCAAAAAAGTGAAAGTAAAAAAGTACCATGAATCTACCGCGGGGTAAGTTCCAGCGGGGGCAAGTTAAACCCGAAAGGTGGGCCAATGAGAGGTCGCCATGTGTCAGCAGCAGAGTTCTCCACAGAACTGTCTTTTGTAGGGCTCATCGCCTTCGCGCGCATCAAGATGCCGACACGTATGGTGGTTCCAATGGCGGTGGTATGGCTGCATGGTCACATAGCTCCAGCATGCATGGGGCCATGGCCATGCGGGCACTCGCGGGCTCATTCAACCGGGAGTTCGCTGGTGCAGAGGTGTGGAGAGAGAGCTTGGCAGCAGCAGTAGCGATGGCGTCGAACCAGCATGGACTTGCGTCTCTTTCCTCTGCTAAACCACAATCCAGCGCCGGAGCTACTACTACGGCGCAGCAGAGTTTCCAGCAAGGGAAGCACCAGGTGAGCGCGTCATTGCAGGAGGGGAGGAGATGATGAGTCCGTCATTTGGTTCATGGTTGTATCTCTCTCTCACAGGAGGCGTGACTAGTGATTTTGGCCTAGTCATGCAGGATTTAATGCATTTCTAGAGTTTTTTTCAGTTTTTTGGATTTCTGGAATTATGAATCATAACTGTGATGGTTGCGTTTTGGTTTAGAGGAGGTGGAGGTGCTGGTGAGGCGATTTGAGGTTGAGTTGAGAATTTAGGAGGTTGCTGACTAGTGCACAACTCTCTCGCTGTGTGTGTGTATGTGTGTGGGTGGTTTTGTGTGTAGATGCAAGGGCAAGGACAGATGAACTCGCACATGCAGCACCAACAGCTGCAGATGTTTTGGCAGCAGCAAAACCAAGAAATGGAGCAGTTAAATGGTGCAGAAACCATTCTTTCCTTCGTGAGTACATATGAACATGTGCCGCTTTAGGCTTGCCTCTCGTCGTCTCGGGTGATTCTGATTGTTATTTTTAACAAGAGTGTTCGGTTTTGAATTGGCTTCTCATTTCATAAGACGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCAGAGAAATCCAGCAAGTCGGAGCTGCTCATGACACATCTTACAGGTTCTTCATTTTTCCCGACTTATCTATGTGCACCTTGACCTGTAAATCGTGTAAATTTTGAGACACTCTGTAACCAGTTGTTCTATAAGAACGTCCTTGATATTCCCTAGCTCGTCTGTGGAACCTGGATAAAGACTCAGCCAAGTGGATAAGTTCTTATAGGGGATTCGTTATAGTAACTCCTAACGCAGTAAGAAACTTTGATAATGGATCGGCGCACATGATGGATGGAAAGTACAGTCCTGAAGAATGGTGCTAGGTGTGAGATACTTATTCTAACTGTTTCAATTGTTATATGCATCGGTTATTGTTCGATTGGTTTACATGTTGACGCAGAGTCGTAAGAAATGTTCGTGTCAGAAAAACACGCGATGAATGTATTCGTAAAGTGCTTTTAAACTATGCTCAAAGTATTGGCATTCAATTCAAACAAATTTTCAGAGTAGTGAACTGTTTAGGTGTGGAACTTCAAAAGTTCAAGTCCTCGCACATGCAGAGTGCTAACTAATCATTGCAAAACTATGAGGGCTGTACCTGACCTGAGCCAGGCGTTCATTCGTCTAGTCTACGAGTTTTTCGCATCATGGTTTCACTAGAATGCTGTCCCTCAAGTAATATGCCTCTCACTGTTGTCCGAAGTGTTCAATCCTGTAAGGTTGCAGTGCACTATTATATAAGGATTAAAGCAGTAAACTTACGCATGTTCAATTTGTAAATACGCTCTCGGCAACTAACAACGGAGGCTCCTTTGTGGACAGAATTCAAGAACCACCAGCTGCCGTTAGCACGCATCAAGAAAATTATGAAGTCAGATGAAGATGTGAAGGTGAGAATTTCGGTTCCCTACTCCTCATGTGTTAGATAAAGTATTGAATACCTCTTGGACGAAGAAAATGTTAAGCTGAAAACTACTAGAACCGTAAACTTCTGTGAAGAAACTCCAGTGTTGTTGCGTCGGCAATATTTTGGCAGTAGGGTATTGAATTGGTTCGATGAAGTAGTAGCATGAGTACACGAACAACATTTTTCAGACCCCCATTTGTAGGTTATCACCAGCGGACTCTAGTTTGTGTATTTTGTAAGTGCAGATCTTCTCGTAAAGCATAATCGCTCCTAAATGCATAATTTGATTCCGCTGTTACTGCGACTTAAATAATTGTTTCGGAGCTGGGGATCCGAATCATATACTATATCATTGTGACACAAGATTCCTATGTCTGTTCTTTGGCAGATGATTGCAGCTGAGGCTCCAGTTCTGTTCGCGAAGGCATGTGAGATGTTTATTTTAGAGTTGACTTTGCGGTCATGGATTCACACAGAAGAGAATAAGAGGCGTACACTACAGAGAAATGATATCGCTGGAGCCATAACCAGGGGTGATATCTTTGATTTTCTCGTGGATATTGTTCCTCGCGATGAGCTCAAGGTATGTTTCAAAAATCTCAGAGGGGTTATGATCATCCATCGTTCTCAAAATCTTTTAGTCTGGGGTTGACTTGTTGTGTATTGGTTGGGCCTTTATCTGGGGTTCCATATCGTACATGCGATTCTAAGAACGAAGAATATTCTTGGATTGCGCAAGGGTGCGAATTGGTAGGGATGGTTTTATAAATAATTTGGTAGCACAGAGTGCCATTTAGCTAGACCTTACCTTCAGGTTTGGAGATCATAGTCATGCTGGAAAAAGTGTTGTACTGCTTGAGAAGGAAAGAAAATAAGTGTAAAACAGCATTATTGTATAGTACCTAAATGTACCATTATAGAATTTGAGTGTCAACTTATGGAACAACAGGAGTTTTATATCAGTTGACACCATTGAGACGGCTGCTTCAGAAAGTGACTTTTGAGTCACCTTAAAGTCTTTTACTTCTCCTTGAGAGTCTCTGCCTTGTTATGTGAACGCGTCATTGATATGAAATGGTCATTGCTCTCAGGAAGAGGAGACAGCAGTACCTTGGTCTGGAGGTGGAGGGGAGCAGGTTCAGTATGGAGGCATGTTTTACCCTTCAATGCCACCACAATCCGTGCATTATCCTATGGGGGCTCCTGTAAGTATTTATTGGTTTGTGCTGGAAAGTAGAGAATATAGCAAAAAGTGTTTCTCTTGTTGTACTCAAACAGCGACCGAAATTGGAATTGGCTTGGTTATTTCAACACGTATCTTGCATTCCTGGAAAGAGAAACTATTGAGAAAAGGTTCTTCTCTGCGTGAGCATGCTCTCCTGCTTATCTATCACAGCAGTCAGGTTTTTAGTTTCGGTGAGTCTTCAGCGTTCACCCCTAAGCCAGTGAGTCTGATTTTGCTTGTGTACATCTCTAGAGTTTGTTTTGTTGCAAAAGTAAAATTTTGATGTCTTGTGTGCAGGATGTGATGGTGGTACAGTCTACAATGCCTTCTAATCAGCCATCACTGTATGCAGCGAATCAGGTATTGCCTATTCTTGAGATGCAGATGCGTTCAACTACTGTTAACTAAGCAGAGATTCTGAACAGAGACTATGAGAAATTGCGTAGTATTATTATGCCTTGTAGATCTTGGAGGAGTTGCAGTGGGTAATATTAACAGATCTTGCTTCCGTATATGCAGCAAGGAGACATGCAGTAGCATCCATGGACTATTGGGAGGAGAAAAATAAGTAGTCCTGGTAGGAAAATGTGTAAAATCCCTTTTCATTTGTTCTTTTGGAAACGGTGGTTTGCAAGGGAAGGTAGCATGCTGCAAACTAATGGATGAATTAGCCATCGATGCAGGTTATCTTCCTACACAACTAGGGAGTTACACTGTATTAAGATGCCCTCTGTATATTGGCTTCACACCATTTTTTCCTTTTTGTGTACAT
该基因的cDNA序列如下SEQ ID No.2：
ATGAATCTACCGCGGGGTAAGTTCCAGCGGGGGCAAGTTAAACCCGAAAGGTGGGCCAATGAGAGGTCGCCATGTGTCAGCAGCAGAGTTCTCCACAGAACTGTCTTTTGTAGGGCTCATCGCCTTCGCGCGCATCAAGATGCCGACACGTATGGTGGTTCCAATGGCGGTGGTATGGCTGCATGGTCACATAGCTCCAGCATGCATGGGGCCATGGCCATGCGGGCACTCGCGGGCTCATTCAACCGGGAGTTCGCTGGTGCAGAGGTGTGGAGAGAGAGCTTGGCAGCAGCAGTAGCGATGGCGTCGAACCAGCATGGACTTGCGTCTCTTTCCTCTGCTAAACCACAATCCAGCGCCGGAGCTACTACTACGGCGCAGCAGAGTTTCCAGCAAGGGAAGCACCAGATGCAAGGGCAAGGACAGATGAACTCGCACATGCAGCACCAACAGCTGCAGATGTTTTGGCAGCAGCAAAACCAAGAAATGGAGCAGTTAAATGAGAAATCCAGCAAGTCGGAGCTGCTCATGACACATCTTACAGAATTCAAGAACCACCAGCTGCCGTTAGCACGCATCAAGAAAATTATGAAGTCAGATGAAGATGTGAAGATGATTGCAGCTGAGGCTCCAGTTCTGTTCGCGAAGGCATGTGAGATGTTTATTTTAGAGTTGACTTTGCGGTCATGGATTCACACAGAAGAGAATAAGAGGCGTACACTACAGAGAAATGATATCGCTGGAGCCATAACCAGGGGTGATATCTTTGATTTTCTCGTGGATATTGTTCCTCGCGATGAGCTCAAGGAAGAGGAGACAGCAGTACCTTGGTCTGGAGGTGGAGGGGAGCAGGTTCAGTATGGAGGCATGTTTTACCCTTCAATGCCACCACAATCCGTGCATTATCCTATGGGGGCTCCTGATGTGATGGTGGTACAGTCTACAATGCCTTCTAATCAGCCATCACTGTATGCAGCGAATCAGATCTTGGAGGAGTTGCAGTGGGTAATATTAACAGATCTTGCTTCCGTATATGCAGCAAGGAGACATGCAGTAGCATCCATGGACTATTGGGAGGAGAAAAATAAGTAG
其编码的蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID No.3：
MNLPRGKFQRGQVKPERWANERSPCVSSRVLHRTVFCRAHRLRAHQDADTYGGSNGGGMAAWSHSSSMHGAMAMRALAGSPNREFAGAEVWRESLAAAVAMASNQHGLASLSSAKPQSSAGATTTAQQSFQQGKHQMQGQGQMNSHMQHQQLQMFWQQQNQEMEQLNEKSSKSELLMTHLTEFKNHQLPLARIKKIMKSDEDVKMIAAEAPVLFAKACEMFILELTLRSWIHTEENKRRTLQRNDIAGAITRGDIFDFLVDIVPRDELKEEETAVPWSGGGGEQVQYGGMFYPSMPPQSVHYPMGAPDVMVVQSTMPSNQPSLYAANQILEELQWVILTDLASVYAARRHAVASMDYWEEKNK
Pp Hap5a-like基因的Real-time RT-PCR分析
利用real-time RT-PCR方法研究了Pp Hap5a-like基因在冷驯化过程中的表达变化。
1)RNA提取和反转录
利用RNA反转录试剂盒进行RNA反转录。试剂盒使用TaKaRa公司的RNA PCRkit，参照试剂盒的说明书，以试剂盒提供的反应体系进行反转录反应。
2)预实验：
反转录产物稀释10倍用以做模板，用目的基因的引物，使用HS Ex Taq DNApolymerase，进行PCR反应。PCR反应条件如下：
94℃    2min
94℃    30s
61℃    30s
72℃    20s    30个循环
20C    5min
PCR反应产物用琼脂糖凝胶电泳检测。选择反应产物专一，没有二聚体等杂带的样品进行下一步定量PCR反应。
3)定量PCR反应
利用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time)kit进行荧光定量PCR反应，引物序列见表2.2。PCR仪使用Corbet Research公司的Rotor Gene3000Real-Time Thermal Cycler。实验结果利用软件Rotor-Gene 6.0(Donald etal.，2005)以及Excel 7.0进行数据分析处理。采用Pp-actin3基因作对照，PpHap5a-like基因的上游引物序列为：ATGAATCTACCGCGGGGTAAGTTC；下游引物序列为：GCGAAGGCGATGAGCCCTAC。
4)标准曲线的生成
将预试验的PCR产物按照10倍浓度梯度进行稀释，选择1/1,000，1/10,000，1/100,000，1/1,000，000浓度的稀释产物作为标准品模版，进行荧光定量PCR反应。通过这四个标准品生成的反应数据，软件Rotor-Gene 5.0根据反应的荧光实时监控数据和标准品的浓度关系，生成标准曲线(参见图2，转录本12)。
低温诱导表达特性说明了PpHap5a-like基因与小立碗藓的低温抗性密切相关。
序列表.txt
<110>首都师范大学
<120>小立碗藓抗低温胁迫基因Pp Hap5a-like及其编码的蛋白质、含有该基因的载体、和细胞系
<160>3
<210>1
<211>4073
<212>DNA
<213>小立碗藓(Physcomytrella Pateuts)
<400>1
aaatttaoaa attgaaaaaa ataaaataat gttgtcaata ttttatgtat tggagaattc      60
aaaaccatac acatgaatat taaagcatga aaatttccaa tacactcttt catcaatgca     120
aattttaaaa actcacaaca attgtgatga caccagattc gaattaacgc gcaccaaaaa     180
agtgaaagta aaaaagtacc atgaatctac cgcggggtaa gttccagcgg gggcaagtta     240
aacccgaaag gtgggccaat gagaggtcgc catgtgtcag cagcagagtt ctccacagaa     300
ctgtcttttg tagggctcat cgccttcgcg cgcatcaaga tgccgacacg tatggtggtt     360
ccaatggcgg tggtatggct gcatggtcac atagctccag catgcatggg gccatggcca     420
tgcgggcact cgcgggctca ttcaaccggg agttcgctgg tgcagaggtg tggagagaga     480
gcttggcagc agcagtagcg atggcgtcga accagcatgg acttgcgtct ctttcctctg     540
ctaaaccaca atccagcgcc ggagctacta ctacggcgca gcagagtttc cagcaaggga     600
agcaccaggt gagcgcgtca ttgcaggagg ggaggagatg atgagtccgt catttggttc     660
atggttgtat ctctctctca caggaggcgt gactagtgat tttggcctag tcatgcagga     720
tttaatgcat ttctagagtt tttttcagtt ttttggattt ctggaattat gaatcataac     780
tgtgatggtt gcgttttggt ttagaggagg tggaggtgct ggtgaggcga tttgaggttg     840
agttgagaat ttaggaggtt gctgactagt gcacaactct ctcgctgtgt gtgtgtatgt     900
gtgtgggtgg ttttgtgtgt agatgcaagg gcaaggacag atgaactcgc acatgcagca     960
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agaaaccatt ctttccttcg tgagtacata tgaacatgtg ccgctttagg cttgcctctc    1080
gtcgtctcgg gtgattctga ttgttatttt taacaagagt gttcggtttt gaattggctt    1140
ctcatttcat aagacgtttt tttttttttt tttttttttt tttttttcca gagaaatcca    1200
gcaagtcgga gctgctcatg acacatctta caggttcttc atttttcccg acttatctat    1260
gtgcaccttg acctgtaaat cgtgtaaatt ttgagacact ctgtaaccag ttgttctata    1320
agaacgtcct tgatattccc tagctcgtct gtggaacctg gataaagact cagccaagtg    1380
gataagttct tataggggat tcgttatagt aactcctaac gcagtaagaa actttgataa    1440
tggatcggcg cacatgatgg atggaaagta cagtcctgaa gaatggtgct aggtgtgaga    1500
tacttattct aactgtttca attgttatat gcatcggtta ttgttcgatt ggtttacatg    1560
ttgacgcaga gtcgtaagaa atgttcgtgt cagaaaaaca cgcgatgaat gtattcgtaa    1620
agtgctttta aactatgctc aaagtattgg cattcaattc aaacaaattt tcagagtagt    1680
gaactgttta ggtgtggaac ttcaaaagtt caagtcctcg cacatgcaga gtgctaacta    1740
atcattgcaa aactatgagg gctgtacctg acctgagcca ggcgttcatt cgtctagtct    1800
acgagttttt cgcatcatgg tttcactaga atgctgtccc tcaagtaata tgcctctcac    1860
tgttgtccga agtgttcaat cctgtaaggt tgcagtgcac tattatataa ggattaaagc    1920
agtaaactta cgcatgttca atttgtaaat acgctctcgg caactaacaa cggaggctcc    1980
tttgtggaca gaattcaaga accaccagct gccgttagca cgcatcaaga aaattatgaa    2040
gtcagatgaa gatgtgaagg tgagaatttc ggttccctac tcctcatgtg ttagataaag    2100
tattgaatac ctcttggacg aagaaaatgt taagctgaaa actactagaa ccgtaaactt    2160
ctgtgaagaa actccagtgt tgttgcgtcg gcaatatttt ggcagtaggg tattgaattg    2220
gttcgatgaa gtagtagcat gagtacacga acaacatttt tcagaccccc atttgtaggt    2280
tatcaccagc ggactctagt ttgtgtattt tgtaagtgca gatcttctcg taaagcataa    2340
tcgctcctaa atgcataatt tgattccgct gttactgcga cttaaataat tgtttcggag    2400
ctggggatcc gaatcatata ctatatcatt gtgacacaag attcctatgt ctgttctttg    2460
gcagatgatt gcagctgagg ctccagttct gttcgcgaag gcatgtgaga tgtttatttt    2520
agagttgact ttgcggtcat ggattcacac agaagagaat aagaggcgta cactacagag    2580
aaatgatatc gctggagcca taaccagggg tgatatcttt gattttctcg tggatattgt    2640
tcctcgcgat gagctcaagg tatgtttcaa aaatctcaga ggggttatga tcatccatcg    2700
ttctcaaaat cttttagtct ggggttgact tgttgtgtat tggttgggcc tttatctggg    2760
gttccatatc gtacatgcga ttctaagaac gaagaatatt cttggattgc gcaagggtgc    2820
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caatgccacc acaatccgtg cattatccta tgggggctcc tgtaagtatt tattggtttg    3300
tgctggaaag tagagaatat agcaaaaagt gtttctcttg ttgtactcaa acagcgaccg    3360
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tgagaaaagg ttcttctctg cgtgagcatg ctctcctgct tatctatcac agcagtcagg    3480
tttttagttt cggtgagtct tcagcgttca cccctaagcc agtgagtctg attttgcttg    3540
tgtacatctc tagagtttgt tttgttgcaa aagtaaaatt ttgatgtctt gtgtgcagga    3600
tgtgatggtg gtacagtcta caatgccttc taatcagcca tcactgtatg cagcgaatca    3660
ggtattgcct attcttgaga tgcagatgcg ttcaactact gttaactaag cagagattct    3720
gaacagagac tatgagaaat tgcgtagtat tattatgcct tgtagatctt ggaggagttg    3780
cagtgggtaa tattaacaga tcttgcttcc gtatatgcag caaggagaca tgcagtagca    3840
tccatggact attgggagga gaaaaataag tagtcctggt aggaaaatgt gtaaaatccc    3900
ttttcatttg ttcttttgga aacggtggtt tgcaagggaa ggtagcatgc tgcaaactaa    3960
tggatgaatt agccatcgat gcaggttatc ttcctacaca actagggagt tacactgtat    4020
taagatgccc tctgtatatt ggcttcacac cattttttcc tttttgtgta cat           4073
<210>2
<211>1092
<212>DNA
<213>小立碗藓(Physcomytrella Pateuts)
<400>2：
atgaatctac cgcggggtaa gttccagcgg gggcaagtta aacccgaaag gtgggccaat     60
gagaggtcgc catgtgtcag cagcagagtt ctccacagaa ctgtcttttg tagggctcat    120
cgccttcgcg cgcatcaaga tgccgacacg tatggtggtt ccaatggcgg tggtatggct    180
gcatggtcac atagctccag catgcatggg gccatggcca tgcgggcact cgcgggctca    240
ttcaaccggg agttcgctgg tgcagaggtg tggagagaga gcttggcagc agcagtagcg    300
atggcgtcga accagcatgg acttgcgtct ctttcctctg ctaaaccaca atccagcgcc    360
ggagctacta ctacggcgca gcagagtttc cagcaaggga agcaccagat gcaagggcaa    420
ggacagatga actcgcacat gcagcaccaa cagctgcaga tgttttggca gcagcaaaac    480
caagaaatgg agcagttaaa tgagaaatcc agcaagtcgg agctgctcat gacacatctt    540
acagaattca agaaccacca gctgccgtta gcacgcatca agaaaattat gaagtcagat    600
gaagatgtga agatgattgc agctgaggct ccagttctgt tcgcgaaggc atgtgagatg    660
tttattttag agttgacttt gcggtcatgg attcacacag aagagaataa gaggcgtaca    720
ctacagagaa atgatatcgc tggagccata accaggggtg atatctttga ttttctcgtg    780
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cattatccta tgggggctcc tgatgtgatg gtggtacagt ctacaatgcc ttctaatcag    960
ccatcactgt atgcagcgaa tcagatcttg gaggagttgc agtgggtaat attaacagat   1020
cttgcttccg tatatgcagc aaggagacat gcagtagcat ccatggacta ttgggaggag   1080
aaaaataagt ag                                                       1092
<210>3
<211>363
<212>PRT
<213>小立碗藓(Physcomytrella Pateuts)
<400>3
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KNK