植物耐盐相关蛋白和基因及其作为筛选标记的应用.pdf

《植物耐盐相关蛋白和基因及其作为筛选标记的应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《植物耐盐相关蛋白和基因及其作为筛选标记的应用.pdf（19页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)授权公告号 CN 102796713 B (45)授权公告日 2013.08.07 CN 102796713 B *CN102796713B* (21)申请号 201210288593.7 (22)申请日 2012.08.14 C12N 9/14(2006.01) C12N 15/55(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 15/82(2006.01) A01H 5/00(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (73)专利权人 中国农业科学院作物科学研究所 地址 。

2、100081 北京市海淀区中关村南大街 12 号， 中国农业科学院作物科学研究 所育种北楼 306 (72)发明人 侯文胜 黄姗 韩天富 王伟旗 李亮 孙石 吴存祥 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 (54) 发明名称 植物耐盐相关蛋白和基因及其作为筛选标记 的应用 (57) 摘要 本发明公开了一种植物耐盐相关蛋白和基因 及其作为筛选标记的应用。 本发明提供的GmVP蛋 白， 是如下 （a） 或 （b） ：（a） 由序列表中序列 1 所示 的氨基酸序列组成的蛋白质 ；（b） 将序列 1 的氨 基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或缺失和 。

3、/ 或添加且与植物耐盐相关的由序列 1 衍生的蛋白质。本发明还保护一种培育转基因植 物的方法， 是将 GmVP 基因导入目的植物中， 得到 耐盐性高于所述目的植物的转基因植物。本发明 还保护一种培育转基因植物的方法， 是将含有筛 选基因和目的基因的重组表达载体导入目的植物 中， 通过耐盐性筛选得到含有所述目的基因的转 基因植物 ； 所述筛选基因为 GmVP 基因。本发明将 在植物育种， 特别是大豆育种中发挥重要作用。 (51)Int.Cl. 审查员 管冰 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 7 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说。

4、明书8页 序列表7页 附图2页 (10)授权公告号 CN 102796713 B CN 102796713 B *CN102796713B* 1/1 页 2 1. 一种蛋白质， 是由序列表中序列 1 所示的氨基酸序列组成的蛋白质。 2. 编码权利要求 1 所述蛋白的基因。 3. 如权利要求 2 所述的基因， 其特征在于 ： 所述基因是如下 1） 或 2） 所述的 DNA 分子 ： 1） 序列表的序列 2 自 5 末端第 1 至 2403 位核苷酸所示的 DNA 分子 ； 2） 序列表的序列 2 所示的 DNA 分子。 4. 含有权利要求 2 或 3 所述基因的重组表达载体、 表达盒或转基因细胞。

5、系。 5.如权利要求4所述的重组表达载体， 其特征在于 ： 所述重组表达载体为将权利要求2 或 3 所述基因插入 pGFPGUSplus 载体的多克隆位点得到的重组质粒。 6.一种培育转基因植物的方法， 是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中， 得到耐 盐性高于所述目的植物的转基因植物 ； 所述目的植物为大豆。 7. 一种培育转基因植物的方法， 是将含有筛选基因和目的基因的重组表达载体导入目 的植物中， 通过耐盐性筛选得到含有所述目的基因的转基因植物 ； 所述筛选基因为权利要 求 2 或 3 所述基因 ； 所述目的植物为大豆。 8. 权利要求 2 或 3 所述基因作为筛选基因的应用 ； 所述。

6、筛选基因用于筛选转基因大 豆。 9. 权利要求 6 或 7 所述方法在大豆育种中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102796713 B 2 1/8 页 3 植物耐盐相关蛋白和基因及其作为筛选标记的应用 技术领域 0001 本发明涉及一种植物耐盐相关蛋白和基因及其作为筛选标记的应用。 背景技术 0002 盐碱土是地球上广泛分布的一种土壤类型， 全球约有 8 亿公顷的陆地受到盐胁迫 的影响 （占据了世界陆地面积的 6%） ， 近 50% 的灌溉农田受到盐分影响。受自然和耕作方式 等因素的影响， 受盐碱影响的耕地面积还在不断增加， 该问题在干旱和半干旱地区表现得 尤为突出。中国盐碱土面积约 1 。

7、亿公顷， 其中现代盐渍化土壤约 0.37 亿公顷， 残余盐渍化 土壤约 0.45 亿公顷， 潜在盐渍化土壤约 0.17 公顷。随着全球气候变暖和灌溉农业的发展， 土壤质量将面临更大的挑战， 盐碱化土壤的面积将不断扩大。 0003 植物耐盐性是个复杂的数量性状， 开展植物耐盐性研究， 了解其相关基因、 调控通 路对全面认识和改良植物耐盐性具有重要意义。 0004 目前研究认为氢离子焦磷酸酶类是定位于植物液泡膜结构的 H+离子转运蛋白， 能 够通过无机焦磷酸酶的水解作用使得 PPi 水解， 并实现 H+跨膜转运， 调节液泡和细胞质的 酸化作用， 帮助建立液泡膜内外电化学梯度， 为各种物质 （如离子。

8、、 氨基酸、 糖类等） 提供跨 膜转运动力。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种植物耐盐相关蛋白和基因及其作为筛选标记的应用。 0006 本 发 明 提 供 的 植 物 耐 盐 相 关 蛋 白， 命 名 为 GmVP（Glycine max vacuolar pyrophosphatase） 蛋白， 来源于豆科大豆属栽培大豆 （Glycine max（L.） Merrill） ， 是如下 （a） 或 （b） ： 0007 （a） 由序列表中序列 1 所示的氨基酸序列组成的蛋白质 ； 0008 （b） 将序列 1 的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或缺失和 / 或 添加且。

9、与植物耐盐相关的由序列 1 衍生的蛋白质。 0009 为了使 （a） 中的蛋白质便于纯化， 可在由序列表中序列 1 所示的氨基酸序列组成 的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表 1 所示的标签。 0010 表 1 标签的序列 0011 标签 残基 序列 Poly-Arg 5-6（通常为 5 个） RRRRR Poly-His 2-10（通常为 6 个） HHHHHH FLAG 8 DYKDDDDK 说 明 书 CN 102796713 B 3 2/8 页 4 Strep-tag II 8 WSHPQFEK c-myc 10 EQKLISEEDL 0012 上述 （b） 中的蛋白质可人工合成， 。

10、也可先合成其编码基因， 再进行生物表达得到。 上述 （b） 中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列 2 所示的 DNA 序列中缺失一个或几 个氨基酸残基的密码子， 和 / 或进行一个或几个碱基对的错义突变， 和 / 或在其 5端和 / 或 3端连上表 1 所示的标签的编码序列得到。 0013 编码所述 GmVP 蛋白的基因 （GmVP 基因） 也属于本发明的保护范围。 0014 所述 GmVP 基因是如下 1） 至 4） 中任一所述的 DNA 分子 ： 0015 1） 序列表的序列 2 自 5 末端第 1 至 2403 位核苷酸所示的 DNA 分子 ； 0016 2） 序列表的序列 2 所示。

11、的 DNA 分子 ； 0017 3） 在严格条件下与 1） 或 2） 限定的 DNA 序列杂交且编码植物耐盐相关蛋白的 DNA 分子 ； 0018 4） 与 1） 或 2） 限定的 DNA 序列具有 90% 以上同源性且编码植物耐盐相关蛋白的 DNA 分子。 0019 所述严格条件为在 0.1SSPE（或 0.1SSC） 、 0.1 SDS 的溶液中， 65条件下杂 交并洗膜。 0020 含有所述 GmVP 基因的重组表达载体、 表达盒、 转基因细胞系或重组菌均属于本发 明的保护范围。 0021 可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。 所述表达载体包括双元 农杆菌载体和可用于微弹轰。

12、击的载体等。所述表达载体还可包含外源基因的 3 端非翻译 区域， 即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与 mRNA 加工或基因表达的 DNA 片段。所述聚腺苷 酸信号可引导聚腺苷酸加入到 mRNA 前体的 3 端。使用所述基因构建重组表达载体时， 在 其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子， 它们可单独使用或与 其它的启动子结合使用 ； 此外， 使用本发明的基因构建重组表达载体时， 还可使用增强子， 包括翻译增强子或转录增强子， 这些增强子区域可以是 ATG 起始密码子或邻接区域起始密 码子等， 但必需与编码序列的阅读框相同， 以保证整个序列的正确翻译。 所述翻译控制信号 和起始。

13、密码子的来源是广泛的， 可以是天然的， 也可以是合成的。 翻译起始区域可以来自转 录起始区域或结构基因。 0022 所述重组表达载体具体可为将所述 GmVP 基因插入 pGFPGUSplus 载体的多克隆位 点得到的重组质粒。 0023 本发明还保护一种培育转基因植物的方法， 是将所述 GmVP 基因导入目的植物中， 得到耐盐性高于所述目的植物的转基因植物。所述 GmVP 基因具体可通过以上任一所述重 组表达载体导入所述目的生物中。含有有所述 GmVP 基因的重组表达载体可通过使用 Ti 质 粒、 Ri 质粒、 植物病毒载体、 直接 DNA 转化、 显微注射、 电导、 农杆菌介导、 基因枪等常。

14、规生物 学方法转化所述生物的细胞或组织。所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双 子叶植物可为大豆属植物， 具体可为大豆属大豆， 如文丰 7 号。 0024 本发明还保护一种培育转基因植物的方法， 是将含有筛选基因和目的基因的重组 表达载体导入目的植物中， 通过耐盐性筛选 （如采用100mmol/L NaCl筛选） 得到含有所述目 说 明 书 CN 102796713 B 4 3/8 页 5 的基因的转基因植物 ； 所述筛选基因为所述GmVP基因。 所述筛选基因和目的基因具体可通 过重组表达载体导入所述目的生物中。 携带有所述筛选基因和目的基因的重组表达载体可 通过使用 Ti 质粒、 R。

15、i 质粒、 植物病毒载体、 直接 DNA 转化、 显微注射、 电导、 农杆菌介导、 基 因枪等常规生物学方法转化所述生物的细胞或组织。 所述目的植物可为单子叶植物或双子 叶植物。所述双子叶植物可为大豆属植物， 具体可为大豆属大豆， 如文丰 7 号。所述筛选基 因和目的基因具体可通过如下重组表达载体导入所述目的生物中 ： 将所述 GmVP 基因插入 pGFPGUSplus 载体的多克隆位点得到的重组质粒。所述目的基因具体可为 GUS 基因。 0025 所述 GmVP 基因作为筛选基因的应用也属于本发明的保护范围。 0026 以上任一所述方法均可用于植物育种。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。 。

16、所述双子叶植物可为大豆属植物， 具体可为大豆属大豆， 如文丰 7 号。 0027 GmVP 蛋白属于植物氢离子焦磷酸酶类， 将 GmVP 基因导入大豆后， 可能显著显加转 基因大豆发状根系对盐胁迫的耐受性。基于上述原理， GmVP 基因可用于培育耐盐转基因植 物， 也可用作筛选基因 （用于转基因材料创制过程中转基因材料的筛选， 即将 GmVP 基因和 目的基因构建重组表达载体， 导入植物后， 通过耐盐性筛选转目的基因的植物） 。本发明为 通过分子手段培育和创制耐盐转基因材料和品种提供了依据， 将在植物耐盐性的遗传改良 中发挥重要作用。本发明对于植物育种 （特别是大豆育种） 具有重大价值。 附图。

17、说明 0028 图 1 为实施例 1 中的琼脂糖凝胶电泳图。 0029 图 2 为重组质粒丙的结构示意图。 0030 图 3 为实施例 3 中的琼脂糖凝胶电泳图。 0031 图 4 为实施例 5 中的发状根耐盐鉴定照片。 0032 图 5 为实施例 6 中的 GUS 染色结果。 具体实施方式 0033 以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试验材料， 如无特殊说明， 均为自 常规生化试剂商店购买得到的。 以下实施例中的定量试验， 均设置三次重复实验， 结果取平 均值。下述实施例中的引物合成及测序工作均。

18、由深圳华大公司完成。 0034 文丰 7 号 （大豆耐盐品种） ： 山东省农业科学院作物所于 1963 年以莒选 23 为母 本， 齐黄 1 号为父本进行杂交， 经济宁地区农科所鉴定而育成， 1971 年定名为文丰 7 号， 品 种编号为 “鲁 1707” ， 文丰 7 号在国家农作物种质保存中心 （依托单位为中国农业科学院作 物科学研究所） 长期保存， 可免费提供给国内从事大豆科研工作的研究人员使用 ； 提及 “文 丰 7 号” 的参考文献 ： 邵桂花 , 万超文 , 李舒凡 . 大豆萌发期耐盐生理初步研究 . 作物杂 志 ,1994,(6):25-27 ； 由中国农业科学院作物科学研究所提。

19、供给申请人。 0035 pGFPGUSplus 载体 ： 公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得， 记载过该材 料的非专利文献是 ： Claudia E.Vickers,Peer M.Schenk,DongxueLi,et al.pGFPGUSPlus,a new binary vector for gene expression studies and optimising transformation systems in plants.Biotechnol Lett,2007,29:17931796。 说 明 书 CN 102796713 B 5 4/8 页 6 0036 发根农杆菌 。

20、K599 ： 公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得， 记载过该材料 的非专利文献是 ： Claudia E.Vickers,Peer M.Schenk,DongxueLi,et al.pGFPGUSPlus,a new binary vector for gene expression studies and optimising transformation systems in plants.Biotechnol Lett,2007,29:17931796。 0037 实施例 1、 GmVP 蛋白及其编码基因的发现 0038 一、 GmVP 序列片段的获得及证实 0039 通过盐胁迫抑。

21、制差减杂交文库获得 EST 序列， 进一步比对同源作物的基因组序 列， 设计特异性引物 M1 和 M2。 0040 将文丰 7 号在蛭石和营养土混合盆皿中培养至第一片真叶展开， 在 1/2hoagland 营养液中加入 0.9g/100mL NaCl， 水培法处理幼苗， 待 24 小时后取盐处理材料根系， 提取总 RNA， 并反转录为 cDNA， 以其为模板用 M1 和 M2 特异引物对进行 RT-PCR。 0041 特异引物序列如下 ： 0042 M 1:5 -ATGATGGAGGATGACATGGAG-3 ； 0043 M2:5 -TCACAGGAAGACTGGAGCCATT-3 。 00。

22、44 RT-PCR反应体系 ： Ex Taq Buffer 2l、 Ex Taq 0.2l、 dNTP Mix(2.5M)3.0l、 M1(10M)0.5l、 M2(10M)0.5l、 cDNA 2l、 ddH2O12.8l。 0045 PCR 程序 ： 94 4min ； 94 30s、 57 40s、 72 2.5min， 28 个循环 ； 72 5min。 0046 将 PCR 产物进行 1% 琼脂糖凝胶电泳。结果见图 1， 其中， M 为 DL2000 的 DNA 分子 量标准， 1 为 PCR 产物。将 PCR 产物进行测序， 结果表明， PCR 产物为 2406bp， 如序列表的序。

23、 列 2 所示， 编码序列表的序列 1 所示的蛋白质。 0047 将序列表的序列1所示的蛋白质命名为GmVP蛋白， 该蛋白具有离子焦磷酸酶活性 的功能区域。 0048 将编码 GmVP 蛋白的基因命名为 GmVP 基因， 其开放阅读框如序列表的序列 2 所示。 0049 实施例 2、 重组表达载体的构建 0050 一、 重组质粒甲和重组质粒乙的构建 0051 1、 随机选取PMD18-T simple载体 （购自TaKaRa公司， 目录号 ： D103A） 的一段序列， 设计特异引物对 F1 和 R1。 0052 F 1 ： 5 -GTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATG-3 ； 00。

24、53 R 1 ： 5 -CTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGC-3 。 0054 2、 以 PMD18-T simple 载体为模板， 用 F1 和 R1 组成的引物对进行 PCR 扩增， 得到 PCR 扩增产物。 0055 3、 将步骤2的PCR扩增产物插入PMD20-T载体 （购自TaKaRa公司， 目录号 ： D107A） ， 得到重组质粒甲。 0056 4、 用限制性内切酶Sac 和Xba双酶切重组质粒甲， 回收约1300bp的DNA片段 ( 该 DNA 片段如序列表的序列 3 所示 )。 0057 5、 用限制性内切酶 Sac 和 Xba 双酶切 pGFPGUSplus 载。

25、体， 回收载体骨架 （约 12935bp） 。 0058 6、 将步骤 4 回收的 DNA 片段与步骤 5 回收的载体骨架连接， 得到重组质粒乙。根 据测序结果， 对重组质粒乙进行结构描述如下 ： 用序列表的序列 3 自 5 末端第 7 至 1370 位 说 明 书 CN 102796713 B 6 5/8 页 7 核苷酸所示的双链 DNA 分子 （其中第 1365 至 1370 位核苷酸为 Kpn 酶切识别序列） 取代 了 pGFPGUSplus 载体 Xba 和 Sac 酶切位点之间的小片段。 0059 二、 重组质粒丙的构建 0060 1、 合成序列表的序列 2 所示的双链 DNA 分子。

26、。 0061 2、 以步骤 1 合成的双链 DNA 分子为模板， 用 F2 和 R2 组成的引物对进行 PCR 扩增， 得到 PCR 扩增产物。 0062 F2 ： 5 -gcTCTAGAATGATGGAGGATGACATGGAG-3 （下划线标注 Xba 酶切识别序列） ； 0063 R2 ： 5 -ccGGTACCTCACAGGAAGACTGGAGCCATT-3 （下划线标注 Kpn 酶切识别序 列） 。 0064 3、 用限制性内切酶Xba和Kpn 双酶切步骤2的PCR扩增产物， 回收酶切产物。 0065 4、 用限制性内切酶 Xba 和 Kpn 双酶切重组质粒乙， 回收载体骨架 （约 。

27、13000bp） 。 0066 5、 将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接， 得到重组质粒丙 （又称重组质粒 pGUS-GmVP)。 根据测序结果， 对重组质粒丙进行结构描述如下 ： 用序列表的序列2所示的双 链DNA分子取代了重组质粒乙Xba和Kpn 酶切位点之间的小片段 （事实上， 重组质粒乙 的构建仅是为了在 pGFPGUSplus 载体的 Sac 前添加 Kpn 酶切位点） 。重组质粒丙的结 构示意图见图 2。 0067 实施例 3、 转基因材料 （转基因发状根） 的获得 0068 一、 制备重组农杆菌 0069 1、 用重组质粒 pGUS-GmVP 转化发根农杆菌 K599 感受。

28、态细胞， 得到重组农杆菌。 0070 2、 将重组农杆菌接种于 YEP 液体培养基 （含卡那霉素 50mg/L） ， 28、 270rmp 振荡 培养， 得到 OD600=0.6-0.8 的重组农杆菌菌液。 0071 二、 制备遗传转化用外植体 0072 1、 灭菌 0073 取无病虫害和斑点、 饱满、 均一、 干燥的文丰 7 号种子， 完全平铺在培养皿中， 加盖 培养皿盖并封口， 然后将培养皿放入干燥器中 ； 然后在干燥器中放入 100ml 容量的烧杯， 倒 入 80ml 次氯酸钠水溶液 （次氯酸钠浓度为 12M， 次氯酸钠购自北京益利精细化学品有限公 司） ， 再慢慢加入 4ml 浓盐酸 。

29、； 然后迅速盖上干燥器， 用凡士林密封， 放置 12-16h。 0074 2、 灭菌结束后， 取出培养皿， 在超净台中打开培养皿盖， 释放残余氯气 ； 然后用镊 子夹取种子， 在超净台中接种于发芽培养基上， 盖上培养皿但不封口， 在温度为 24， 光量 子为 150mol/m2s 的培养间培养 5d（每天光照 16 小时， 黑暗 8 小时） 。 0075 发芽培养基 （pH5.7） ： 溶剂为水， 溶质及其浓度如下 ： 3.12g/L B5 盐 （购自 Phytotech 公司， 货号 M524） 、 30g/L 蔗糖 （购自北京化工有限公司） 、 7.5g/L 琼脂 （购自上海 生物工程股份。

30、有限公司， 货号 AN5255） 。 0076 3、 完成步骤 2 后， 取发芽良好的种子， 进行如下操作， 得到外植体 ： 用镊子剥去种 皮， 切除部分下胚轴 （剩余部分还保留 3-5mm 的下胚轴） ， 在剩余部分的子叶节点 （又称子叶 基部） 处平行划伤 5-7 次。 0077 三、 侵染 0078 将步骤二得到的外植体在步骤一制备的重组农杆菌菌液中浸泡 30min， 然后倒掉 说 明 书 CN 102796713 B 7 6/8 页 8 菌液， 将子叶内面 （平滑面） 向下平铺在铺有滤纸的 MSCCM 培养基上， 置于光照培养箱中培 养。培养条件 22培养 5d（每天光照 16 小时，。

31、 黑暗 8 小时） 。 0079 MSCCM 培养基 （pH5.4） ： 溶剂为水， 溶质及其浓度如下 ： 0.43g/L MS 盐 （购自 拜尔迪有限公司） 、 200mM 乙酰丁香酮 （购自 Sigma， 货号 D5545） 、 150mg/L 二硫苏糖醇 （DL-Dithiothreitol， DTT ； 购自 Sigma， 货号 D5545） 、 100mg/L 半胱氨酸 （拜尔迪公司） 、 30g/ L 蔗糖、 7.5g/L 琼脂、 3.9mg/L 2- 吗啉乙磺酸 （2-(4-Morphol ino)ethanesulfonic acid， MES ； 购自拜尔迪公司） 。 008。

32、0 四、 诱导发状根 0081 将经过共培养的外植体用 1/2MS 液体培养基清洗 3-4 遍， 再用 1/2MS 液体培养基 浸泡 30min， 然后倒掉培养基， 用滤纸吸干培养液 ； 然后将外植体内面 （平滑面） 斜向上插入 1/2MS 固体培养基 （含有 6mg/l 潮霉素 B， 潮霉素 B 购自 Sigma， 货号 HO654） 中， 透气膜封口， 然后在温度为24， 光量子为150mol/m2 s的培养间培养至发状根长出 （每天光照16小时， 黑暗 8 小时） 。 0082 1/2MS 液体培养基 （pH5.8） ： 溶剂为水， 溶质及其浓度如下 ： 2.17g/L MS 盐、 0.。

33、6mg/ LMES、 250mg/L 头孢霉素 （购自上海生物工程股份有限公司， 货号 CB1276） 、 250mg/L 羧苄青 霉素 （购自 INALCO， 货号 1758-9317） 、 30g/L 蔗糖。 0083 1/2MS 固体培养基 （pH5.8） ： 溶剂为水， 溶质及其浓度如下 ： 2.17g/L MS 盐、 0.6mg/ LMES、 250mg/L 头孢霉素、 250mg/L 羧苄青霉素、 75g/L 琼脂、 30g/L 蔗糖。 0084 五、 发状根 GUS 染色 （- 葡萄糖醛酸糖苷酶显色反应） 0085 切下发状根并将上部的一段浸入 GUS 染液中 （确保发状根根尖不。

34、损伤） ， 将发状根 下端按顺序平放于 1/2MS 固体培养基上， 在 37培养箱培养 1d， 显示蓝色即为 GUS 检测阳 性。 0086 GUS 染液的配制方法 ： 将 80ml 磷酸钠缓冲液、 1ml 铁氰化钾母液、 1ml 亚铁氰化钾 母液、 2ml EDTA 母液、 5ml x-Gluc 溶液和 20ml 甲醇混匀， 避光保存。 0087 x-Gluc 溶液 ； 将 100mg x-Gluc(-20保存 ) 溶于 5ml 二甲基亚砜。 0088 磷酸钠缓冲液 （pH7.0） ： 将 39ml A 液与 61ml B 液混合， 用蒸馏水定容至 400ml ； A 液 ： 将 3.12g。

35、 NaH2PO4.2H2O 溶于蒸馏水并用蒸馏水定容至 100ml（浓度为 0.2mol/L） ； B 液 ： 将 7.17g Na2HPO4.12H2O 溶于蒸馏水并用蒸馏水定容至 100ml（浓度为 0.2mol/L） 。 0089 铁氰化钾母液 ： 将 3.295g 铁氰化钾溶于蒸馏水并用蒸馏水定容至 200ml（浓度为 50mmol/L） ， 避光保存。 0090 亚铁氰化钾 ： 将 4.224g 亚铁氰化钾溶于蒸馏水并用蒸馏水定容至 200ml（浓度为 50mmol/L） ， 避光保存。 0091 EDTA 母液 （pH8.0） ： 称取 EDTA-Na22H2O 18.6g， 加入。

36、 6gNaOH， 用约 80ml 超纯水溶 解并定容为 100ml（终浓度为 0.5mol/L） 。 0092 六、 PCR 检测 0093 取 GUS 检测为阳性的发状根， 提取基因组 DNA 并以基因组 DNA 为模板用 F3( 对应 载体骨架 ) 和 R3（对于序列 2 中的部分片段） 组成的引物对进行 PCR 检测。 0094 F3 ： 5 -TCCTTCGCAAGACCCTTCCTC-3 ； 0095 R3 ： 5 -AACTGACACCCACATCCCTAC-3 ； 说 明 书 CN 102796713 B 8 7/8 页 9 0096 PCR 反应体系 ： Ex Taq Buff。

37、er 2l、 Ex Taq 0.2l、 dNTP Mix(2.5M)3.0l、 F3(10M)0.5l、 R3(10M)0.5l、 cDNA 2l、 ddH2O 12.8l。 0097 PCR 反应程序 ： 94 4min、 94 30s、 55 30s、 72 1min， 30 个循环 ； 72 5min。 0098 将 PCR 产物进行 1% 琼脂糖凝胶电泳。部分结果见图 3， 其中， M 为 DL2000 的 DNA 分子量标准， 1-5 为 PCR 检测为阳性样本 （目的片段大小约 600bp） ， CK- 为实施例 4 得到的 转空载体发状根， CK+ 为重组质粒丙。 0099 PC。

38、R 检测为阳性的发状根即为转基因发状根。 0100 实施例 4、 转空载体材料的获得 0101 用pGFPGUSplus载体代替重组质粒丙进行实施例3的操作， 得到转空载体发状根。 0102 实施例 5、 发状根的耐盐鉴定 0103 将转基因发状根、 转空载体发状根分别进行如下平行的分组处理 （每组处理中， 转 基因发状根和转空载体发状根各 10 个 ； 重复进行三次试验） ： 0104 第一组 ： 将发状根整齐摆放在 1/2MS 固体平板上 ； 0105 第二组 ： 将发状根整齐摆放在含 50mmol/L NaCl 的 1/2MS 固体平板上 ； 0106 第三组 ： 将发状根整齐摆放在含 。

39、100mmol/L NaCl 的 1/2MS 固体平板上 ； 0107 第四组 ： 将发状根整齐摆放在含 150mmol/L NaCl 的 1/2MS 固体平板上 ； 0108 第五组 ： 将发状根整齐摆放在含 200mmol/L NaCl 的 1/2MS 固体平板上 ； 0109 各组处理均在温度为 24， 光量子为 150mol/m2s 的光照培养箱中培养 15d（每 天光照 16 小时， 黑暗 8 小时） ， 观察发状根长势， 拍照并统计每个处理下发状根的伸长量 （即 与处理的初始时刻相比， 培养 15 天后发状根的生长量） 。 0110 培养 15 天后的照片见图 4。 0111 培养。

40、 15 天后， 第一组至第五组转基因发状根的伸长量依次为 5.06 厘米、 3.95 厘 米、 1.81 厘米、 1.81 厘米和 0.38 厘米。第一组至第五组转空载体发状根的伸长量依次为 5.72 厘米、 2.38 厘米、 1.19 厘米、 0.31 厘米和 0.16 厘米。 0112 计算培养 15 天后， 与第一组相比， 其它几组发状根的相对伸长率。结果见表 2 （三 次试验的平均值） 。 0113 表 2 发状根在不同浓度 NaCl 胁迫下的相对伸长率 （%） 0114 0115 在50、 100、 150、 200mM NaCl处理下转基因的发状根相对伸长率分别为转空载体发 状根的。

41、 1.87、 1.72、 6.46、 2.71 倍， 即转基因发状根在盐胁迫条件下可以维持较高根系伸长 量， 表现为极显著差异。结果表明， GmVP 基因能提高大豆根系在盐胁迫下的生长量， 有助于 提高大豆的耐盐性。 0116 实施例 6、 GmVP 基因作为筛选标记的应用 0117 本实施例中， 将 GUS 基因作为目的基因， GmVP 基因作为筛选基因。 0118 一、 制备重组农杆菌 说 明 书 CN 102796713 B 9 8/8 页 10 0119 同实施例 3 的步骤一。 0120 二、 制备遗传转化用外植体 0121 同实施例 3 的步骤二。 0122 三、 侵染 0123 。

42、同实施例 3 的步骤三。 0124 四、 筛选转基因发状根 0125 1、 将经过共培养的外植体用 1/2MS 液体培养基清洗 3-4 遍， 再用 1/2MS 液体培养 基浸泡 30min， 然后倒掉培养基， 用滤纸吸干培养液。 0126 2、 完成步骤 1 后， 随机取 60 个外植体， 随机分成两组， 每组 30 个， 分别进行如下处 理 ： 0127 实验组 ： 将外植体内面斜向上插入 1/2MS 固体培养基 （含 100mmol/L NaCl） 中， 透 气膜封口， 然后在温度为24， 光量子为150mol/m2.s的培养间培养8天 （每天光照16小时， 黑暗 8 小时） ； 0128。

43、 对照组 ： 将外植体内面斜向上插入 1/2MS 固体培养基中， 透气膜封口， 然后在温度 为 24， 光量子为 150mol/m2s 的培养间培养 8 天 （每天光照 16 小时， 黑暗 8 小时） ； 0129 每组随机选择 20 个发状根进行 GUS 染色， 统计阳性率。 0130 部分染色照片见图5， 其中CK为对照组得到的某个发状根的照片 （GUS染色结果为 阴性） ， 1-5 为实验组得到的某 5 个发状根的照片 （GUS 染色结果均为阳性） 。 0131 进行三次重复实验。对照组三次试验的阳性率分别为 16%， 20% 和 18%。实验组三 次实验的阳性率分别为75%、 78%和。

44、80%。 结果表明100mmol/L NaCl筛选能明显提高发状根 的阳性率， 即 GmVP 蛋白或其编码基因能作为选择标记应用于转基因发状根的筛选中。 0132 实际应用中， 可以将 GmVP 基因作为筛选标记， 与目的基因共转染出发植物， 然后 通过盐浓度筛选含有目的基因的转基因植物。 说 明 书 CN 102796713 B 10 1/7 页 11 0001 0002 序 列 表 CN 102796713 B 11 2/7 页 12 0003 序 列 表 CN 102796713 B 12 3/7 页 13 0004 序 列 表 CN 102796713 B 13 4/7 页 14 0005 序 列 表 CN 102796713 B 14 5/7 页 15 0006 序 列 表 CN 102796713 B 15 6/7 页 16 0007 序 列 表 CN 102796713 B 16 7/7 页 17 序 列 表 CN 102796713 B 17 1/2 页 18 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102796713 B 18 2/2 页 19 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 102796713 B 19 。