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1、(10)申请公布号 CN 103898168 A (43)申请公布日 2014.07.02 CN 103898168 A (21)申请号 201410018638.8 (22)申请日 2014.01.16 C12P 7/18(2006.01) C12R 1/22(2006.01) (71)申请人 华东理工大学 地址 200237 上海市徐汇区梅陇路 130 号 (72)发明人 宫衡 高黎荣 蒋潇 付水林 (54) 发明名称 一种安全生产 1、 3- 丙二醇的方法 (57) 摘要 本发明公开了更安全地生产 1,3- 丙二醇的 方法， 即 ： 通过敲除克雷伯氏肺炎杆菌中大片段 连续出现的病毒基因群。
2、 VH1 或 （与） VH2 中的基 因， 从而提高 1,3- 丙二醇发酵的安全性。相比 现有的转化甘油生产 1,3- 丙二醇的方法， 本发 明的方法的优点是 ： 大片段敲除了克雷伯氏杆菌 K.pneumoniae 中潜在的致病基因， 提高克雷伯氏 肺炎杆菌的生物安全性。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 17 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 序列表17页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103898168 A CN 103898168 A 1/1 页 2 1. 一种更安全转化甘油生。
3、产 1, 3- 丙二醇的方法， 其特征在于， 通过敲除克雷伯氏肺 炎杆菌中大片段连续出现的致病基因群 VH1 或 （与） VH2 的致病基因， 从而提高 1,3- 丙二醇 发酵的安全性。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述的VH1与VH2基因群包含的致病基因 为 ： VH1 ： 包含连续的潜在治病基因fepA、fes、ychP、entF、fepC、fepG、fepD、entS、fepB、 entC、entE、entB、entA， 分别对应 SEQ ID NO 1 至 SEQ ID NO 13 ； VH2 ： 包含连续的潜在治病基因 fimB、fimE、fimA、fimI、fim。
4、C、fimD、fimF、fimG、fimH， 分别对应 SEQ ID NO 14 至 SEQ ID NO 22。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 克雷伯氏菌中VH1与VH2致病基因群中的 致病基因是连续且按特定的顺序与方向排列的 （附图 1 与 2） ， 且各基因与对应的基因 （SEQ ID NO 1 至 SEQ ID NO 22) 的蛋白序列相似度大于 60。 4. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 敲除克雷伯氏肺炎杆菌中大片段连续出 现的致病基因群 VH1 或 （与） VH2 是指 ： 敲除 VH1 与 VH2 中所包含致病基因的两个以上 （含两 个） 至所有基因。
5、的任何一种方式。 5. 根据权利要求 1 4 中任一项所述的方法， 其特征在于， 所述用于转化甘油生成 1, 3- 丙二醇的菌株为克雷伯氏肺炎杆菌K. pneumoniae。 权 利 要 求 书 CN 103898168 A 2 1/5 页 3 一种安全生产 1、 3- 丙二醇的方法 0001 技术领域 0002 本发明属于生物工程技术领域， 具体地说， 即 ： 敲除克雷伯氏肺炎杆菌中引起潜在 致病性的大片段基因， 从而提高 1,3- 丙二醇发酵的安全性， 同时对生产性能没有影响。 0003 背景技术 0004 1, 3- 丙二醇 （1, 3-porpanediol， 简称 1, 3-PD） 。
6、是一种重要的化工原料， 可用作 溶剂、 抗冻剂或保护剂、 精细化工原料以及新型聚醋聚对苯二甲酸丙二醇醋 （PTT） 和聚 氨醋的单体。PTT 已被证明是一种性能优异的新型聚酯材料。现有的 1, 3-PD 生产法有化 学合成法和生物合成法。目前国际上 1, 3-PD 的合成主要是通过化学法进行的。但是相对 于化学合成法而言， 生物法合成 1, 3-PD 的条件更温和、 操作简单、 副产物少、 更绿色环保。 随着 1, 3-PD 需求量的日趋扩大， 对于 1, 3-PD 的生物合成法的研究已越来越受到国内外 研究人员的重视。 0005 生物合成法的主要路线是在生物催化剂的作用下将甘油转化为 1, 。
7、3-PD。目前， 自然界中能将甘油转化为 1, 3-PD 的微生物大致包括 ： 克雷伯氏肺炎杆菌 （Klebsiella pneumoniae） 、 弗氏柠檬菌 （Citrobacter freundii） 、 丁酸梭状芽孢杆菌 （Clostridia butyricum） 等等。 其中克雷伯氏杆菌因生物转化效率高、 生物转化过程操作方便， 研究应用 最多。 0006 如 ： 1、刘 德 华 等，一 种 发 酵 生 产 1, 3-PD 的 高 产 工 艺 （申 请 号 ： CN200710063347.0） ， 该方法以中间代谢产物 3- 羟基丙醛为控制指标来促进微生物 合成 1, 3-PD 。
8、； 2、 杜铭等， 氧化还原电势调控厌氧发酵生产 1, 3-PD 方法 ( 申请号 ： CN200410048122.8)， 该方法通过调控发酵体系的氧化还原电势来促进微生物合成 1, 3-PD。3、 宫衡等， 一种转化甘油生产 1, 3-PD 的方法 （专利号 ： ZL20071008） , 该方法通过控 制渗透压来促进微生物合成 1, 3-PD。 0007 上述方法无一例外的都利用克雷伯氏肺炎杆菌 （K. pneumoniae） 。但是应用克雷 伯氏肺炎杆菌必须考虑的问题就是该菌的生物安全性。 克雷伯氏肺炎杆菌是一种条件致病 菌， 是引起人体细菌感染的常见微生物。 克雷伯氏肺炎杆菌中一些菌。
9、株是高度危险的， 例如 最近 Shon 报道的一株克雷伯氏肺炎杆菌， 能感染体质好的年青人并危及生命 （Virulence 2013(4),107-118） 。 目前， 有关克雷伯氏肺炎杆菌致病性的研究有不少， 一些致病基因， 如 ： magA, alls, rmpA, mrkD, kfu, cf29a, fim, uge, wabG, ureA也陆续在克雷伯氏菌中发 现， 其中magA被认为是肺炎克雷伯菌中强力的致病基因。因而目前减少克雷伯氏菌致病性 的方法主要是也是针对上述这些单个的基因 (Appl Microbiol Biot 2013(97), 1997)。 0008 但是研究证据表明。
10、， 上述基因在克雷伯氏肺炎杆菌中出现的频率与其致病性 关联不大， 以上述基因来区分各种克雷伯氏肺炎杆菌致病性的强弱是不够的 （Environ 说 明 书 CN 103898168 A 3 2/5 页 4 Microbiol,2004(6),584-590） 。因此， 仅仅敲除上述单个基因显然不能从根本上解除人们 应用克雷伯氏肺炎杆菌生产 1,3-PD 时， 对其致病性的担忧。 发明内容 0009 本申请的发明人在研究中发现， 克雷伯氏肺炎杆菌中， 一些潜在的致病基因是连 续出现， 并在基因组上形成比较大的片段， 其中 VH1、 VH2 片段普遍存在在克雷伯氏肺炎杆 菌中。分析 VH1、 VH2。
11、 发现这些片段中的基因都是潜在能够引起致病的基因。这些连续、 呈 大片段出现的致病基因群， 目前还未见有研究报道。 0010 本发明目的在于提供一种更安全的利用克雷伯氏菌生产 1,3-PD 的方法， 即 ： 将克 雷伯氏肺炎杆菌中 VH1、 VH2 大片段基因群敲除， 从而更好地降低克雷伯氏肺炎杆菌的潜在 致病性。 0011 本发明一种更安全生产 1,3-PD 的方法， 包括种子培养以及发酵罐发酵转化甘油 生成 1, 3-PD， 该方法敲除基因中连续的大片段致病基因群 VH1、 VH2 以提高克雷伯氏肺炎 杆菌的安全性， 从而更安全地发酵生产 1,3-PD。 0012 根据本发明， 所述 VH。
12、1、 VH2 大片段病毒基因群具体如下 ： 1） VH1 ： 包含连续的潜在致病基因fepA、fes、ychP、entF、fepC、fepG、fepD、entS、fepB、 entC、entE、entB、entA， 分别对应 SEQ ID NO 1 至 SEQ ID NO 13。 0013 2） VH2 ： 包含连续的潜在致病基因 fimB、fimE、fimA、fimI、fimC、fimD、fimF、fimG、 fimH， 分别对应 SEQ ID NO 14 至 SEQ ID NO 22。 0014 3） SEQ ID NO 1 至 SEQ ID NO 22 数据库来源 ：fepA、fes、f。
13、epC、fepG、fepD、entS、 entC、entE、entB、entA、 fimB、fimE、fimA、fimI、fimC、fimD、fimF、fimG、fimH的基因序列 来源于大肠杆菌 ；ychP、entF、 fepB基因序列来源于克雷伯氏肺炎杆菌。 0015 根据本发明， 用于转化甘油生成 1, 3-PD 的菌株为克雷伯氏肺炎杆菌 （K. pneumoniae） 。相比现有的转化甘油生产 1, 3-PD 的方法， 本发明的方法的优点是 ： 大片段 敲除了克雷伯氏肺炎杆菌 （K. pneumoniae） 中潜在的致病基因群 VH1 或 （与） VH2 的部分或 全部， 提高了 1,。
14、3-PD 生产的安全性能。 附图说明 0016 图 1 ： VH1 大片段中致病基因的排列与方向。 0017 图 2 ： VH2 大片段中致病基因的排列与方向。 具体实施方式 0018 以下结合具体实施例， 对本发明作进一步详细说明。 应理解， 以下实施例仅用于说 明本发明， 而非用于限定本发明的范围。 0019 实施例 1、 VH1 与 VH2 所包含的基因是潜在的致病基因 将 VH1 与 VH2 中基因序列与现有的病毒基因库比对， 病毒基因库可至中国医学科学院 病原生物学研究所， 卫生部病源系统生物学重点实验室的收集整理的病毒基因数据库中查 询 （ 。 查询结果可见， 大片段VH1、 VH。
15、2中所包含的基 因， 除了fes、ychP、entS外， 其它基因均已经被已有的研究证实是致病基因， 最初发现于大 说 明 书 CN 103898168 A 4 3/5 页 5 肠杆菌。 0020 实施例 2、 在已报道的克雷伯氏肺炎杆菌基因组中含有 VH1,VH2 大片段且高度同 源 表 1 ： VH1 片段在已报道克雷伯氏基因组中的分析 将 SEQ ID NO 1 至 SEQ ID NO 22 的基因数据转换成蛋白数据并与 NCBI （http:/www. ncbi.nlm.nih.gov/）上已报道的克雷伯氏基因组数据同源比对， 具体比对的基因组为 ： NC_017540、 NC_011。
16、283、 NC_016845、 NC_018522、 NC_012731、 NC_009648。 0021 表 2 ： VH2 片段在已报道克雷伯氏基因组中的分析 比对后在各基因组上对 SEQ ID NO 1 至 SEQ ID NO 22 中的基因定位。具体基因数据 查找、 比对、 基因定位采用分子生物学中的通用方法， 再此不再叙述。比对定位结果见表 1 与表 2。从表 1 与表 2 中可以看出各克雷伯氏肺炎杆菌的基因组中含有 VH1 与 VH2 大片段 区域， VH1 与 VH2 大片段区域中各基因组所包含的基因是相同的， 且与 SEQ ID NO 1 至 SEQ 说 明 书 CN 1038。
17、98168 A 5 4/5 页 6 ID NO 22 中对应的致病基因高度同源 （蛋白序列相识度在 65 -100之间） 。各致病基因 在各克雷伯氏肺炎杆菌组 VH1 与 VH2 上不但位置相同， 而且方向也一样。 0022 实施例 3、 VH1 与 VH2 基因片段在产 1,3-PD 克雷伯氏肺炎杆菌中中也存在 产 1,3-PD 菌株采用 ATCC49790。VH1 的上下游引物分别来源于基因fepA（SEQ ID NO 1） 的上游与基因entA（SEQ ID NO 13） 的下游。VH2 的上下游引物分别来源于基因fimB （SEQ ID NO 14） 的上游与基因fimH（SEQ ID。
18、 NO 22） 的下游。 0023 将 ATCC49790 于 LB 培养基 （0.5% 酵母提取物， 1% 胰蛋白胨， 1% NaCl， pH 7.0） 中 37培养过夜， 抽提基因组。以抽提好的 ATCC49790 基因组为模板， 用设计好的 VH1 与 VH2 上下游引物进行 PCR 反应， PCR 反应结束后胶回收目的条带并测序， 测序后对目的条带进行 基因分析。 0024 分析结果如表 3 所示。从表 3 中可以看出， ATCC49790 的基因组中包含 VH1 （17678bp） 和 VH2 （8761bp） 片段， 其片段上所含的基因与 VH1,VH2 数据库中的病毒基因 （SE。
19、Q ID NO 1 至 SEQ ID NO 22） 高度同源。 0025 表 3 ： ATCC49790 上 VH1、 VH2 分析结果 实施例 4、 敲除 VH1、 VH2 的克雷伯氏菌在 5L 发酵罐中发酵生产 1,3-PD 斜面培养基的配方如下 ： K2HPO4 3H2O 7 g/L，（NH4） 2SO4 1 g/L， KH2PO4 2 g/L， MgCl2 7H2O 0.1 g/L， 酵母膏 7 g/L， 微量元素各 0.3mL， 调整 pH 7.0， 琼脂 2 g/L。 0026 种子培养基的配方如下 ： K2HPO4 3H2O 7 g/L，（NH4） 2SO4 1 g/L， KH2。
20、PO4 2 g/L， MgCl2 7H2O 0.1 g/L， 酵母膏 7 g/L， 微量元素各 0.3mL， 调整 pH 7.0 后加入 NaCl 调节渗透压。 0027 发酵罐培养基的配方如下 ： KCl 0.75 g/L， NaH2PO4 1.38 g/L，（NH4） 2SO4 5.35 g/L， Na2SO4 0.28 g/L， MgSO4 6H2O 0.26 g/L， 柠檬酸 0.42 g/L， 酵母粉 2 g/L， 微量元素各 0.3mL， 调整 pH 7.0。 0028 微量元素的配方如下 ： ZnCl2 34.2 g/L， FeCl3 6H2O 2.7g/L， MnCl2 4H2。
21、O 10 g/L， CuCl2 2H2O 0.85 g/L， CoCl2 2H2O 23.8 g/L， H3BO3 0.31 g/L， Na2MoO4 0.25 g/L 实施例中， 测定发酵液中菌体干重的方法如下 ： 取 1.0mL 发酵液稀释 710 倍， 以去离子水为对照， 在 721 分光光度计上于 620nm 读取 说 明 书 CN 103898168 A 6 5/5 页 7 OD。取不同菌浓 （即不同 620nm 吸光值） 的菌液 10mL， 经离心收集菌体， 并用去离子水洗涤 二遍洗涤， 将再次离心收集后的菌体于 80烘箱中干燥至恒重。称量菌体作出菌体干重与 OD620的标准曲线，。
22、 并回归出关系式。以后菌体的干重根据测定的菌液的OD620值由标准曲线 回归关系式计算得出。 0029 1, 3-PD 的生成速率定义为 ： 每小时每升发酵液生成的 1, 3-PD 克数单位为 g/ Lh。 0030 按照实施例 3 的方法获得 K. pneumoniae ATCC49790 中 VH1,VH2 的基因片段， 用 同源重组办法， 敲除 ATCC49790 基因组的 VH1 （17678 bp) 或 （与） VH2 (8761 bp)， 获得的重 组菌分别为 ATCC49790 VH1、 ATCC49790 VH2、 ATCC49790 VH1VH2。 0031 发酵实验如下 ：。
23、 将菌株 （ATCC49790 VH1 、 ATCC49790 VH2、 ATCC49790 VH1VH2） 接入 250ml 的摇瓶 （装液量 50ml） 进行种子培养 20 小时， 后接入 5L 发酵罐中 （发酵液装液量 2L） ， 按照如下所示的工艺条件控制发酵过程。 0032 初始甘油浓度 60g/L， 发酵温度 35 ； 通气量 1.0vvm ； 搅拌转速 20rpm ； 在发酵过 程中通过加入 NaOH 溶液控制 pH 值为 5.5 7.5。在发酵的各个时期通过补入不同浓度甘 油溶液控制甘油浓度在 10 60g/L， 发酵 30 小时结束。 0033 对照实验为研究出发菌种K. p。
24、neumoniae ATCC49790， 发酵结果表 4 所示 ： 表 4 ： 各菌株发酵结果 菌株1,3-PD 产量 （g/L)1,3-PD 生产强度 (g/L.h) K.pneumoniaeATCC49790622.1 K.pneumoniaeATCC49790 VH1632.1 K.pneumoniaeATCC49790 VH2612.0 K.pneumoniaeATCC49790 VH1VH2622.1 从表2中可以看出， 同出发菌株K. pneumoniae ATCC49790相比， 敲除病毒基因群VH1、 VH2 的菌株， 在更安全性的同时， 1,3-PD 的产量和生产效率均没有降。
25、低。 说 明 书 CN 103898168 A 7 1/17 页 8 0001 0002 序 列 表 CN 103898168 A 8 2/17 页 9 0003 序 列 表 CN 103898168 A 9 3/17 页 10 0004 序 列 表 CN 103898168 A 10 4/17 页 11 0005 序 列 表 CN 103898168 A 11 5/17 页 12 0006 序 列 表 CN 103898168 A 12 6/17 页 13 0007 序 列 表 CN 103898168 A 13 7/17 页 14 0008 序 列 表 CN 103898168 A 14 。
26、8/17 页 15 0009 序 列 表 CN 103898168 A 15 9/17 页 16 0010 序 列 表 CN 103898168 A 16 10/17 页 17 0011 序 列 表 CN 103898168 A 17 11/17 页 18 0012 序 列 表 CN 103898168 A 18 12/17 页 19 0013 序 列 表 CN 103898168 A 19 13/17 页 20 0014 序 列 表 CN 103898168 A 20 14/17 页 21 0015 序 列 表 CN 103898168 A 21 15/17 页 22 0016 序 列 表 CN 103898168 A 22 16/17 页 23 0017 序 列 表 CN 103898168 A 23 17/17 页 24 序 列 表 CN 103898168 A 24 1/1 页 25 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103898168 A 25 。