2位和/或27位取代的桦木酸衍生物及其制备方法和用途.pdf

本发明属于化学药物领域，具体涉及2位和/或27位取代的桦木酸衍生物及其制备方法和用途。本发明提供了一种2位和/或27位取代的桦木酸衍生物，其结构如式Ⅰ所示。本发明还提供了上述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物的制备方法和用途。本发明提供的2位和/或27位取代的桦木酸衍生物均具有良好的安全性，在抗肿瘤、抗脏器纤维化、调节免疫、抗消化道炎症和溃疡，以及抗真菌等多方面具有明确药效，为制备治疗上述作用相关疾病的药物提供了新的选择。

1.2位和/或27位取代的桦木酸衍生物，其结构如式Ⅰ所示：其中，R、R独立地为-H、羟基、R、R、R独立地为-H、卤素、羟基、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基、乙酰氧基或乙酰基；X为氧、氮、硫或碳原子。 2.根据权利要求1所述的2位和/或27位取代的桦木酸衍生物，其特征在于：R、R独立地为-H、羟基、R、R、R独立地为-H、-F、-Cl、-Br、羟基、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、乙酰氧基或乙酰基；X为氧、氮、硫或碳原子。 3.根据权利要求2所述的2位和/或27位取代的桦木酸衍生物，其特征在于：R、R独立地为R、R、R独立地为-H、-F、-Cl、-Br、羟基、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、乙酰氧基或乙酰基；X为氧、氮、硫或碳原子。 4.根据权利要求3所述的2位和/或27位取代的桦木酸衍生物，其特征在于：R、R独立地为R、R、R独立地为-H、-F、-Cl、-Br、羟基、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、乙酰氧基或乙酰基；X为氧原子。 5.根据权利要求1所述的2位和/或27位取代的桦木酸衍生物，其特征在于：当R为时，其结构如式Ⅱ所示：其中，R为-H、羟基、R、R、R独立地为-H、卤素、羟基、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基、乙酰氧基或乙酰基；X为氧、氮、硫或碳原子。 6.根据权利要求5所述的2位和/或27位取代的桦木酸衍生物，其特征在于：R为-H、羟基、R、R、R独立地为-H、-F、-Cl、-Br、羟基、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、乙酰氧基或乙酰基；X为氧、氮、硫或碳原子；进一步优选的，R为R、R、R独立地为-H、-F、-Cl、-Br、羟基、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、乙酰氧基或乙酰基；X为氧、氮、硫或碳原子；更进一步优选的，R为R、R、R独立地为-H、-F、-Cl、-Br、羟基、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、乙酰氧基或乙酰基；X为氧原子。 7.根据权利要求1所述的2位和/或27位取代的桦木酸衍生物，其特征在于：当R为时，其结构如式Ⅲ所示：其中，R为-H、羟基、R、R、R独立地为-H、卤素、羟基、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基、乙酰氧基或乙酰基；X为氧、氮、硫或碳原子。 8.根据权利要求7所述的2位和/或27位取代的桦木酸衍生物，其特征在于：R为-H、羟基、R、R、R独立地为-H、-F、-Cl、-Br、羟基、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、乙酰氧基或乙酰基；X为氧、氮、硫或碳原子；进一步优选的，R为R、R、R独立地为-H、-F、-Cl、-Br、羟基、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、乙酰氧基或乙酰基；X为氧、氮、硫或碳原子；更进一步优选的，R为R、R、R独立地为-H、-F、-Cl、-Br、羟基、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、乙酰氧基或乙酰基；X为氧原子。 9.权利要求1～8任一项所述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物药学上可接受的盐。 10.权利要求1～8任一项所述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物药学上可接受的水合物。 11.一种药物组合物，是由权利要求1～8任一项所述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物添加药学上可以接受的辅助性成分制备而成的。 12.权利要求1～8任一项所述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物、权利要求10所述的盐或权利要求11所述的水合物在制备具有抗纤维化药物中的用途。 13.权利要求1～8任一项所述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物、权利要求10所述的盐或权利要求11所述的水合物在制备具有抗真菌活性药物中的用途。 14.权利要求1～8任一项所述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物、权利要求10所述的盐或权利要求11所述的水合物在制备具有抗肿瘤活性药物中的用途。 15.权利要求1～8任一项所述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物、权利要求10所述的盐或权利要求11所述的水合物在制备具有双向免疫调节作用的药物中的用途。 16.权利要求1～8任一项所述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物、权利要求10所述的盐或权利要求11所述的水合物在制备具有抗消化道炎症及溃疡的药物中的用途。

技术领域

本发明属于化学药物领域，具体涉及2位和/或27位取代的桦木酸衍生物及其制备方法和用途。

背景技术

桦木酸(betulinic acid)为羽扇豆烷型五环三萜类化合物，广泛分布于鼠李科、桃金娘科、桦木科等多种植物中，但普遍含量较低。由于桦木酸的母环结构较大，使得其分子极性较小，脂溶性较大。因此，桦木酸在水中的溶解度较小，易溶于乙醚，氯仿、乙醇等有机溶剂。桦木酸对黑素瘤细胞具有极强的选择性细胞毒性(Pisha E,Chai H,Lee I S,et al.Discovery ofbetulinic acid as a selective inhibitor of human melanoma that functions by induction of apoptosis[J].Nat Med,1995,1(10):1046-1051)；诱导初级胶质母细胞瘤细胞凋亡率远远高于长春新碱和亚硝基脲(Jeremias I,Steiner H H,Benner A,et al.Cell death induction by betulinic acid,ceramideand TRAIL in primary glioblastoma multiforme cells[J].Acta Neurochir,2006,146(7):721-729)；能与许多细胞毒性化合物如多柔比星、紫杉醇、依托泊昔、放线菌素D联合用药，且具有协同作用，有望作为增效剂，用于肿瘤化学联合疗法，避免多药耐药性的产生，增强抗肿瘤药的治疗效果(Eder-Czembirek C,Czembirek C,Erovic B M,et al.Combination of betulinicacid with cisplatin-different cytotoxic effects in two head and neck cancer cell lines[J].Oncol Rep,2005,14(3):667-671)；能在病毒生命周期的几乎全部环节抑制H9淋巴细胞中HIV的复制(Mayaux J F,Bousseau A,Pauwels R,et al.Triterpene derivatives that block entry of humanimmunodeficiency virus type 1into cells[J].Pro Nat Acad Sci,1994,91(9):3564-3568)。此外，桦木酸还具有免疫调节、抗炎、抗氧化应激、抗菌、抗寄生虫、抗疟疾及抗溃疡等多种活性(易金娥,邬静,文利新,等.桦木酸的药理作用研究进展.中草药,2014,45(14):2118-2124)。随着对桦木酸药理活性的认识不断加深，不少研究者尝试以桦木酸为母核进行结构修饰，以求提高其溶解度，增加其生物利用度，降低其毒性。对桦木酸的结构修饰主要集中在三个位置：C-3位、C-20位和C-28位。

在文献《桦木酸及其衍生物的研究进展》(李丹,周金培,吴晓明.[J].药学进展,2004，28(3):120-125)中：

(1)对3位羟基的改造一般是以吡啶作溶剂，与各种环状二酸酐反应，合成末端带羧酸基的酯。这一类型的改造还是比较成功的。如表1所示，化合物3、4、5与桦木酸相比，活性大大增强。说明该类型的酰基可能增强抗HIV活性。对桦木酸及其类似物白桦素3位羟基 的其它改造，如将β位羟基改为α位、羟基改为羰基、醇改为酰胺等，大都造成活性增强。说明发挥活性时关键的氢键反应可能与3β位的氧相关。其中，化合物3(DSB，又称YK-FH312)，尤其引人注目。Taisei Kanamoto等的研究结果显示，YK-FH312可能是通过作用于病毒粒子装配和(或)病毒粒子出芽步骤实现抗HIV活性。

(2)对桦木酸19位异丙烯基的改造未得到很令人满意的结果。在30位上取代，活性保持，但酸性基团取代对活性明显有害；碳20位改为酮或肟，失活或活性降低；19位改为酰基或酸性基团，会导致失活。说明高电负性的氧原子可能改变桦木酸的静电性，使其细胞毒性降低。改造19位获得的唯一成功是二氢桦木酸(Dihydrobetulinic acid)及其衍生物。二氢桦木酸是HIV与细胞膜的融合抑制剂。它的抗HIV测定以H9细胞为感染模型，IC50为12.6μmol/L，EC50＝0.9μmol/L。以二氢桦木酸为先导物，经修饰后得到的化合物7的治疗指数为14000，抗HIV活性比其先导物高约1000倍。

(3)28位羧基是当前桦木酸的修饰热点，对其修饰得到的衍生物种类繁多。在近年的研究中，对28位羧基的结构改造以生物活性为指导，逐渐集中于将羧酸基转变成各种酰胺，而且在这些酰胺类衍生物中大多数的支链末端都保留了羧酸基。现将比较有代表性的化合物加以介绍。如表2所示，该类衍生物的酰胺链较短时活性不好。酰胺链较长的时候R＝CONH(CH2)m COOH,m＝7-11时活性有意义，m＝10时活性最强；R＝CONH(CH2)7CONH(CH2)nCOOH,n＝1-4时活性比前面m＝7、10都有提高；R＝CONH(CH2)7NHCO(CH2)n COOH，n＝1-3时活性又有提高。另外，可能因为胺部分和相邻质子相互作用对羧酸基起到空间定位的作用，链中第一个CONH,N上有取代，CONH变成NHCO或NHCONH，都失活。第二个CONH:①与小的α-氨基酸(该氨基酸包含1-2个甲基的亲脂性部分)相连，活性增加。②与邻位的苯甲酸相连，失活；与间位、对位的苯甲酸相连，IC50可达100nmol/L左右。③若CONH换成NHCO，活性便增强。该类衍生物中最著名的是RPR103611，它通过抑制病毒和细胞膜融合过程中的后结合，即包膜依赖性阶段来抑制HIV感染(IC50＝10nmol/L)，是目前唯一通过影响gp41来阻止HIV入侵的小分子非肽类物质，有希望开发成为HIV细胞膜融合剂。PRP103611的旋光异构体IC9564.(34.)在病毒感染性降低测定K NL4-3的IC90＝0.22±0.05μmol/L，显示出很强的抗HIV活性。而在IC9564的系列衍生物中，较突出的是化合物35(EC50＝0.33μmol/L)和36(EC50＝0.46μmol/L)，它们的活性与IC9564相当。研究显示，IC9564.能强力阻断HIV-1外壳介导的膜融合，从而在穿入步骤阻断HIV的复制。这个过程中的关键物质HIV-1gp120是IC9564作用的分子靶点。

在文献《23-羟基白桦酸衍生物抗肿瘤作用的三维定量构效关系及分子对接模式》(张婷婷，毕毅，陈蒙蒙等.[J].中国药学杂志,2014,49(14):1200-1203)中：23-羟基白桦酸衍生物 (结构如下图)也是五环三萜类化合物，是一种从中药白头翁中分离得到的白桦酸类似物，具有与白桦酸相当的抗肿瘤活性，但其作用机制目前正在研究之中。该实验室前期合成了大量的23-羟基白桦酸衍生物并对其进行了抗肿瘤活性研究，研究表明，28-COOH是影响该类化合物抗肿瘤活性的主要部位。

到目前为止，对C-3位羟基和C-28位羧基的改造已取得一定进展，但C-20位的结构修饰和改造尚缺乏令人满意的结果。其它位置取代的桦木酸衍生物则未见报道。

发明内容

本发明提供了一种2位和/或27位取代的桦木酸衍生物，其结构如式Ⅰ所示：

其中，R1、R2独立地为-H、羟基、

R3、R4、R5独立地为-H、卤素、羟基、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基、乙酰氧基或乙酰基；

X为氧、氮、硫或碳原子。

优选的，R1、R2独立地为-H、羟基、

R3、R4、R5独立地为-H、-F、-Cl、-Br、羟基、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、乙酰氧基或乙酰基；

X为氧、氮、硫或碳原子。

进一步优选的，R1、R2独立地为

R3、R4、R5独立地为-H、-F、-Cl、-Br、羟基、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、乙酰氧基或乙酰基；

X为氧、氮、硫或碳原子。

更进一步优选的，R1、R2独立地为

R3、R4、R5独立地为-H、-F、-Cl、-Br、羟基、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、乙酰氧基或乙酰基；

X为氧原子。

上述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物，当R1为时，其结构如式Ⅱ所示：

其中，R2为-H、羟基、

R3、R4、R5独立地为-H、卤素、羟基、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基、乙酰氧基或乙酰基；

X为氧、氮、硫或碳原子。

优选的，R2为-H、羟基、

R3、R4、R5独立地为-H、-F、-Cl、-Br、羟基、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、乙酰氧基或乙酰基；

X为氧、氮、硫或碳原子。

进一步优选的，R2为

R3、R4、R5独立地为-H、-F、-Cl、-Br、羟基、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、乙酰氧基或乙酰基；

X为氧、氮、硫或碳原子。

更进一步优选的，R2为

R3、R4、R5独立地为-H、-F、-Cl、-Br、羟基、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、乙酰氧基或乙酰基；

X为氧原子。

上述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物，当R2为时，其结构如式Ⅲ所示：

其中，R1为-H、羟基、

R3、R4、R5独立地为-H、卤素、羟基、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基、乙酰氧基或乙酰基；

X为氧、氮、硫或碳原子。

优选的，R1为-H、羟基、

R3、R4、R5独立地为-H、-F、-Cl、-Br、羟基、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、乙酰氧基或乙酰基；

X为氧、氮、硫或碳原子。

进一步优选的，R1为

R3、R4、R5独立地为-H、-F、-Cl、-Br、羟基、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、乙酰氧基或乙酰基；

X为氧、氮、硫或碳原子。

更进一步优选的，R1为

R3、R4、R5独立地为-H、-F、-Cl、-Br、羟基、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、乙酰氧基或乙酰基；

X为氧原子。

本发明还提供了上述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物的制备方法，包括以下步骤：

a、用95％wt乙醇浸提马甲子鲜叶2～4次，每次浸提24h，合并浸出液并过滤，滤液浓缩后得浸膏；再将浸膏在20％wt乙醇水溶液中超声溶解后，用乙酸乙酯萃取；

b、萃取的乙酸乙酯层浓缩后，经柱层析后得到粗品；所述柱层析洗脱液为石油醚与乙酸乙酯的混合溶液，其体积比依次为20︰1、15︰1、10︰1、5︰1、3︰1、1︰1；所述柱层析的显色剂为5％香草醛浓硫酸液；

c、上述粗品用70％wt乙醇和DMF加热溶解，过滤除去不溶物，滤液经制备液相色谱分离纯化，浓缩干燥得到2位和/或27位取代的桦木酸衍生物。

上述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物的制备方法中，步骤a所述马甲子鲜叶与95％wt乙醇的质量比为1︰10。

上述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物的制备方法中，步骤a所述浸膏与20％wt乙醇 水溶液的质量体积比(kg/L)为1︰10。

上述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物的制备方法中，步骤c所述的制备液相色谱采用乙酸-乙腈系统梯度洗脱纯化；所述乙酸-乙腈系统中乙酸的体积含量为3％～90％梯度增加。

本发明还提供了上述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物药学上可接受的盐。

本发明还提供了本发明化合物的前药，依据本发明，前药是上述化合物的衍生物，它们自身可能具有较弱的活性或甚至没有活性，但是在给药后，在生理条件下(例如通过代谢、溶剂分解或另外的方式)被转化成相应的生物活性形式。

本发明还提供了上述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物药学上可接受的水合物。

本发明还提供一种药物组合物，是由本发明提供的上述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物添加药学上可以接受的辅助性成分制备而成的。本发明提供的2位和/或27位取代的桦木酸衍生物结构如式Ⅰ～Ⅲ所示。

本发明还提供了上述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物、它的盐或水合物在制备具有抗纤维化药物中的用途。

本发明还提供了上述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物、它的盐或水合物在制备具有抗真菌活性药物中的用途。

本发明还提供了上述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物、它的盐或水合物在制备具有抗肿瘤活性药物中的用途。

本发明还提供了上述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物、它的盐或水合物在制备具有双向免疫调节作用的药物中的用途。

本发明还提供了上述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物、它的盐或水合物在制备具有抗消化道炎症及溃疡的药物中的用途。

本发明提供的2位和/或27位取代的桦木酸衍生物均具有良好的安全性，在抗肿瘤、抗脏器纤维化、调节免疫、抗消化道炎症和溃疡，以及抗真菌等多方面具有明确药效，为制备治疗上述作用相关疾病的药物提供了新的选择。

具体实施方式

式Ⅰ所示2位和/或27位取代的桦木酸衍生物的制备方法，包括以下步骤：

a、用95％wt乙醇浸提马甲子鲜叶2～4次，每次浸提24h，合并浸出液并过滤，滤液浓缩后得浸膏；再将浸膏在20％wt乙醇水溶液中超声溶解后，用乙酸乙酯萃取；

b、萃取的乙酸乙酯层浓缩后，经柱层析后得到粗品；所述柱层析洗脱液为石油醚与乙酸乙酯的混合溶液，其体积比依次为20︰1、15︰1、10︰1、5︰1、3︰1、1︰1；所述柱层析的显色剂为5％香草醛浓硫酸液；

c、上述粗品用70％wt乙醇和DMF加热溶解，过滤除去不溶物，滤液经制备液相色谱分离纯化，浓缩干燥得到2位和/或27位取代的桦木酸衍生物。

上述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物的制备方法中，步骤a所述马甲子鲜叶与95％wt乙醇的质量比为1︰10。

上述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物的制备方法中，步骤a所述浸膏与20％wt乙醇水溶液的质量体积比(kg/L)为1︰10。

上述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物的制备方法中，步骤c所述的制备液相色谱采用3％乙酸-乙腈系统梯度洗脱纯化；所述乙酸-乙腈系统中乙酸的体积含量为3％～90％梯度增加。

实施例1化合物1的制备

称取马甲子鲜叶4kg，10倍量95％乙醇分三次冷浸，每次浸提24h，合并浸出液并过滤，滤液减压浓缩后得浸膏。取浸膏300g加入20％的乙醇水液3L，超声溶解，依次用石油醚(1×3L)、乙酸乙酯(3×6L)萃取，分别取水层、石油醚层、乙酸乙酯层，上液相检测，结果显示目标成分大部分进入乙酸乙酯层，而水液中无目标成分、石油醚层有少量目标成分。

乙酸乙酯层浓缩至刚有固体析出，趁热倒出搅拌均匀并加少量乙酸乙酯溶解至无固体颗粒，取100-200目硅胶500g拌样，硅胶1.5kg湿法装柱，将拌样硅胶完全烘干后干法上样。分别吸取小样进行洗脱条件摸索，得出结果，采用石油醚/乙酸乙酯系统进行洗脱，TLC进行监测，显色剂为5％香草醛浓硫酸液。最初以石油醚/乙酸乙酯20：1洗脱液10L循环洗脱，层析柱上有一橙黄色带下移至距底端1/3处，此时开始以4L/瓶等流份收集并编号。第1-3瓶皆无斑点；从第4瓶开始将洗脱比例换作15：1；第5-6瓶开始出现较为明显的单点，点板结 果一致，合并，上液相进行检测，320nm下无明显吸收，非目标成分；第7瓶开始将洗脱比例换作10：1，至第12瓶点板显色为多个紫点，液相检测依然无明显吸收，非目标段；第13-14瓶点板显色有黄点出现，液相检测能观察到20min之前的两个峰；第15瓶将洗脱比例换作5：1，点板显色紫点消失，浅黄色斑点出现，液相检测无明显吸收，非目标段；第17瓶开始将洗脱比例换作3：1，点板显色绿点出现，液相检测无明显吸收，非目标段；，至第20瓶浅黄点、绿点消失，分别液相检测无明显吸收，非目标段；第21瓶开始，液相图谱上开始出现50min之后的多个峰，但30min前后的峰均未出现，至第25瓶洗脱比例换作1：1，点板显色绿点消失，液相检测依然为50min之后的多个峰；以洗脱比例1:1至第27瓶，液相检测目标段开始出现，至第32瓶，点板显色及液相检测目标段已完全洗脱下来。合并27-32瓶并浓缩，甲醇冲洗柱子，液相检测，目标段确认无残留。虽目标段相对独立地分离出来，然而50min以后的几个峰依然随着目标段出现，且目标段极性较大，预上制备液相进行分离。

目标段采用70％乙醇和少量DMF加热溶解，滤出不溶物，滤出固检测无目标峰，弃之，滤液过柱，纯化，采用3％HAc-ACN系统梯度洗脱纯化，收集目标峰，浓缩干燥得化合物1，液相检测纯度＞97.26％。

化合物1为土黄色粉末状固体。HREIMS m/z 779.4173[M-H](cal C48H60O9-H 779.4237)。

1HNMRδH 0.91(Me-23),δH 0.73(Me-24),δH 0.92(Me-25),δH 0.92(Me-26),δH 1.69(Me-30),δH 4.70(br s,H-29),δH 4.58(br s,H-29),δH 6.30(d,J＝18Hz,H-α),δH 7.54(d,J＝18Hz,H-β),δH 6.38(d,J＝18Hz,H-α′)andδH 7.54(d,J＝18Hz,H-β′)。13C-NMRδC 115.1(d),144.6(d),114.4(d)and 144.0(d),δC 109.7(t),δC 159.8(s),159.6(s),δC 78.1(d),δC166.6(s)and 166.3(s),δC 177.2(s)。

实施例2化合物2和化合物3的制备

采用与制备化合物1相似的方法，制备得到化合物2和化合物3。

本发明实施例3～9采用的细胞株、试剂的来源为：宫颈癌细胞株Hela、人肝癌细胞株HepG-2、人肺癌细胞株A549、人白血病细胞株K562、人胃癌细胞株MGC-803、小鼠结肠癌细胞株C26、真菌菌块均由成都宝科生物科技有限公司提供。胎牛血清及其相应培养基购自美国Hyclone公司；MTT、DMSO、西黄芪胶、戊巴比妥钠、TNBS、植烷(pristane)购自美国sigma公司；环磷酰胺(CTX)购自江苏恒瑞医药股份有限公司；地塞米松购自海南制药厂有限公司；四氯化碳购自成都试剂厂；丙氨酸转氨酶(ALT)购自南京建成；ELISA、Ⅲ型前胶原(PC-Ⅲ)、透明质酸(HA)购自武汉华美；层黏连蛋白(LH)购自上海西唐；雷公藤多苷，购自黄石飞云制药有限公司；云芝多糖购自上海康舟真菌多糖有限公司；4-二硝氟苯(DNFB)购自美国sigma公司。

实施例3化合物1的体外抗肿瘤试验

取处于对数生长期的各种肿瘤细胞(采用的肿瘤细胞株有如下几种：宫颈癌细胞株Hela；人肝癌细胞株HepG-2；人肺癌细胞株A549；人白血病细胞株K562；人胃癌细胞株MGC-803；小鼠结肠癌细胞株C26)，制备细胞悬液，用含有10％胎牛血清的相应培养基将细胞浓度调为1×105个/mL细胞悬液后，将细胞接种于96孔培养板，每孔加细胞悬液200μL，次日分别加入一定浓度无菌的化合物1溶液，混匀后置37℃、5％CO2孵箱中培养24h后，析出培养液并用PBS洗涤两次，再向每孔加入5mg/mL的MTT磷酸缓冲液20μL以及150μL培养基，同样条件下继续培养4h后终止培养。2000rpm离心5min，然后弃去培养板孔内的培养液，每孔加入150μL DMSO，震荡10min，使形成的甲臜颗粒充分溶解后，酶标仪检测吸光值。选择测定波长为490nm。计算化合物1对肿瘤细胞的IC50，结果见表1。

表1化合物1对多种肿瘤细胞的抑制作用

细胞株 IC50(μmol/L) Hela 10.29 HepG-2 15.85 A549 14.75 K562 12.97 MGC-803 14.91

C26 13.93

上述结果表明，化合物1具有体外抑瘤作用。

实施例4化合物1对荷S180小鼠的影响

选取接种8d健康状况良好的S180瘤源小鼠，腹部皮肤消毒后抽取腹水，以无菌生理盐水按1︰4(腹水体积：生理盐水体积)混悬备用。雄性昆明种小鼠60只，18～20g，按体重分层随机均分为5组，分别为模型对照组(0.5％西黄芪胶)、阳性对照组(环磷酰胺，CTX)、化合物1组，均在其右侧腋部皮下接种0.2mL前述混悬液。2h后模型对照组和药物组分别灌胃给予受试物或混悬剂，每日一次，连续14日；阳性对照组腹腔注射给予CTX，隔日一次，共7次。末次给药后24h颈椎脱臼处死小鼠，剥离瘤块称重，并计算抑瘤率((1—实验组平均瘤重/模型对照组平均瘤重)*100％)。

表2化合物1对荷S180小鼠的影响

组别 动物数(只) 剂量 瘤重(g) 抑瘤率(％) 模型对照 12 —— 1.32±0.47 —— 阳性对照(CTX) 9 40mg/kg 0.41±0.28** 68.9 化合物1 12 40mg/kg 0.61±0.25** 53.8

与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

实验结果表明，化合物1给予400mg/kg灌胃，可抑制S180在小鼠体内的生长，具有较好的抗肿瘤活性。

实施例5化合物1对2,4,6-三硝基甲苯磺酸(TNBS)所致大鼠实验性结肠炎的影响

SD大鼠72只，按体重分层随机均分为6组，分别为假手术对照组(0.5％西黄芪胶)、模型对照组(0.5％西黄芪胶)、阳性对照组(地塞米松)、化合物1成分组。动物禁食24h后以戊巴比妥钠麻醉，除生理盐水组外，用TNBS和40％乙醇灌肠，复制实验性结肠炎模型；假手术对照组仅以生理盐水灌肠。造模后6h，给予受试物。给药第5d，尾静脉取血行白细胞计数。第6d以乌拉坦麻醉，腹主动脉取血后脱颈椎处死动物，从肛门向上截取9cm结肠，在冰浴中沿肠系膜缘剪开肠腔，漂洗内容物，测量溃疡面积，计算溃疡面积百分比；结肠称重后刮取结肠黏膜，ELISA测定肿瘤坏死因子(TNF-α)浓度。

表3化合物1对TNBS所致大鼠实验性结肠炎的影响

与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

结果如表3所示，TNBS所致大鼠实验性结肠炎可出现炎性细胞增加、炎性细胞因子水平上升及结肠表面溃疡。化合物1可显著抑制白细胞及重要致炎因子TNF-α的升高，减少溃疡面形成，具有较好的抗结肠炎作用。

实施例6化合物1对大鼠实验性肝纤维化的影响

SD大鼠60只(200-240g，雄性)，按体重分层随机均分成空白对照组(0.5％西黄芪胶)、模型对照组(0.5％西黄芪胶)、阳性对照组(地塞米松，1mg/kg)、化合物1成分组(40mg/kg)。除空白对照组外，均按1mL/kg皮下注射40％四氯化碳植物油溶液，每周2次，连续3月，同时给予高脂饲料以及5％的乙醇水溶液。灌胃给予受试物，每日1次，连续3月。给药结束后次日腹主动脉取血，分离血浆，测定丙氨酸转氨酶(ALT)、Ⅲ型前胶原(PC-Ⅲ)、透明质酸(HA)和层黏连蛋白(LH)水平；随后处死动物，取肝脏进行病理学检查。

血清生化检测结果如表4。

表4化合物1对实验性肝纤维化大鼠肝脏及血液生化指标的影响

组别 LT(U/L) PC-Ⅲ(ug/L) HA(ug/L) LN(ug/L) 正常对照 51±6** 8.3±1.5** 118±22** 10±3** 模型对照 605±129 40.5±7.8 347±75 61±15 阳性对照(地塞米松) 358±92** 20.4±4.9** 300±82 55±17 化合物1 372±146** 20.5±5.1** 225±69** 40±17*

与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

表4的结果显示，与模型组相比，化合物1对四氯化碳所致实验性肝纤维化大鼠肝损伤有一定的保护作用，各指标明显改善。

病理学检查显示，模型组大鼠肝细胞水样变性明显，有明显的肝细胞坏死和脂肪变性，表现为明显肝纤维化；化合物1组肝细胞水样变性和脂肪变性程度较模型组明显降低，提示其对肝纤维化有良好抑制作用。

实施例7化合物1对小鼠实验性红斑狼疮的治疗作用及对细胞免疫的影响

KM小鼠72只，按体重分层随机均分为6组，分别为混悬剂对照组(0.5％西黄芪胶)、模型对照组(0.5％西黄芪胶)、阳性对照组(雷公藤多苷)、化合物1成分组。除混悬剂对照组外均按0.5mL/只腹腔注射降植烷(pristane)，灌胃给予药物或混悬剂，每日1次，连续30d。末次药后24h眼眶采血，4℃冷冻离心分离血清，ELISA测定血清中抗dsDNA抗体水平。

另取一批动物同样分组及复制模型，注射pristane后第24日，除混悬剂对照组外，各组动物腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水悬液0.2mL/只，并继续给药持续至注射pristane后第30日。末次给药后24h于眼眶取血20μL，加入1mL生理盐水中，随后分别加入4％鸡红细胞生 理盐水悬液0.5ml和10％豚鼠血清0.5mL,混匀后于37℃孵育0.5h，3000rpm离心10min，取上清液1mL，加入3mL都氏液，540nm比色。

表5化合物1对实验性红斑狼疮小鼠的影响

与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

结果如表5所示，化合物1可有效降低实验性红斑狼疮小鼠血清中dsDNA抗体水平，提示其可用于红斑狼疮治疗。红斑狼疮可表现为体液免疫异常升高，本实验显示模型动物溶血素水平显著高于正常动物，化合物1可有效降低此异常升高的溶血素水平，提示这些化合物对异常免疫功能亢进有显著抑制作用。

实施例8化合物1对免疫低下小鼠特异性免疫功能的影响(2，4-二硝氟苯所致耳肿胀法)

KM小鼠60只，按体重分层随机均分为6组，分别为混悬剂对照组(0.5％西黄芪胶)、模型对照组(0.5％西黄芪胶)、阳性对照组(云芝多糖)、化合物1成分组。灌胃给予试验药物或混悬剂，每日1次，连续14d。除混悬剂对照组外，给药第8、10、12d按25mg/kg腹腔注射给予环磷酰胺生理盐水溶液，造成免疫低下。给药第9d以1％2，4-二硝氟苯(DNFB)溶液(取100mgDNFB加入到1︰1的丙酮-植物油混合物中混匀，定容至10mL)25μL涂抹小鼠腹部。至第13d给药后1h，取10μL 1％DNFB溶液涂抹于小鼠左耳；涂抹后24h，即末次给药后1h，颈椎脱臼处死动物，耳片称重，计算耳肿胀度。

表6化合物1对免疫低下小鼠DNFB所致耳肿胀的影响

组别 剂量 耳肿胀度(mg) 混悬剂对照 —— 12.36±1.89** 模型对照 —— 4.74±0.58 阳性对照(云芝多糖) 400mg/kg 6.91±1.25** 化合物1 40mg/kg 7.05±1.33**

与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

结果如表6所示，化合物1可提高免疫低下小鼠的DNFB所致耳肿胀程度，提示其对免 疫低下动物的细胞免疫功能具有增强作用，具有较好的增强免疫低下动物特异性免疫的作用。

实施例9化合物1的体外抗真菌试验

称取化合物12mg，用5％异丙醇溶液溶解配制至10mL，0.22μm滤膜过滤除菌。取1mL除菌上述溶液，加入到9mL熔融后冷却至约50℃的PDA培养基中，充分摇匀，迅速倒入直径为6cm的培养皿中，静置，制成含有20μg/mL受试化合物的PDA培养平板。用相同体积的5％异丙醇溶液制成空白对照PDA培养平板。

将切取好的真菌菌块接种体移入上述含药PDA培养平板，25℃恒温培养，待对照组菌落接近培养皿边缘时，用十字交叉法测定所有培养平板上的菌落直径，校正后计算抑菌率。

表7化合物1对各种真菌的抑制效果

白色念球菌 红色毛癣菌 须癣毛癣菌 疣状毛癣菌 裴氏着色霉菌 抑菌率(％) 90.2±12.3 82.1±11.8 51.2±7.9 63.4±8.9 75.2±11.7

结果如表7所示，化合物1对受试的各类真菌具有明显的抑制作用。由于受试真菌均为常见致病真菌，具有明显的代表性，该结果提示化合物1具有较强抗真菌活性，可用于抗真菌类药物的制备。