CASP8基因突变检测特异性引物和液相芯片.pdf

本发明公开了一种CASP8基因突变检测液相芯片和特异性引物，该液相芯片主要包括有：每种由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成的ASPE引物，所述特异性引物序列为：针对G1122A位点的SEQ ID NO.13及SEQ ID NO.14，针对G808C位点的SEQID NO.15及SEQ ID NO.16，针对T845A位点的SEQ ID NO.17及SEQ ID NO.18，针对G34767T位点的SEQ ID NO.19及SEQ ID NO.20，针对T35438G位点的SEQ ID NO.21及SEQ ID NO.22，和/或针对缺失突变位点的SEQ ID NO.23及SEQ ID NO.24；有不同anti-tag序列包被的微球；扩增引物。本发明所提供的检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％，实现多个突变位点的野生型和突变型并行检测。

1.一种CASP8基因突变检测液相芯片，其特征是，包括有：(A).针对CASP8基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对：每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述ASPE引物对为：针对G1122A位点的由SEQIDNO.1和SEQIDNO.13组成的序列及由SEQIDNO.2和SEQIDNO.14组成的序列，以及选自针对G808C位点的由SEQIDNO.3和SEQIDNO.15组成的序列及由SEQIDNO.4和SEQIDNO.16组成的序列，针对T845A位点的由SEQIDNO.5和SEQIDNO.17组成的序列及由SEQIDNO.6和SEQIDNO.18组成的序列，针对G34767T位点的由SEQIDNO.7和SEQIDNO.19组成的序列及由SEQIDNO.8和SEQIDNO.20组成的序列，针对T35438G位点的由SEQIDNO.9和SEQIDNO.21组成的序列及由SEQIDNO.10和SEQIDNO.22组成的序列，和针对缺失突变位点的由SEQIDNO.11和SEQIDNO.23组成的序列及由SEQIDNO.12和SEQIDNO.24组成的序列中的至少一对；(B).有不同anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQIDNO.25～SEQIDNO.36，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；(C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物；所述扩增引物为：针对G1122A位点的SEQIDNO.37及SEQIDNO.38，以及选自针对G808C位点的SEQIDNO.39及SEQIDNO.40，针对T845A位点的SEQIDNO.41及SEQIDNO.42，针对G34767T位点的SEQIDNO.43及SEQIDNO.44，针对T35438G位点的SEQIDNO.45及SEQIDNO.46，和针对缺失突变位点的SEQIDNO.47及SEQIDNO.48中的至少一对。 2.根据权利要求1所述的CASP8基因突变检测液相芯片，其特征是，所述ASPE引物对为：针对G1122A位点的由SEQIDNO.1和SEQIDNO.13组成的序列及由SEQIDNO.2和SEQIDNO.14组成的序列，针对G808C位点的由SEQIDNO.3和SEQIDNO.15组成的序列及由SEQIDNO.4和SEQIDNO.16组成的序列，针对T845A位点的由SEQIDNO.5和SEQIDNO.17组成的序列及由SEQIDNO.6和SEQIDNO.18组成的序列，针对G34767T位点的由SEQIDNO.7和SEQIDNO.19组成的序列及由SEQIDNO.8和SEQIDNO.20组成的序列，针对T35438G位点的由SEQIDNO.9和SEQIDNO.21组成的序列及由SEQIDNO.10和SEQIDNO.22组成的序列，和针对缺失突变位点的由SEQIDNO.11和SEQIDNO.23组成的序列及由SEQIDNO.12和SEQIDNO.24组成的序列。 3.根据权利要求1或2所述的CASP8基因突变检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂为5－10个T。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种CASP8基因 突变检测特异性引物和液相芯片。

背景技术

CASP8(apoptosis-relatedcysteinepeptidase)基因的全称是半胱氨酸蛋白酶 (apoptosis-relatedcysteinepeptidase)基因，简写为CASP8或caspase8，是一种编码蛋 白型基因，属于半胱氨酸蛋白酶caspase(cysteine-asparticacidproteasecaspase)家 族，该基因定位于人2号染色体的长臂33-34，DNA全长2938bp，是单外显子基因，外显子位于 202-1818bp处，mRNA全长2097bp，其中编码序列1998bp，编码665个氨基酸、分子量为73Kd的 驱动蛋白样DNA结合蛋白(kinesin-likeDNAbindingprotein，kinesin-like4，Kid)。 CASP8是CASP家族的第8个成员，因此也被命名为caspase8(caspasefamily8)。该家族作为 非活化的蛋白酶原，由一系列蛋白结构域，大小蛋白酶亚基组成的，在细胞凋亡活化的执行 期起重要作用。其中CASP8需要由在保守氨基酸末端的蛋白水解过程中产生的二聚酶来激 活。它的基因编码产物由Fas和多种不同的细胞凋亡激活因子诱导，研究表明，caspases对 免疫细胞的生死存亡起决定性作用，其表达或激活异常与包括肿瘤在内的多种疾病有关。 caspase-8由CASP8基因编码，它是死亡配体-受体相互作用介导的细胞凋亡过程的起始型 caspase。来自死亡配体与受体结合的凋亡信号，首先激活caspase-8，后者将凋亡信号传递 给caspase-10(由CASP10基因编码)引起caspase级联反应导致细胞凋亡。在该过程中， CFLAR(由CFLAR基因编码)对caspase-8起负调节作用。这三个凋亡相关分子在凋亡信号传 导过程共同作用，是细胞凋亡事件中的关键分子。据研究发现，CASP8基因与多种常见肿瘤， 包括头颈部鳞状细胞癌、脑膜瘤、膀胱癌、肺癌、食管癌、结直肠癌、子宫颈癌、乳腺癌的发生 风险呈现相关性。

目前，CASP8基因突变检测方法主要有：Illumina光纤微珠芯片技术、PCR-RFLP技 术、SNPlexTMSystem技术和荧光定量PCR技术，虽然Illumina光纤微珠芯片技术是高灵敏 度和精确性的高通量检测系统，但是自动化程度低，手工操作比较多，难以满足实际应用的 需要，PCR-RFLP法是基于基因突变造成的限制性内切酶识别位点的改变，如位点丢失或产 生新位点，通过PCR扩增某一特定片段，再用限制性内切酶酶切扩增产物，电泳观察片段的 大小，

这种方法用于检测酶切位点改变的基因突变，可直接判断基因型，但该法不能用 于没有产生新酶切位点的基因突变检测。SNPlexTMSystem技术对SNP序列特异性要求较 高，不能随意地分析所选择的单核苷酸多态性位点，难以应用于临床检测诊断，而且该方法 操作比较复杂，不能满足实际应用的需要。而荧光定量PCR技术灵敏度高、特异性强、自动化 程度高的特点，但存在样品易污染、假阳性率高的缺点，且每次只能检测一种突变类型，同 样不能满足实际应用的需要。

本发明目标检测的CASP8基因突变，如表所示：

序号 CASP8基因突变的内容 标记为 1 SEQ ID NO.57的第158位核苷酸开始，发生了6bp缺失 缺失突变

SEQIDNO.57CASP8基因缺失突变

TGTCTTTACTCTGCATGCCAGGAGCTAAGTATTTTGCATGTATTAACTCATTTTGTTCTCATAATAACCTTCACATGCAGGAATCATTATAGCTACTTTATGAATGAGCCGAGGAAGGCACTGAGACGTTAAGTAACTTGCCCAAGGTCACGCAGCTTGGCAGAGCAAGAATTACTATGGCTTTATAAGCCTAGGAAAAAGTCTGAAAGAATCAAAATGTTAACAGCGGGGACCTCAAGGAAGCATTGAAGAGGCCATGGGAGAAGTTTTCACTTTGTTAAAAAATCAGTCCTTCAAATAAATAAATACAGTGAGGCTTCCCCAGAAGCAGATGTCACTA

(说明：该序列从第158位碱基开始，发生了6位碱基的缺失突变，框中序列即为缺 失区域，本领域技术人员使用常规技术手段，根据缺失区域前后的碱基组成，在基因库中便 能容易获得该缺失区域的碱基组成，因此，本发明目标检测的CASP8基因缺失突变的内容是 充分公开的。)

发明内容

本发明的目的之一是提供CASP8基因突变检测液相芯片，该液相芯片可用于单独 或并行检测CASP8基因六种常见基因型G1122A、G808C、T845A、G34767T、T35438G和缺失突变 的野生型和突变型。

实现上述目的的技术方案如下。

一种CASP8基因突变检测液相芯片，包括有：

(A).针对CASP8基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对：每 条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述 特异性引物序列为：针对G1122A位点的SEQIDNO.13及SEQIDNO.14，针对G808C位点的 SEQIDNO.15及SEQIDNO.16，针对T845A位点的SEQIDNO.17及SEQIDNO.18，针对 G34767T位点的SEQIDNO.19及SEQIDNO.20，针对T35438G位点的SEQIDNO.21及SEQID NO.22，和/或针对缺失突变位点的SEQIDNO.23及SEQIDNO.24；所述tag序列选自SEQID NO.1～SEQIDNO.12；

(B).有不同anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列 与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQIDNO.25～SEQID NO.36，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；

(C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。

在其中一个实施例中，所述扩增引物为：针对G1122A位点的SEQIDNO.37及SEQ IDNO.38，针对G808C位点的SEQIDNO.39及SEQIDNO.40，针对T845A位点的SEQIDNO.41 及SEQIDNO.42，针对G34767T位点的SEQIDNO.43及SEQIDNO.44，针对T35438G位点的 SEQIDNO.45及SEQIDNO.46，和/或针对缺失突变位点的SEQIDNO.47及SEQIDNO.48。

在其中一个实施例中，所述ASPE引物对为：针对G1122A位点的由SEQIDNO.1和 SEQIDNO.13组成的序列及由SEQIDNO.2和SEQIDNO.14组成的序列，针对G808C位点的 由SEQIDNO.3和SEQIDNO.15组成的序列及由SEQIDNO.4和SEQIDNO.16组成的序列， 针对T845A位点的由SEQIDNO.5和SEQIDNO.17组成的序列及由SEQIDNO.6和SEQID NO.18组成的序列，针对G34767T位点的由SEQIDNO.7和SEQIDNO.19组成的序列及由SEQ IDNO.8和SEQIDNO.20组成的序列，针对T35438G位点的由SEQIDNO.9和SEQIDNO.21组 成的序列及由SEQIDNO.10和SEQIDNO.22组成的序列，和/或针对缺失突变位点的由SEQ IDNO.11和SEQIDNO.23组成的序列及由SEQIDNO.12和SEQIDNO.24组成的序列。

本发明的另一目的是提供用于CASP8基因突变检测的特异性引物。

实现该目的的技术方案如下。

用于CASP8基因突变检测的特异性引物，所述特异性引物为针对G1122A位点的SEQ IDNO.13及SEQIDNO.14，针对G808C位点的SEQIDNO.15及SEQIDNO.16，针对T845A位点 的SEQIDNO.17及SEQIDNO.18，针对G34767T位点的SEQIDNO.19及SEQIDNO.20，针对 T35438G位点的SEQIDNO.21及SEQIDNO.22，和/或针对缺失突变位点的SEQIDNO.23及 SEQIDNO.24。

本发明的主要优点在于：

1.本发明所提供的检测方法与测序法的吻合率高达100％。且检测所需要的时间 远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要。所制备的CASP8基因突变检测液相芯片 具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉 反应，tag标签序列、anti-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能 够避免交叉反应，实现多个突变位点的并行检测。

2.本发明通过发明人长期积累的设计经验和大量的实验操作，从众多的特异性引 物中选取了最优的组合。本发明设计的ASPE引物特异性引物能够灵敏特异地识别目标检测 的突变位点，准确区分各种型别的基因型；在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、 特异性引物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，检测特异性好，交叉 反应率低于3％；除了能够检测单个位点突变情况，也能够同时并行检测多个突变位点的突 变情况，检测效果一致。

3.本发明的检测方法步骤简单，6种突变位点检测可通过一步PCR即可完成6条含 有突变位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定 因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。

4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷， 同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很 强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比 增强，检测结果更加准确可靠。

具体实施方式

实施例1CASP8基因突变检测液相芯片，主要包括有：

一、ASPE引物

针对CASP8基因六种常见基因型G1122A、G808C、T845A、G34767T、T35438G和缺失突 变的野生型和突变型，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“tag序列+特异性引物序列” 组成。ASPE引物序列如下表所示：

表1CASP8基因的ASPE引物序列(tag序列+特异性引物序列)

每条ASPE引物包括两个部分，5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag 序列，3’端为突变型或野生型特异的引物片段(如上述表1所示)。所有ASPE引物由上海生工 生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/LTrisBuffer配制成 100pmol/mL的贮存液。

二、anti-tag序列包被的微球

根据所设计的ASPE特异性引物片段，选择tag序列，最大限度地减少各微球的 anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物片段可能形成的二级结构，选择的12种微球 编号与微球上相应的anti-tag序列如表2所示：

表2微球编号与微球上相应的anti-tag序列

选择的12种微球购自美国Luminex公司，将anti-tag序列包被于微球上。anti-tag 序列与微球之间连接有5-10个T的间隔臂序列，即在每个anti-tag序列前加上一段5-10个T 的间隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti- tag序列用灭菌ddH2O配成100nmol/ml的贮存液。所述间隔臂为用于将anti-tag与微球表面 间隔开来或是将anti-tag置于亲水性环境中的序列。通过在anti-tag序列与微球之间设置 适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常 见的间隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(n≥3)，如 (CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干扰，还可以用poly(TTG)作为间隔臂。本发 明间隔臂优选为5-10个T，微球包被的过程如下：

分别取5×106个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于 50ul0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10ul合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配制 10ng/ml的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl-N-ethylcarbodiimide)(购自Pierce Chemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液，恒温孵育30分钟，再加入 2.5ul的EDC工作液，再恒温孵育30分钟。反应结束后，用0.02％的Tween-20洗涤一次，再用 0.1％的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100ul的Tris-EDTA 溶液[10mmol/LTris(pH8.0)]，1mmol/LEDTA中，2-8℃避光保存。

三、扩增出含有突变位点的目标序列的引物

针对CASP8基因六种常见基因型G1122A、G808C、T845A、G34767T、T35438G和缺失突 变，设计扩增引物对(见表3)，扩增出6条含有6个突变位点的目标序列。

表3扩增出具有突变位点的目标序列的引物

所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用 10mmol/LTrisBuffer配制成100pmol/mL的贮存液。

实施例2运用实施例1所述的CASP8基因突变检测液相芯片对样本的检测

所述各种溶液的配方如下：

50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250ml)：

2×Tm杂交缓冲液

过滤后贮存于4℃。

ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。

生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

一、样本的DNA提取：

参照《分子克隆》关于DNA提取的相关方法，得到待检测的DNA。

二、待测样品的PCR扩增

设计6对引物，多重PCR一步扩增出6条分别含CASP8基因六种常见基因型G1122A、 G808C、T845A、G34767T、T35438G、缺失突变的目标序列，G1122A、G808C、T845A、G34767T、 T35438G五种基因型产物大小分别为237bp、264bp、285bp、333bp、243bp，缺失突变野生型产 物为346bp，缺失突变突变型产物为340bp，引物序列(SEQIDNO.37-48)见上述表3所示。

首先配制多重PCR引物工作液：分别各取SEQIDNO.37-48的引物贮存液100ul于 1.5ml微量离心管中，混合均匀即为多重PCR引物工作液。多重PCR反应体系如下：

PCR扩增程序为：95℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃40s，30个循环；72℃10min4℃ 保存备用。

三、PCR产物的酶切处理

1.取7.5ulPCR反应后的产物，加入1ul10×SAP缓冲液、1ulSAP酶和0.5ulExo-I 酶；

2.37℃孵育15min，80℃孵育15min，灭活多余的酶。酶切处理后的产物直接用于后 续的

ASPE引物延伸反应。

四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)

利用实施例1中设计的ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标 记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。

首先配制混合的ASPE引物工作液：分别取待检测基因相应的野生型和突变型ASPE 引物贮存液10ul于1.5ml微量离心管中，加入10mmol/LTrisBuffer补至200ul，混合均匀 即为ASPE混合引物工作液。ASPE反应的体系如下：

反应程序为：96℃2min；94℃30s，54℃1min，72℃2min，30个循环；4℃保存备用。

五、杂交反应

1.根据设计的ASPE引物，每组选择相应的12种包被的微球(如实施例1所述)，每种 微球浓度均为2.5×105个/ml；

2.分别取1ul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中；

3.微球于≥10000g离心1-2min；

4.弃去上清，微球重悬于100ul的2×Tm杂交缓冲液中，涡旋混匀；

5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中，对照孔加25ul的ddH2O；

6.取5-25ul的ASPE反应液于相应的孔中，用ddH2O补足至50ul；

7.用锡箔纸包住96孔板以避光，95℃60s，37℃15min孵育杂交；

8.杂交后的微球于≥3000g离心2-5min；

9.去上清，将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中；

10.微球于≥3000g离心2-5min；

11.将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中，加入15ul浓度为10ug/ml的链霉亲 和素-藻红蛋白(SA-PE)；

12.37℃孵育15min，于Luminex仪器上检测。

六、结果检测与数据分析

反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。检测结果如表4、表5和表6所示。

对荧光值(MFI)和数据处理有以下要求：

1.每个位点需至少有一个等位基因MFI大于300而且大于10×PCR阴性对照MFI；

2.NETMFI＝样品MFI-PCR阴性对照MFI(NETMFI小于0的以0表示)；

3.满足以上两个条件的数据，按下列公式计算突变比值：

突变比值＝突变型NETMFI÷(突变型NETMFI+野生型NETMFI)

4.根据经验对每个检测位点的突变比值确定阈值(cut-off值)，以划分野生型纯 合子、杂合子和突变型纯合子。

使用本方法检测20份样本的CASP8基因SNP位点，实验数据符合上述要求，因此可 计算得它们的突变比值。阈值(cut-off值)的设置如下：突变比值范围在0％-20％视为野生 型纯合子；30％-70％视为杂合子；80％-100％视为变异型纯合子。以测序法检测与液相芯 片结果作对照，计算本发明所提供的分型方法检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的 CASP8基因型检测结果与测序结果吻合率达到100％。可见本发明所提供的CASP8基因SNP检 测液相芯片能够准确地检测出CASP8的SNP类型，且结果稳定可靠。

表4样本检测结果(MFI)之一

表5样本检测结果(MFI)之二

表6样本CASP8基因突变比值(％)

样品号 G1122A G808C T845A G34767T T35438G 缺失突变 1 2％ 1％ 2％ 2％ 3％ 2％ 2 2％ 2％ 1％ 2％ 1％ 1％ 3 2％ 1％ 2％ 1％ 1％ 2％ 4 2％ 1％ 2％ 2％ 1％ 2％ 5 2％ 2％ 2％ 1％ 2％ 1％ 6 2％ 2％ 2％ 1％ 98％ 1％ 7 1％ 2％ 1％ 1％ 3％ 1％ 8 1％ 3％ 2％ 2％ 2％ 2％ 9 2％ 3％ 1％ 1％ 2％ 2％ 10 1％ 2％ 2％ 1％ 1％ 2％ 11 2％ 99％ 2％ 2％ 2％ 2％ 12 1％ 2％ 2％ 2％ 2％ 1％ 13 2％ 3％ 2％ 2％ 1％ 1％ 14 2％ 2％ 2％ 2％ 1％ 2％ 15 1％ 3％ 2％ 1％ 3％ 3％ 16 2％ 2％ 2％ 1％ 1％ 98％ 17 1％ 2％ 2％ 2％ 1％ 3％ 18 2％ 2％ 51％ 2％ 2％ 2％ 19 2％ 2％ 2％ 1％ 1％ 2％ 20 1％ 1％ 2％ 2％ 2％ 2％

表7样本CASP8基因突变类型分析结果

实施例3不同的ASPE引物的液相芯片对CASP8基因SNP位点的检测

一、液相芯片制备的设计(Tag序列及Anti-Tag序列的选择)

以CASP8基因G1122A、G808C、G34767T和缺失突变位点突变检测液相芯片为例，分 别针对G1122A、G808C、G34767T和缺失突变的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性 引物序列，而ASPE引物5’端的Tag序列则选自SEQIDNO.1-SEQIDNO.12，相应的，包被于 微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列选自SEQIDNO.25-SEQIDNO.36。具体 设计如下表(表8)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如 实施例1和实施例2所述。

表8液相芯片制备的设计

一、样品检测

采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品21-40进行 检测，检测结果如下：

表9样本CASP8基因G1122A检测结果与基因多态性分析

表10样本CASP8基因G808C检测结果与基因多态性分析

表11样本CASP8基因G34767T检测结果与基因多态性分析

表12样本CASP8基因缺失突变检测结果与基因多态性分析

从上述实施例可见，其它针对不同突变位点的液相芯片，ASPE引物运用不同的tag 序列，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。而ASPE引物选用实施例1中tag序列与特异性引 物序列搭配时，效果更佳(信噪比更好)，参见本实施例试验组1、试验组5、试验组8和试验组 12。其它不同tag序列与特异性引物序列搭配，与实施例2和本实施例的结果相同，具体数据 省略。

实施例4CASP8基因突变检测特异性引物序列的选择

一、液相芯片制备的设计(野生型和突变型特异性引物序列的选择)

以CASP8基因T845A和T35438G的多态性位点检测液相芯片为例，以该突变位点所在目标序列的正向或反向互补序列为模板，分别针对T845A和T35438G的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，包括本发明实施例1中优选的特异性引物序列和2条备选的特异性引物序列，如表13所示。其中，内碱基为多态性位点。

表13特异性引物序列

以CASP8基因T845A和T35438G的多态性位点检测液相芯片为例，针对T845A和 T35438G选用不同的特异性引物序列，而ASPE引物5’端的tag序列则固定为实施例1中的最 佳效果序列，并选用与之相对应的anti-tag序列，具体设计如下表(表14)所示。ASPE引物的 合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。

表14液相芯片制备的设计之二

二、样品检测

采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品41-60进行 检测，检测结果如下：

表15样本CASP8基因T845A检测结果与基因多态性分析

表16样本CASP8基因T35438G检测结果与基因多态性分析

由本实施例可见，ASPE引物选用实施例1中特异性引物序列与tag序列搭配时，效 果更佳(信噪比更好)，参见本实施例试验组13和试验组16。其它来源于目标检测位点所在 序列的正向或反向互补序列的不同特异性引物序列与tag序列搭配，与实施例2和本实施例 的结果相同，即依然是实施例2中所述的特异性引物序列与不同的tag序列搭配效果更佳， 具体数据省略。

其它针对不同的SNP位点的多种特异性引物序列与tag序列搭配，与实施例2和本 实施例的结果相同，即实施例1所选择的特异性引物，具有更好的信噪比，检测效果也更好， 具体数据省略。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保 护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。