技术领域
本申请涉及结核疫苗领域，具体地说，本申请涉及新型结核疫苗MVA856疫苗以及 新的疫苗免疫策略。
背景技术
结核病(tuberculosis)与人类共存了几千年，给人类的健康造成了严重的问题， 近年来它不但破坏力没有减小，而且成为夺命最高的杀手之一。据世界卫生组织不完全统 计，肺结核的致命率排在第二位，仅次于艾滋病。结核病被世界卫生组织称为一种唯一的全 球性紧迫性疾病，全世界三分之一人口被结核分枝杆菌感染，其中约10％的人们在其有生 之年的某一段时间将会发展成为活动性结核病，从而面临活动性结核病的困扰。全球每年 新发病例约1000万，而在这些结核病患者中，每年有200万人丧生。由于治疗肺结核的周期 长，抗菌药物比较贵，结核病的死亡率在发展中国家尤其居高。牛分枝杆菌也是目前较为常 见的感染源，在英国，国家主要用屠宰的方法控制结核病在牛群和其他牲畜中的传播与蔓 延。但在发展中国家，尤其一些牲畜养殖量比较大的区域，由于经济成本和其它的一些的原 因，这种方法目前行不通。
伴随着艾滋病的流行，近年在结核病的防治上又面临着新的挑战和更大的威胁， 并且对肺结核的防治也摆出了一个难题。在美国，凡是艾滋病的流行区，BCG接种为禁忌。另 外，多重耐药菌株(multidrug-resistanttuberculosis)和广泛耐药菌株(extensively resistantTuberculosis)的出现，将会出现两种趋势，一是治疗费用加大，二是药物有效 性丧失，这都会给控制结核病增加难题。
在中国，解放前结核病被称为的″痨病″，并且有“十痨九死”，虽然现在没有那么高 的致死率，但中国却成为世界上22个TB高负担国家之一，患者人数仅次于印度居全球第二 位。
目前有的疫苗种类，主要包括卡介苗(BCG)，减毒活疫苗，病毒载体疫苗，DNA疫苗、 蛋白疫苗、亚单位等疫苗形式。采用的主要抗原有Ag85A、Ag85B、ESAT6、TB10.4、Hsp65、 Mtb39、Mtb32、MPT64。
在结核病的预防上，目前世界上允许并通用的卡介苗，它在儿童期注射从而引起 机体细胞免疫来预防结核病。卡介苗，是由法国的科学家分离出牛分枝杆菌后，在马铃薯培 养基上不断的对其进行培养、筛选，从1908年开始经历了大约13年的时间和连续230多次传 代而得到的一株减毒的菌株。就目前的情况来看，它是当前应用的用于预防TB的最有效疫 苗。从1928年以后，卡介苗在全世界范围内得到了广泛的使用，在预防结核病的发生上也取 得了很重要的贡献。时至今日，全世界大约有182个国家已经应用或正在应用卡介苗，已经 对40多亿的儿童进行了接种。现今，用于预防结核病的BCG疫苗每年大约有1.15亿剂。对新 生儿来说接种了卡介苗对于降低他们结核病的感染和传染性结核病的发病率是有明显效 果。但是我们现在不得不面对的一个严重的问题是——BCG疫苗的保护效率随着时间的推 移而逐步降低。这就导致了世界上的很多地区，尤其是那些疫情比较严重的地区，对于结核 病的发生已经不能很好的控制。研究结果综合起来可以看出，BCG疫苗对儿童保护力较强， 能产生一定的保护力，到达成年后保护力下降或丧失，而且BCG疫苗对于不同的地区，不同 的人群，从0到80％不等。因此可以说卡介苗仅对儿童有效，对在成人中最易患的肺结核不 起作用。另外对于结核病的检测工作，我们普遍采用的常规的检测方法一般区分不开患者 和接种者。
所谓的减毒活疫苗，就是指把致病的活菌通过连续的培养或者药物处理，使其保 留一定的剩余毒力和免疫性制成的疫苗。把这种疫苗接种到人体后，会使机体产生一定的 轻微感染但却不会致病，相反获得高的免疫力。BCG就属于一种减毒的活菌疫苗，由于它基 因组内部基因的缺失以及保护力的不足，使得人们产生用结核杆菌重新减毒来制备出一种 优于BCG的新型减毒活疫苗。
所谓的病毒载体疫苗就是指以病毒为基础通过一些改造而得到的基因载体。通过 对病毒的基因组进行了操作和改造，使得这个基因载体可以携带外源基因和相关基因元 件，并被包装成病毒颗粒。病毒载体疫苗的主要优点是：当它免疫动物后，它向宿主免疫系 统递呈的方式与自然感染时的真实情况很接近，所以它产生的可诱导产生免疫范围比较广 泛，这是它区别亚单位疫苗的一个优点。如果把病毒载体中同时插入多个外源基因，还可以 达到预防多种疾病的目的。目前，这类疫苗上市的如以腺病毒为载体的乙肝疫苗、以疱疹病 毒为载体的新疫苗等。
重组蛋白疫苗，其本质是蛋白疫苗，只是它把不同的抗原基因融合在一起表达出 含有两种抗原的一种蛋白质类疫苗。对于结核分枝杆菌，它的主要保护性抗原主要来源于 培养液早期滤过性蛋白和热休克蛋白，能引发免疫反应的主要成分集中在6-11kDa和26- 35kDa范围的蛋白分子，包括TB10.4、ESAT-6、MPT-64、Ag85复合物等。热休克蛋白包括 Hsp70、Hsp65等。利用基因工程的手段，把保护性抗原基因构建为表达载体并表达，通过纯 化蛋白后将其制成蛋白疫苗。利用基因工程手法构建重组蛋白疫苗方便之处在于可以把两 种不同的抗原基因连接在一起从而表达出来含有多个表位的蛋白。理论上，蛋白疫苗有很 大的应用优势，它主要作为外来抗原，被细胞识别，引起免疫反应，但是蛋白往往引发的是 体液免疫而不是细胞免疫。此外，蛋白作为外来抗原，很难被主要组织相容类分子所识别提 呈，所以作为抗原的蛋白质进入体内后很难诱导出强的细胞应答反应，这就需要联合佐剂 共同使用。如果能选取有效的佐剂，那么蛋白疫苗作用将更直接，效果将更明显。对于融合 蛋白的研究，选取合适的佐剂是研究针对结核病蛋白疫苗佐剂的一个主流。
目前结核疫苗的主要研究方向集中于：对原始卡介苗的改造，或加入某些抗原 (ESAT6)、或提高某些抗原表达量(Ag85B，rBCG30)、或改善BCG生长特性(rBCGΔureC：Hly)， 提高其保护力；以及使用新型佐剂、与细胞因子联合使用等。然而即使目前进展最快的疫苗 也只停留在临床阶段，并没有替代BCG的上市。
现有技术存在问题
单独使用BCG仅对儿童结核预防有效，对青春期后人群不能提供有效的免疫保护。
除病毒载体外的其它形式疫苗较难引起高强度的细胞免疫记忆，在短期实验取得 良好效果的病毒载体疫苗有AdAg85A，AERAS-402/CrucellAd35，OxfordMVA85A/AERAS- 485。这些疫苗单独使用或作为加强使用时，可以产生明显的保护力提升，但如果重复注射 将面临针对病毒载体本身的预存免疫，导致加强效果的降低或者不产生加强效果。并且，单 纯使用一种抗原可能导致疫苗保护范围有限，多种抗原联合使用可能导致有效的免疫分 散，效果降低。
发明内容
对于结核病预防疫苗的应用，目前科学界普遍认同初免-加强方案。这一方案的优 点在于初免后产生了某些针对结核分枝杆菌特异性的并且具有记忆性的T细胞，而加强疫 苗中含有共同的抗原表位信息，它再次进入机体，激活并特异性增殖了存在于机体内的特 异性的记忆性细胞。这种方案的最大优点在于它更大程度的激活了记忆性T细胞，防止了产 生的抗体与T细胞中和。对于结核病的防治，BCG或rBCG只能在青春期内具有很好的保护力， 当青春期过后这种保护力将逐渐下降。而在这一时刻，选取一种有效的疫苗形式进行加强 免疫，会使保护力提高到一个新的水平，能否选取到一种理想的加强疫苗，是这种方案的关 键所在(BCG或rBCG的免疫理论如图1所示)。
本发明的发明人发现联合使用2-3种能够诱导产生显著保护力的抗原为较佳方 案。例如，本发明人发现包括rBCG+ADV856+MVA856的联用疫苗具有明显提高的免疫效果。
其特点在于使用初始-加强免疫策略(prime-boost)：
-改善BCG的特性，使用免疫原性更高的重组型BCG(rBCG-Ag85B)替代原始BCG；
-使用免疫原性高能诱导有效免疫保护的Ag85B和ESAT6抗原，设计为融合基因(简 称856)，且对密码子进行了真核化设计，以提高抗原表达量；
-联合使用腺病毒载体(ADV856)及痘病毒载体(MVA856)。
所述免疫方案能够引起足够强度的细胞免疫记忆，并在效应阶段产生足够强度的 IFN-r，这与疫苗保护力密切相关。两种病毒载体联合使用，可避免针对载体本身的预存免 疫，提升加强免疫效果。
在一个实施方案中，本发明提供了一种序列为SEQIDNO：1的Ag85B-ESAT6融合基 因或其所编码的蛋白。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种痘病毒载体疫苗MVA856，其特征在于所 述疫苗为在痘病毒载体中含有上述的Ag85B-ESAT6融合基因。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种腺病毒载体疫苗ADV856，其特征在于所 述疫苗为在腺病毒载体中含有上述的Ag85B-ESAT6融合基因。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种序列为SEQIDNO：2的Ag85B-TB10.4融 合基因或其所编码的蛋白。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种痘病毒载体疫苗MVA-Ag85B-TB10.4，其 特征在于所述疫苗为在痘病毒载体中含有上述的Ag85B-TB10.4融合基因。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种腺病毒载体疫苗ADV-Ag85B-TB10.4，其 特征在于所述疫苗为在腺病毒载体中含有上述的Ag85B-TB10.4融合基因。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种序列为SEQIDNO：3的Ag85B-ESAT6- TB10.4融合基因或其所编码的蛋白。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种痘病毒载体疫苗MVA-Ag85B-ESAT6- TB10.4，其特征在于所述疫苗为在痘病毒载体中含有上述的Ag85B-ESAT6-TB10.4融合基 因。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种腺病毒载体疫苗ADV-Ag85B-ESAT6- TB10.4，其特征在于所述疫苗为在腺病毒载体中含有上述的Ag85B-ESAT6-TB10.4融合基 因。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种试剂盒，包括BCG或rBCG以及前述的疫苗 MVA856和/或ADV856。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种联用疫苗，包括BCG或rBCG以及前述的疫 苗MVA856和/或ADV856。优选地，所述联用疫苗的特征在于以BCG或rBCG进行初免，并且以 MAV856和/或ADV856进行加强免疫；或者其特征在于以BCG或rBCG进行初免，以ADV856进行 加强免疫，再以MAV856进行加强免疫。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种试剂盒，包括BCG或rBCG、前述的疫苗 MVA856或ADV856，以及前述的序列为SEQIDNO：1的Ag85B-ESAT6融合基因所编码的蛋白。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种联用疫苗，包括BCG或rBCG、前述的疫苗 MVA856或ADV856，以及前述的序列为SEQIDNO：1的Ag85B-ESAT6融合基因所编码的蛋白。 优选地，所述联用疫苗的特征在于以BCG或rBCG进行初免，以所述蛋白进行加强免疫，然后 再以MAV856或ADV856进行加强免疫；或者以BCG或rBCG进行初免，以MAV856或ADV856进行加 强免疫，然后所述蛋白进行加强免疫。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种试剂盒，包括BCG或rBCG以及前述的疫苗 MVA-Ag85B-TB10.4和/或ADV-Ag85B-TB10.4。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种联用疫苗，包括BCG或rBCG以及前述的疫 苗MVA-Ag85B-TB10.4和/或ADV-Ag85B-TB10.4。优选地，所述联用疫苗的特征在于以BCG或 rBCG进行初免，并且以MVA-Ag85B-TB10.4和/或ADV-Ag85B-TB10.4进行加强免疫；或者其特 征在于以BCG或rBCG进行初免，以ADV-Ag85B-TB10.4进行加强免疫，再以MVA-Ag85B-TB10.4 进行加强免疫。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种试剂盒，包括BCG或rBCG以及前述的疫苗 MVA-Ag85B-ESAT6-TB10.4和/或ADV-Ag85B-ESAT6-TB10.4。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种联用疫苗，包括BCG或rBCG以及前述的疫 苗MVA-Ag85B-ESAT6-TB10.4和/或ADV-Ag85B-ESAT6-TB10.4。优选地，所述联用疫苗的特征 在于以BCG或rBCG进行初免，并且以MVA-Ag85B-ESAT6-TB10.4和/或ADV-Ag85B-ESAT6- TB10.4进行加强免疫；或者其特征在于以BCG或rBCG进行初免，以ADV-Ag85B-ESAT6-TB10.4 进行加强免疫，再以MVA-Ag85B-ESAT6-TB10.4进行加强免疫。
附图说明
图1示出了BCG或rBCG的免疫理论示意图。
图2示出了Ag85B-ESAT6融合基因。
图3示出了采用各种刺激物的情况下，本发明的免疫方案rBCG+ADV856+MVA856与 现行方案的IFN-rELISOPT实验的结果。
图4示出了MVA856在2周和4周单独免疫的IFN-rELISOPT实验的结果。
图5示出了免疫及检测程序的方案。
图6示出了免疫及攻毒和检测程序的方案。
具体实施方式
本申请中所用的术语“佐剂”是指这样的佐剂，一方面它可以吸引着大量的巨噬细 胞吞噬抗原，改变抗原构型；另一方面它可以储存过量的抗原，然后逐步缓慢的释放。佐剂 可以增大抗原的表面积，改变了一些抗原活性部位的构型，而且可以使半抗原转变成抗原。 另外，它促使巨噬细胞走在一起聚集，刺激这些细胞增值和吞噬抗原的作用。佐剂还能使抗 体持续的产生，隔离B细胞使抗体水平下降。由于蛋白疫苗不容易被主要组织相容抗原类分 子所识别递呈，不容易引起细胞免疫，所以当想要引起细胞免疫时，就要和佐剂联合使用。 这就是说佐剂在诱使蛋白被识别递呈走向细胞免疫途径作用上发挥着重要的作用。佐剂与 蛋白混合一起形成特定的疫苗后，在诱导同等强度应答的条件下蛋白抗原的剂量会减少。 另外一方面，佐剂可以提高蛋白类疫苗的免疫原性，提升特异性的体液免疫应答，或引发细 胞免疫应答。
在众多的佐剂中，目前上市的人用佐剂只有铝佐剂和MF59。近年来主要的佐剂形 式有脂质体类，毒素类，细胞因子类和免疫刺激复合物等。脂质体可增强疫苗的抗体产生， 其中流感、甲肝的脂质体疫苗已用于临床。霍乱毒素(CT)和大肠杆菌不耐热毒素(LT)这两 种佐剂的研究使黏膜免疫得到了发展，并且在不断的研究中，选取两种毒素的亚单位，这样 既降低了毒性又提高了活性。细胞因子类的佐剂如IL-2、IL-6-可刺激T细胞，IFN-γ、IL-4- 可引起B细胞分化，它们在研究结核疫苗的过程中也有应用。
以下结合实施例对本发明进行详细说明。但应理解，以下实施例仅是对本发明实 施方式的举例说明，而非是对本发明的范围限定。
实施例
佐剂
MPL：monophosphoryllipidA(单磷酰脂质A，sigmaL6638)
DDA：dimethyldioctadecylammoniumbromide(双十八烷基溴化铵)
实施例1重组卡介苗rBCG-Ag85B的制备
1.目的基因Ag85BFL的PCR引物设计和扩增
根据GeneBank注册的BCG(MycobacteriumbovisBCGstr.Pasteur1173P2； GeneBank注册号为TaxonomyID：410289)基因序列设计引物，上游引物含有HindIII酶切位 点。
引物：P1：5’-ATATATAAGCTTTGTAGCTCCAATTCGTTG-3’
P2：5’-GTAAAAGGGCACCGG-3’
扩增得到的Ag85BFL基因的大小是4712bp。
PCR反应体系按照LATaq酶(TaKaRaLAwithGCBuffer(DRR02AG～DRR02BG))反应要求配制。
反应模板为所提取的购自上海生物制品研究所(国药准字S20013038)的BCG的基 因组。BCG基因组DNA的提取：取5mlBCG液体培养物以10000rpm离心10min，将沉淀重悬于50 μL裂解液(10XPCR缓冲液5μl，45g/L吐温-205μl，45g/LNP-405μl，20g/L蛋白K0.5μl及水 34.5μl)中，55℃水浴1小时，沸水浴10分钟灭活蛋白酶K，再以8000rpm离心1分钟，取上清， 用酚/氯仿抽提，再用无水乙醇沉淀，然后溶于50μlTE中，贮于-20℃下备用。
PCR反应条件：初始变性：94℃，10min；主循环：94℃，1min；50℃，1min；72℃，10min 共30个循环；终延伸：72℃，20min。反应中间补充LATaq酶一次。
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，从低熔点琼脂糖凝胶中回收DNA片段(按TIANGEN 胶回收试剂盒说明书进行)即得到目的基因片段Ag85BFL。
2.目的基因Ag85BFL克隆
在10μl的反应体系，将步骤1中回收后的目的基因Ag85BFL和克隆载体pGEM-T-easy(-TEasyVectorSystems，Promega)按1∶1混合反应，得到pGEM-T-easy-Ag85BFL质粒，反应条件为：4.0℃下反应16h。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞TOP10(TOP10来源：天根生化科技(北京)有限公司CB104-02TOP10感受态细胞)，提取质粒(提取方法按试剂盒：天根生化科技(北京)有限公司DP103-02质粒小提试剂盒)，用BamHI(NEBR0136L)+HindIII(NEBR0104L)双酶切和EcoRV(NEBR0195L)单酶切进行鉴定，观察有无目的片段，将筛选出的阳性克隆通过双向进行测序(由上海生工公司完成测序)。
3.目的基因和穿梭表达载体的连接
将测序正确的pGEM-T-easy-Ag85BFL质粒用BamHI和HindIII双酶切胶回收目的基 因后，将Ag85BFL与pSMT3质粒用BamHI和HindIII双酶切胶回收的片断进行连接，酶切体系 为：质粒1μg(1μl)，BamHI(0.5μl)，HindIII(0.5μl)，缓冲液10X(2μl)，H2O16μl.37度反应2 个小时。构建重组穿梭表达载体pSMT3-Ag85BFL(pSMT3质粒由Dr.MarcusA.Horwitz赠送， 参见ANewVaccineagainstTuberculosisAffordsGreaterSurvivalafter ChallengethantheCurrentVaccineintheGuineaPigModelofPulmonary Tuberculosis)。
4.制备重组卡介苗rBCG-Ag85B
1)将BCG(上海生物制品研究所(国药准字S20013038)BCG)在Middlebrook7H9 Broth(DifcoMiddlebrook7H9BrothDifcoCat.No.271310)+10％ADC培养基(BDBBL MiddlebrookADCEnrichment，ProductNumber：211887)中于37℃下培养3-4周到对数生 长期。
2)将培养物冰浴1.5小时。
3)将培养物转移至50ml离心管内，4℃下2000g高速冷冻离心(centrifuge5810R， eppendorf)15min。
4)弃去上清，将菌体用等体积冰预冷10％甘油(北京化学试剂公司)洗涤一次，4℃ 下2000g高速冷冻离心15min。
5)重复步骤4)两次。
6)将细胞用室温的10％甘油重悬，按初始体积的1％加入甘油。
7)将步骤6)的重悬细胞分装到eppendorf管(200μl/管)，直接用于电转或保存于- 70℃冰箱备用，即为BCG感受态。
8)取质粒pSMT3-Ag85BFL的DNA(10-15μg)和200μlBCG感受态混合10min。充分混 合后，加入电转杯内。
9)在BIO-RAD电转仪上进行电转，BCG电转条件：电压2500v，电阻200ohm，电容25μ F，电转杯0.2cm，质粒10-15μg。
10)电转后将电转杯迅速置于冰上，加入1mlMiddlebrook7H9Broth培养基(含潮 霉素B(HygromycinBRoche843555)、50μg/ml)至电转杯内，混匀后转移细胞至15ml试管， 37℃过夜培养。
11)将过夜培养物涂于Middlebrook7H11Agar(DifcoMycobacteria7H11 AgarCat.No.283810)+10％OADC(BDBBLMiddlebrookOADCEnrichment，ProductNumber： 211886)固体平板(Hyg+、50μg/ml)上，培养4-6周筛选阳性单克隆，其中Hyg+表示含潮霉素 B。
12)挑取阳性单克隆接种到液体Middlebrook7H9Broth培养基(潮霉素B、50μg/ ml)内培养，37℃恒温培养3-4周。
13)将培养物转移至50ml离心桶内，在4℃下以2000g离心15min。
14)弃去上清，将菌体用等体积冰预冷10％甘油PBS洗涤一次，在4℃下以2000g离 心15min。
15)重复步骤14)两次。
16)将沉淀用冰预冷10％甘油PBS重悬分装，待用。
17)菌体悬液按照10∶1的比例进行稀释，取各梯度的菌液接种于Middlebrook7H11 固体培养基(Hyg+、50μg/ml)上，每个斜面接种100μl，每个梯度各接2板，37℃恒温培养。4-6 周后计算CFU数。
实施例2ADV856的制备
1.分子克隆，构建PDC-316-856穿梭质粒
1)EcoRI(NEBR0101M)酶切Teasy-856(按原理图即图2及人密码子使用效率，设计 真核化856基因，委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成至Teasy载体)，37℃反应2 小时，胶回收试剂盒回收856片段。
2)EcoRI酶切PDC316(MicrobixBiosvstemsInc：AdMaxAdenovirus VectorCreationKits)载体，37℃反应2小时，胶回收试剂盒回收线性化PDC316载体。
3)将回收的片段和载体在4℃下连接过夜，连接体系为：载体2μl，片段5μl，连接酶 1μl，缓冲液(10X)2μl，水10μl。将连接产物转化大肠杆菌(TOP10)，经酶切筛选鉴定，得到 PDC-316-856穿梭质粒。
2.使用10％DMEM(Dulbecco’smodifiedEagle’smedium，Invitrogen)培养基传 代HEK293细胞(ATCCNumber：CRL-1573)，使其融合率达90％。
3.利用腺病毒AD5(MicrobixBiosystemsInc：AdMaxAdenovirus VectorCreationKits)与PDC-316-856在HEK293细胞中的同源重组(参见厂商的说明书，使 用AdMaxVectorCreationKit(MicrobixBiosystemsInc：AdMaxAdenovirusVector CreationKits))，获得重组型ADV856。
4.空斑筛选阳性克隆：
1)用六孔板培养好的HEK293细胞，吸出培养液，将同源重组细胞液加入2ml，感染4 小时。
2)吸出细胞液，加入4ml含1％低融点琼脂糖-2.5％胎牛血清的DMEM，室温凝固，37 ℃培养
3)5天过后查找空斑挑取，加入含2.5％胎牛血清的DMEM，-80℃保存。
5.使用重组型ADV856感染HEK293细胞，48h后收获将细胞悬液用移液管转移至50- ml离心桶中，1200×g4℃离心10分钟。
6.弃上清，并加入1ml完全DMEM2.5培养基(含2.5％胎牛血清的DMEM(Dulbecco’s modifiedEagle’smedium，Invitrogen))中重悬震荡。
7.用液氮和37℃水浴冻融裂解细胞，震荡。反复3次。
8.于冰上超声1分钟，4000rpm离心30分钟，上清于-70℃保存。
9.取第8步上清，重复5-8，使病毒扩增。
10.收集足量待纯化病毒，细胞冻融后离心，4℃12000g×10min，取上清。
11.每20ml上清中加入10ml20％PEG8000(上海生物工程公司)/2.5MNaCl，混匀 后放在冰浴中1h。
12.离心，4℃12500g×30min，弃上清。
13.收集沉淀，溶于5ml1.1g/mlCsCl(北京鼎国生物技术有限责任公司)中。
14.制备不连续CsCl密度梯度：依次加入2ml1.4g/mlCsCl、3ml1.3g/mlCsCl、5ml 上清。
15.离心，4℃下以60000g离心3h(对应Beckman离心机sw40，22000rpm)，吸出病毒 带。
16.转入透析卡(PIERCE：Slide-A-DialysisCassette)，4℃透析过夜，换透析液(50mMMgCl210ml，甘油100ml，10×PBS100ml，加入双蒸水定容至1000ml)，分装保存于-80℃。
17.按照10-1的比例用透析液进行稀释，使用腺病毒特异抗体(AdenovirusType5 antibody(ab6982，Abcam))测定滴度，待用。
实施例3MVA856的制备
1.分子克隆，构建Psc11-856穿梭质粒
1)以ApaI(NEBR0114L)和PacI(NEBR0547L)酶切Teasy-856，37℃反应2小时，胶 回收试剂盒回收856片段。
2)ApaI和PacI酶切Psc11(购自ATCC)载体，37℃反应2小时，胶回收试剂盒回收线 性化Psc11载体。
3)将回收的片段和载体在4℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌(TOP10)，经酶 切筛选鉴定，得到Psc11-856穿梭质粒。
2.使用10％DMEM培养基传代BHKtk-细胞(ATCCNumber：CRL-1632tk-ts13)，使其 融合率达90％。
3.利用MVA(ModifiedvacciniavirusAnkara(MVA)ATCCNumber：VR-1508)与 Psc11-856在BHKtk-细胞中的同源重组(EarlPL，MossB，WyattLS，Carroll MW.Generationofrecombinantvacciniaviruses.CurrentProtocolsinMolecular Biology2001May；Chapter16：Unit16.17.)，获得重组重组型MVA856。
4.蓝白斑筛选阳性克隆。筛选用固体及液体体系均加入1％体积的5mg/mlBrdU (SigmaB5002，5-Bromo-2′-deoxyuridine)作筛选用以控制非重组克隆生长。
1)六孔板培养好的BHKtk-细胞，吸出培养液，将同源重组细胞液加入2ml，感染4 小时。
2)吸出细胞液，加入2ml含1％低融点琼脂糖-2.5％胎牛血清的DMEM，室温凝固，37 ℃培养
3)2天过后，加入2ml1％X-gal-含1％低融点琼脂糖-2.5％胎牛血清的DMEM，室温 凝固，37℃培养
4)1-2天，显示蓝斑，挑取，加入含2.5％胎牛血清的DMEM，-80℃保存。
5.使用重组型MVA856感染BHKtk-细胞，48h后收获将细胞悬液用移液管转移至 50-ml离心桶中，1200×g4℃离心10分钟。
6.弃上清，并加入1ml完全DMEM-2.5培养基中重悬震荡。
7.用液氮和37℃水浴冻融裂解细胞，震荡。反复3次。
8.于冰上超声1分钟，4000rpm离心30分钟，上清于-70℃保存。
9.取第8步上清，重复5-8，使病毒扩增。
10.收集足量待纯化病毒，细胞用10mmol/LTris-HCL重悬，冻融裂解细胞，震荡。 反复3次。
11.加入36％蔗糖至超离管一半体积形成垫层，加入相同体积病毒悬液。
12.30000g4℃离心60分钟。
13.弃上清，重悬病毒沉淀于1mmol/LTris-HCL，分装保存于-80℃。
14.按照10-1的比例进行稀释，使用痘病毒特异抗体(vacciniavirus polyclonalantibody(20-VR69，Fitzgerald))测定滴度，待用。
实施例4ADV856和MVA856联用的免疫方案
1.Balb/c雌鼠(吉林大学基础医学院动物实验中心，小鼠饲养条件：SPF级)6-8周 龄免疫方案如下：
第一次免疫(prime)rBCG皮下注射1×106CFU第1周
第二次免疫(boost1)ADV856皮下注射1×107PFU第7周
第三次免疫(boost2)MVA856皮下注射2×107PFU第9周
第10-11周处死小鼠，分离脾脏，以总脾细胞进行实验
2.脾细胞处理方案：
1)拉颈处死Balb/c小鼠，并且将小鼠分组记号，75％酒精浸泡后拿入细胞室准备 取脾；
2)无菌操作取脾，尽量将结缔组织去除。将脾放在含有RPMI-3(RPMIMedium1640， Invitrogen)培养基的六孔板中，每组脾放置在一个孔内，作好标记。
3)将脾放置纱网中于预先放好RPMI-3培养基的平皿内，用纱网包裹脾用5ml注射 器内塞研磨。用一新纱网再过滤一遍至50ml离心桶(作好分组标记)，用4mlRPMI-3洗涤培养 皿，如果必要重复操作。每个脾加入3mlRPMI-3培养基，终体积约15ml。
4)20℃，200g离心10min，去除上清。用RPMI-3培养基重悬细胞沉淀，再加入红细胞 裂解液(ACK缓冲液(NH4Cl-0.15M，KHCO3-10.0mM，Na2EDTA-0.1mM，pH7.2-7.4))每个脾加 2-3ml(培养基与ACK缓冲液比例为1∶2)室温放置5min，时而振动。
5)20℃，200g离心10min。裂解好的细胞沉淀应呈乳黄色，如果红细胞裂解不彻底 可重复裂解。20mlRPMI-5培养基重悬洗涤2次，20C，200g离心5min。最后用7.5mlR-5培养基 重悬。
6)用滤网再过滤一遍。
7)脾细胞计数：用RPMI-5培养基稀释脾细胞至1×107cells/ml
3.IFN-rELISOPT实验：
第1天(杀鼠取脾前一天)
1)抗体包被板：
用IFN-gamma抗体包被elispot96-孔板(96-wellfilterplates(BD51- 2447KC))。在5mlPBS中加入1mg/ml纯化的抗小鼠IFN-γ的mAb(purifiedanti-mouse IFN-γmAb，BD51-2525KC)25μl，使浓度达5ug/ml，每孔加入50ul。加盖4℃过夜。
第2天(杀鼠取脾，参见步骤1和2)
2)封闭
弃去包被抗体，用含10％胎牛血清(武汉三利生物技术有限公司)的完全培养基 (RPMI-10)洗涤一次，每孔加入200μl完全培养基，加盖于室温封闭2小时或37℃1小时，弃去 培养基。
3)细胞激活
a.每孔加入3X105细胞，使每孔体积为100μl。
b.实验组每孔加入25μl刺激物(终浓度为1μg/ml)。
c.对照组每孔加入25μl培养基。
d.阳性对照每孔加入小鼠IFN-gamma。
e.阴性对照加入培养基。
混匀于37℃，5％CO2培养箱中培养36小时。
第三天ELISPOT试剂盒(BDELISPOTSet，RDcat#EL485)
4)ELISPOT试剂盒操作
a.用无菌水洗板2次，用1X洗涤缓冲液或PBST洗涤6次，每次洗涤时浸洗1～2min。
b.将抗体生物素化抗小鼠IFN-γ的mAb(biotinylatedanti-mouseIFN-γmAb， BD51-1818KZ)加至12ml(10组量)的稀释缓冲液1中，终浓度为2ug/ml。
c.每孔加入50μl上步混合液。
d.室温2小时。
5)洗涤显色
a.用1X洗涤缓冲液或PBST洗涤3次。
b.将链亲和素-HRP浓缩物A(streptavidin-HRP，BD51-9000209)加至稀释缓冲液 比值为1∶100。每孔加入50μl混合液。
c.室温培养2小时，或4C过夜。
d.用PBST洗涤4次。
e.用PBS洗涤2次
f.每孔加50μlelispot染色液(BDAECsubstrateReagentset，catno： 551951，20μl的色原体(chromogen)加入到1ml的AEC底物溶液中)。
g.避光室温放置5-60分钟。
h.弃去染色液，用蒸馏水洗涤
i.室温空气干燥2小时或过夜干燥，保存数据。
结果：
表13×105细胞进行刺激36小时，产生斑点情况如下
其中，9肽1号和9肽2号为CD8+T细胞特异小肽，能够刺激CD8+T细胞分泌IFN-γ；18 肽1号和18肽2号为CD4+T细胞特异小肽，18-2，18-1，20肽能够刺激CD4+T细胞分泌IFN-γ。
表2本研究中所使用的肽
其中20肽由强耀生物科技有限公司(ChinaPeptidesCo.(Shanghai，China))合 成，9-2，9-1，18-2，18-1肽由强耀生物科技有限公司合成。
以1X106细胞重复上述测试，所用具体免疫方式如图5所示，结果在表3中示出。
4.CD8+TCTL实验：
P815：
1)对150×105P815(Number：TIB-64TM)进行9-2肽标记，37℃培养，DMEM-105ml加25μl9-2肽
2)对另一份150×105P81537℃培养无肽标记DMEM-105ml
3)37℃孵育2小时以上，经常振动，使得充分接触
4)对9-2肽标记的P81580×105进行5uMCFSE(5(6)- CarboxyfluoresceindiacetateN-succinimidylester，Sigma21888)标记，使用不完全 16408ml
对无标记的P81580×105进行0.5uMCFSE标记，使用不完全16408ml
5)37℃孵育10-15min，每3-5min混匀细胞。
6)等体积冰冷小牛血清中止2-5min，以R-3洗2次，洗涤及离心过程中注意避光
7)最后每支用R-510ml重悬，计数
8)每个样品需要：9-2肽P8155×104；无肽P8155×104
9)以效靶比10∶1计算，需要效应细胞为10×105
10)将效应细胞(即步骤2脾细胞处理方案中所处理的脾细胞)与靶细胞混合，每个 组别设置两个平行样品
11)200g，4min离心(使靶细胞和淋巴细胞充分接触)37℃培养，杀伤4-6小时，
结果：
以9肽2号MPVGGQSSF与P815孵育后作为靶细胞进行杀伤4小时，杀伤率达到28％ ±2％
以上实验说明：
此疫苗形式能够引起T淋巴细胞强烈的IFN-r分泌和细胞杀伤作用，这预示疫苗的 有效性。
实施例5本发明的免疫方案与现有技术免疫方案的对比试验
采用以下方案进行相互比较
rBCG+ADV856+MVA856
BCG
rBCG
rBCG+(Ag85B-ESAT6)MPL/DDA
其中rBCG+ADV856+MVA856为本专利的免疫方案；
BCG为当前普遍使用之卡介苗；
rBCG为本专利初次免疫使用之第一针，也是国外提出的一种BCG替代方案[ANew VaccineagainstTuberculosisAffordsGreaterSurvivalafterChallengethan theCurrentVaccineintheGuineaPigModelofPulmonaryTuberculosis]；
rBCG+(Ag85B-ESAT6)MPL/DDA，其中(Ag85B-ESAT6)MPL/DDA为国外提出的一种免 疫方案，Ag85B-ESAT6融合蛋白与佐剂MPL+DDA联合使用，明显引起免疫保护[Protection ofMicewithaTuberculosisSubunitVaccineBasedonaFusionProteinof Antigen85BandESAT-6，ProtectiveEffectofaTuberculosisSubunitVaccine BasedonaFusionofAntigen85BandESAT-6intheAerosolGuineaPigModel， ProtectionofmacaquesagainstMycobacteriumtuberculosisinfectionby asubunitvaccinebasedonafusionproteinofantigen85BandESAT-6]，用此蛋 白并疫苗对原始rBCG进行加强2次，会使其保护作用进一步加强。
1.采用IFN-rELISOPT实验(方法参见实施例4)，结果如下：
图3中所示各图小标题为孵育时使用的刺激物，统计分析采用one-wayANOVAand Tukey’sposttest，其中各组均与本专利提供的rBCG+ADV856+MVA856方案进行比较，＊，p ＜0.05；＊＊，p＜0.01；＊＊＊，p＜0.001；ns，无统计学显著性.
结果显示，rBCG+ADV856+MVA856在各刺激物刺激下(20须肽除外)，反应均强于BCG 组和rBCG组，并具有统计学意义。说明本专利在特异活化细胞产生IFN-γ方面，具有显著优 势，强于当前使用的BCG和rBCG。
rBCG+ADV856+MVA856在与rBCG+(Ag85B-ESAT6)MPL/DDA比较时，在Ag85B-ESAT6融 合蛋白，Ag85B和ESAT6刺激下，显示效果与之相当。但使用CD8+T细胞特异小肽(9肽1号，9肽 2号)和CD4+T细胞特异小肽(18肽1号，18肽2号)以及20肽刺激时，均显示出明显的统计学意 义，说明本专利在特异活化CD8+T和CD4+T产生IFN-γ方面，具有显著优势，强于当前正在研 究的改进方案rBCG+(Ag85B-ESAT6)MPL/DDA。
2.采用CD8+TCTL实验(方法参见实施例4)，结果如下：
rBCG+ADV856+MVA856引起杀伤率达到28％±2％，其它各组均未引起可见的细胞 杀伤
实施例6MVA单独免疫的结果
在IFN-rELISOPT实验(方法参见实施例4)中，分别在各种刺激物刺激下，对MVA免 疫后2周和4周的小鼠脾细胞进行检测，
其中PBS为对照阴性组。图4中显示，MVA免疫后，有特异性IFN-r细胞产生，尤其对 Ag85B的刺激敏感。
实施例7攻毒实验程序
具体免疫及攻毒和检测程序方案参见图6。
Balb/c雌鼠(武汉大学医学动物实验中心.小鼠饲养条件：攻毒前为SPF级，攻毒后 转移至动物生物安全3级)6-8周龄免疫方案如下：
完成免疫的小鼠于4周后，以结核菌(H37Rv)5.0×105CFU/只尾静脉注射。生物安 全三级实验室饲养小鼠8周后，解剖，取肺、脾进行感染组织平皿培养。
1.感染组织平皿培养结核分枝杆菌
材料和特殊仪器
7H11-OADC琼脂培养皿(包含环己酰胺100ug/ml)
操作步骤
1)在50ml离心管上标记管重，由病理取材，并标记实验动物编号及组织名称，组织 处理前称重，并记录之。
2)每个组织加入无菌PBS-tween805ml，用PRO250组织匀浆器最大速度60秒匀浆。
3)放置在冰上或4℃冰箱5分钟，使悬浮物沉降下来。
取原液0.5ml加入到4.5mlPBS液内，连续10倍稀释7个浓度，将原液储存在-30℃ 冰箱，为以后复查试验备用。
4)在处理下一个样本前对组织匀浆器进行洗涤，连续性通过用装有40-45mLPBS的 50mL管，然后用80％EtOH，最后再用PBS，最大速度约为5-10秒。
5)样本稀释：组织匀浆按照下述方法系列稀释：
0.5mL匀浆液加入至4.5mLPBS(10X稀释)
0.5mL10x稀释匀浆加入至4.5mLPBS(100X稀释)
0.5mL100x稀释匀浆加入至4.5mLPBS(1000X稀释)
0.5mL1000x稀释匀浆加入至4.5mLPBS(100000X稀释)
6)培养：
将100μl充分混匀的稀释匀浆加到7H11-OADC培养皿，做三块皿。
注意：一次性的移液管头要剪去1mm左右，这样开口更大，避免组织堵塞移液管。
每一接种的平板中加入10粒玻璃珠，将平板置于光滑的平面上，轻轻地旋转平板 至少10次，使样本均匀地分布于平板表面。把玻璃珠倒入废物筒内，标记平板的底部，立即 盖上平板。当接种完成后，将平板置入带拉链的塑料袋中，置于36±2℃培养箱，待观察到菌 落为止(≥1mm，通常为3-4周)。
结果：将得到的组织菌数取对数后(logCFU)，进行计算，结果如表4所示。
表4
结果说明：MVA856的单独使用，在结核攻毒时，对肺、脾产生明显的保护，对肺效果 显著优于BCG，对脾效果与BCG相当。rBCG+AD856+MVA856产生的肺保护力与BCG相当，但高于 rBCG。AD856+MVA856和MVA856+ADV856的两种病毒载体疫苗联合使用的加强策略(即B+A+M， B+M+A，rB+A+M，rB+M+A)能够显著提高BCG和rBCG原有的肺保护力。
实施例8ADV-Ag85B-TB10.4的制备
1.分子克隆，构建PDC-316-Ag85B-TB10.4穿梭质粒
1)EcoRI(NEBR0101M)酶切Teasy-Ag85B-TB10.4(按原理图及人密码子使用效 率，设计真核化Ag85B-TB10.4基因，委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成至Teasy 载体)，37℃反应2小时，胶回收试剂盒回收Ag85B-TB10.4片段。
2)EcoRI酶切PDC316载体(MicrobixBiosystemsInc：AdMaxAdenovirusVector CreationKits)，37℃反应2小时，胶回收试剂盒回收线性化PDC316载体。
3)将回收的片段和载体在4℃连接过夜，连接体系为：载体2μl，片段5μl，连接酶1μ l，缓冲液(10X)2μl，水10μl。，将连接产物转化大肠杆菌(TOP10)，经酶切筛选鉴定，得到 PDC-316-Ag85B-TB10.4穿梭质粒。
2.使用10％DMEM(Dulbecco’smodifiedEagle’smedium，Invitrogen)培养基传 代HEK293细胞(ATCCNumber：CRL-1573)，使其融合率达90％。
3.利用腺病毒AD5与(MicrobixBiosystemsInc：AdMaxAdenovirus VectorCreationKits)PDC-316-Ag85B-TB10.4在HEK293细胞中的同源重组(参见厂商的说 明书，使用AdMaxVectorCreationKit(MicrobixBiosystemsInc：AdMaxAdenovirus VectorCreationKits))，获得重组型ADV-Ag85B-TB10.4。
4.空斑筛选阳性克隆。
实验方案与实施例2的空斑筛选阳性克隆相同。
5.使用重组型ADV-Ag85B-TB10.4感染HEK293细胞，48h后收获将细胞悬液用移液 管转移至50-ml离心桶中，1200×g4℃离心10分钟。
6.弃上清，并加入1ml完全DMEM2.5培养基(含2.5％胎牛血清的DMEM(Dulbecco’s modifiedEagle’smedium，Invitrogen))中重悬震荡。
7.用液氮和37℃水浴冻融裂解细胞，震荡。反复3次。
8.于冰上超声1分钟，4000rpm离心30分钟，上清于-70℃保存。
9.取第8步上清，重复5-8，使病毒扩增。
10.收集足量待纯化病毒，细胞冻融后离心，4℃12000g×10min，取上清。
11.每20ml上清中加入10ml20％PEG8000(上海生物工程公司)/2.5MNaCl，混匀后 放在冰浴中1h。
12.离心，4℃12500g×30min，弃上清。
13.收集沉淀，溶于5ml1.1g/mlCsCl(北京鼎国生物技术有限责任公司)中。
14.制备不连续CsCl密度梯度：依次加入2ml1.4g/mlCsCl、3ml1.3g/mlCsCl、5ml 上清。
15.离心，4℃60000g×3h(对应Beckman离心机sw40，22000rpm)，吸出病毒带。
16.转入透析卡(PIERCE：Slide-A-DialysisCassette)，4℃透析过夜，换透析液(50mMMgCl210ml，甘油100ml，10×PBS100ml，加入双蒸水定容至1000ml)，分装保存于-80℃。
17.按照10-1的比例用透析液进行稀释，使用腺病毒特异抗体(Adenovirus Type5antibody(ab6982，Abcam))测定滴度，待用。
实施例9MVA-Ag85B-TB10.4的制备
1.分子克隆，构建Psc11-Ag85B-TB10.4穿梭质粒。
1)以ApaI(NEBR0114L)和PacI(NEBR0547L)酶切Teasy-Ag85B-TB10.4，37℃反应 2小时，胶回收试剂盒回收Ag85B-TB10.4片段。
2)ApaI和PacI酶切Psc11载体，37℃反应2小时，胶回收试剂盒回收线性化Psc11载 体。
3)将回收的片段和载体在4℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌(TOP10)，经酶 切筛选鉴定，得到Psc11-Ag85B-TB10.4穿梭质粒。
2.使用10％DMEM培养基传代BHKtk-细胞(ATCCNumber：CRL-1632tk-ts13)，使其 融合率达90％。
3.利用MVA与Psc11Ag85B-TB10.4在BHKtk-细胞中的同源重组(EarlPL，MossB， WyattLS，CarrollMW.Generationofrecombinantvaccinia viruses.CurrentProtocolsinMolecularBiology2001May；Chapter16：Unit16.17.)， 获得重组重组型MVA-Ag85B-TB10.4。
4.蓝白斑筛选阳性克隆。
实验方案与实施例3的蓝白斑筛选阳性克隆相同。
5.使用重组型MVA-Ag85B-TB10.4感染BHKtk-细胞，48h后收获将细胞悬液用移液 管转移至50-ml离心桶中，1200×g4℃离心10分钟。
6.弃上清，并加入1ml完全DMEM-2.5培养基中重悬震荡。
7.用液氮和37℃水浴冻融裂解细胞，震荡。反复3次。
8.于冰上超声1分钟，4000rpm离心30分钟，上清于-70℃保存。
9.取第8步上清，重复5-8，使病毒扩增。
10.收集足量待纯化病毒，细胞用10mmol/LTris-HCL重悬，冻融裂解细胞，震荡。 反复3次。
11.加入36％蔗糖至超离管一半体积形成垫层，加入相同体积病毒悬液。
12.30000g4℃离心60分钟。
13.弃上清，重悬病毒沉淀于1mmol/LTris-HCL，分装保存于-80℃。
14.按照10-1的比例进行稀释，使用痘病毒特异抗体(vacciniavirus polyclonalantibody(20-VR69，Fitzgerald))测定滴度，待用。
实施例10ADV-Ag85B-TB10.4和MVA-Ag85B-TB10.4联用的免疫方案
1.Balb/c雌鼠(吉林大学基础医学院动物实验中心.小鼠饲养条件：SPF级)6-8周 龄免疫方案如下：
第一次免疫(prime)rBCG皮下注射1×106CFU第1周
第二次免疫(boost1)ADV-Ag85B-TB10.4皮下注射1×107PFU第7周
第三次免疫(boost2)MVA-Ag85B-TB10.4皮下注射2×107PFU第9周
第10-11周处死小鼠，分离脾脏，以总脾细胞进行实验。
2.脾细胞处理方案：
处理方案及条件与实施例4中的脾细胞处理方案相同
3.IFN-rELISOPT实验：
实验方案与实施例4中的IFN-rELISOPT实验相同
结果：
表53×105细胞进行刺激36小时，产生斑点情况如下
刺激物 斑点数 Ag85B-TB10.4融合蛋白 396±42 Ag85B 334±22 TB10.4 387±83 空白对照(无抗原) 16±6
结果显示，经过此方案免疫后，产生了针对Ag85B和TB10.4的分泌IFN-γ的细胞， 这意味着此方案的细胞免疫强度及免疫原性较好，对结核保护力将起到作用。
实施例11ADV-Ag85B-ESAT6-TB10.4的制备
1.分子克隆，构建PDC-316-Ag85B-ESAT6-TB10.4穿梭质粒。
1)EcoRI(NEBR0101M)酶切Teasy-Ag85B-ESAT6-TB10.4(按原理图及人密码子使 用效率，设计真核化Ag85B-ESAT6-TB10.4基因，委托上海生工生物工程技术服务有限公司 合成至Teasy载体)，37℃反应2小时，胶回收试剂盒回收Ag85B-ESAT6-TB10.4片段。
2)EcoRI酶切PDC316(MicrobixBiosystemsInc：AdMaxAdenovirus VectorCreationKits)载体，37℃反应2小时，胶回收试剂盒回收线性化PDC316载体。
3)将回收的片段和载体在4℃连接过夜，连接体系为：载体2μl，片段5μl，连接酶1μ l，缓冲液(10X)2μl，水10μl。将连接产物转化大肠杆菌(TOP10)，经酶切筛选鉴定，得到PDC- 316-Ag85B-ESAT6-TB10.4穿梭质粒。
2.使用10％DMEM(Dulbecco’smodifiedEagle’smedium，Invitrogen)培养基传 代HEK293细胞(ATCCNumber：CRL-1573)，使其融合率达90％。
3.利用腺病毒AD5(MicrobixBiosystemsInc：AdMaxAdenovirus VectorCreationKits)与PDC-316-Ag85B-ESAT6-TB10.4在HEK293细胞中的同源重组(参见 厂商的说明书，使用AdMaxVectorCreationKit(MicrobixBiosystemsInc： AdMaxAdenovirusVectorCreationKits))，获得重组型ADV-Ag85B-ESAT6-TB10.4。
4.空斑筛选阳性克隆。
实验方案与实施例2的空斑筛选阳性克隆相同。
5.使用重组型ADV-Ag85B-ESAT6-TB10.4感染HEK293细胞，48h后收获将细胞悬液 用移液管转移至50-ml离心桶中，1200×g4℃离心10分钟。
6.弃上清，并加入1ml完全DMEM2.5培养基(含2.5％胎牛血清的DMEM(Dulbecco’s modifiedEagle’smedium，Invitrogen))中重悬震荡。
7.用液氮和37℃水浴冻融裂解细胞，震荡。反复3次。
8.于冰上超声1分钟，4000rpm离心30分钟，上清于-70℃保存。
9.取第8步上清，重复5-8，使病毒扩增。
10.收集足量待纯化病毒，细胞冻融后离心，4℃12000g×10min，取上清。
11.每20ml上清中加入10ml20％PEG8000(上海生物工程公司)/2.5MNaCl，混匀后 放在冰浴中1h。
12.离心，4℃12500g×30min，弃上清。
13.收集沉淀，溶于5ml1.1g/mlCsCl(北京鼎国生物技术有限责任公司)中。
14.制备不连续CsCl密度梯度：依次加入2ml1.4g/mlCsCl、3ml1.3g/mlCsCl、5ml 上清。
15.离心，4℃60000g×3h(对应Beckman离心机sw40，22000rpm)，吸出病毒带。
16.转入透析卡(PIERCE：Slide-A-DialysisCassette)，4℃透析过夜，换透析液(50mMMgCl210ml，甘油100ml，10×PBS100ml，加入双蒸水定容至1000ml)，分装保存于-80℃。
17.按照10-1的比例用透析液进行稀释，使用腺病毒特异抗体(Adenovirus Type5antibody(ab6982，Abcam))测定滴度，待用。
实施例12MVA-Ag85B-ESAT6-TB10.4的制备
1.分子克隆，构建Psc11-Ag85B-ESAT6-TB10.4穿梭质粒。
1)以ApaI(NEBR0114L)和PacI(NEBR0547L)酶切Teasy-Ag85B-ESAT6-TB10.4，37 ℃反应2小时，胶回收试剂盒回收Ag85B-ESAT6-TB10.4片段。
2)ApaI和PacI酶切Psc11载体，37℃反应2小时，胶回收试剂盒回收线性化Psc11载 体。
3)将回收的片段和载体在4℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌(TOP10)，经酶 切筛选鉴定，得到Psc11-Ag85B-ESAT6-TB10.4穿梭质粒。
2.使用10％DMEM培养基传代BHKtk-细胞(ATCCNumber：CRL-1632tk-ts13)，使其 融合率达90％。
3.利用MVA与Psc11-Ag85B-ESAT6-TB10.4在BHKtk-细胞中的同源重组(EarlPL， MossB，WyattLS，CarrollMW.Generationofrecombinantvacciniaviruses.Current ProtocolsinMolecularBiology2001May；Chapter16：Unit16.17.)，获得重组重组型 MVA-Ag85B-ESAT6-TB10.4。
4.蓝白斑筛选阳性克隆。
实验方案与实施例3的蓝白斑筛选阳性克隆相同。
5.使用重组型MVA-Ag85B-ESAT6-TB10.4感染BHKtk-细胞，48h后收获将细胞悬液 用移液管转移至50-ml离心桶中，1200×g4℃离心10分钟。
6.弃上清，并加入1ml完全DMEM-2.5培养基中重悬震荡。
7.用液氮和37℃水浴冻融裂解细胞，震荡。反复3次。
8.于冰上超声1分钟，4000rpm离心30分钟，上清于-70℃保存。
9.取第8步上清，重复5-8，使病毒扩增。
10.收集足量待纯化病毒，细胞用10mmol/LTris-HCL重悬，冻融裂解细胞，震荡。 反复3次。
11.加入36％蔗糖至超离管一半体积形成垫层，加入相同体积病毒悬液。
12.30000g4℃离心60分钟。
13.弃上清，重悬病毒沉淀于1mmol/LTris-HCL，分装保存于-80℃。
14.按照10-1的比例进行稀释，使用痘病毒特异抗体(vacciniavirus polyclonalantibody(20-VR69，Fitzgerald))测定滴度，待用。
实施例13ADV-Ag85B-ESAT6-TB10.4和MVA-Ag85B-ESAT6-TB10.4联用的免疫方案
1.Balb/c雌鼠(吉林大学基础医学院动物实验中心.小鼠饲养条件：SPF级)6-8周 龄免疫方案如下：
第一次免疫(prime)rBCG皮下注射1×106CFU第1周
第二次免疫(boost1)ADV-Ag85B-ESAT6-TB10.4皮下注射1×107PFU第7周
第三次免疫(boost2)MVA-Ag85B-ESAT6-TB10.4皮下注射2×107PFU第9周
第10-11周处死小鼠，分离脾脏，以总脾细胞进行实验。
2.脾细胞处理方案：
处理方案及条件与实施例4中的脾细胞处理方案相同
3.IFN-rELISOPT实验：
实验方案与实施例4中的IFN-rELISOPT实验相同
结果：
表613×105细胞进行刺激36小时，产生斑点情况如下
刺激物 斑点数 Ag85B-ESAT6-TB10.4融合蛋白 469±88 Ag85B 324±35 ESAT-6 73±15 TB10.4 327±53 空白对照(无抗原) 19±5
结果显示，经过此方案免疫后，产生了针对Ag85B和ESAT-6和TB10.4的分泌IFN-γ 的细胞，这意味着此方案的细胞免疫强度及免疫原性较好，且综合了多种抗原，作用更广 泛，对结核保护力将起到作用。
实施例14Ag85B-ESAT6蛋白的制备
1.原核Ag85B-ESAT6目的基因获得
委托上海生工公司合成原核Ag85B-ESAT6表达序列(SEQIDNO：5)至克隆载体pGEM-T-easy(-TEasyVectorSystems，Promega)。
2.目的基因和表达载体连接
将测序正确的pGEM-T-easy-Ag85B-ESAT6质粒用NdeI和XhoI双酶切胶回收目的基 因后，将Ag85B-ESAT6与pET-20b(NovagenpETsystem)质粒用NdeI和XhoI双酶切胶回收的 片断进行连接。酶切体系为：质粒1Pg(1μl)，NdeI(0.5μl)，XhoI(0.5μl)，缓冲液10X(2μl)， H2O16μl.37度反应2个小时。连接体系为：在10μl的反应体系，将目的基因Ag85B-ESAT6和 载体pET-20b按1∶1混合反应，得到pET-20b-Ag85B-ESAT6质粒，反应条件为：4.0℃下反应 16h。
3.重组表达菌的获得及诱导表达重组蛋白Ag85B-ESAT6
将步骤2的连接产物转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)plysS(来源：Novagen公 司)。在氨苄青霉素抗性平板上培养，挑取阳性克隆，加入5mlLB[LB液体培养基：1L去离子 水中含：蛋白胨(tryptone)10g，酵母提取物(yeastextract)5g，NaCl10g。121℃湿热灭菌 20min]培养液，在37℃下以200rpm振荡培养过夜，第二天以1∶100转接到1L培养液中，37℃， 200rpm培养至OD600约为0.6-0.8(约在2.5小时)，加入IPTG至终浓度为1mM，继续培养5小 时，将菌液以6000rpm在4℃下离心10min收集菌体。
4.收获Ag85B-ESAT6蛋白
将收集到的菌体沉淀加入10ml超声破碎缓冲液(50mMTris-Cl，1mMEDTA，100mM NaCl，pH8.0)，在冰上进行超声破碎。超声破碎仪(美国Sonics公司)工作参数：(750W， 20KHz，40％)工作6s，间歇6s，超声5min，停2min，共4次。以12000rpm于4℃下离心20min，将 沉淀用8M尿素溶解，以0.45微米膜过滤，获得待上柱样品，用于下一步进行亲和层析纯化。
5.Ag85B-ESAT6蛋白亲和层析纯化蛋白的过程如下(Invitrogen公司Ni- NTAPurificationSystemPurification试剂盒)：
取2ml柱料加入纯化柱中，平稳后的柱料体积为柱体积。然后向层析柱中加入5倍 柱体积的无菌去离子水，并且加入5倍柱体积的1XChargeBuffer。接下来，向层析柱中加 入5倍柱体积的1XBindingBuffer(含8M尿素)。
将样品处理后上样，控制流速约5min/柱体积。然后向层析柱中加入5倍柱体积的 1XBindingBuffer(含8M尿素)。接下来向层析柱中加入5倍柱体积的1XWashingBuffer1 (含8M尿素)，然后向层析柱中加入5倍柱体积的1XWashingBuffer2(含8M尿素)。最后向层 析柱中加入5倍柱体积的1XEluteBuffer(含8M尿素)，并且以每管1ml的量接样，至此获得 变性的目的蛋白Ag85B-ESAT6。
向层析柱中加入5倍柱体积的1XStripBuffer(或含8M尿素)。然后向层析柱中加 入5倍柱体积的无菌去离子水，最后层析柱中加入20％乙醇并于4℃下保存。
5.变性的Ag85B-ESAT6蛋白复性
将步骤4中收集纯化的变性蛋白样品以[1XEluteBuffer(含8M尿素)]稀释为 0.1-mg/mL，装入透析袋中，每8h更换一次复性液(共3次)(复性液：50mMTris-Cl、pH8.0、 0.5mMEDTA、50mMNaCl、10％甘油、1％甘氨酸)透析完成后将蛋白样品以12000rpm4℃离 心，取上清进行超滤浓缩[使用截流分子量为10KD的截流离心柱(MILLIPORE公司)，5000rpm 4℃离心浓缩至5％体积]。
至此得到的Ag85B-ESAT6蛋白可进行各实施例的免疫实验。
实施例15Ag85B-ESAT6蛋白与ADV856联用的免疫方案
Ag85B-ESAT6蛋白溶液的制备：MPL用含0.2％三乙胺的无菌水溶解，加入DDA，70度 水浴30秒，超声30秒，重复2次，加入Ag85B-ESAT6蛋白混匀。最终剂量为每只鼠接受为0.2ml 含50μgAg85B-ESAT6蛋白，25μgMPL，250μgDDA。
1.Balb/c雌鼠(吉林大学基础医学院动物实验中心.小鼠饲养条件：SPF级)6-8周 龄免疫方案如下：
第一次免疫(prime)rBCG皮下注射1×106CFU第1周
第二次免疫(boost1)ADV856皮下注射1×107PFU第7周
第三次免疫(boost2)Ag85B-ESAT6蛋白(含佐剂，佐剂为MPL+DDA，)皮下注射第9 周
第10-11周处死小鼠，分离脾脏，以总脾细胞进行实验。
2.脾细胞处理方案：
处理方案及条件与实施例4中的脾细胞处理方案相同
3.IFN-rELISOPT实验：
实验方案与实施例4中的IFN-rELISOPT实验相同
结果：
表713×105细胞进行刺激36小时，产生斑点情况如下
刺激物 斑点数 Ag85B-ESAT6融合蛋白 782±103 Ag85B 536±55 ESAT-6 156±27 TB10.4 227±36 空白对照(无抗原) 19±5
结果显示，经过此方案免疫后，产生了针对Ag85B和ESAT-6的分泌IFN-γ的细胞， 这意味着此方案的细胞免疫强度及免疫原性较好，且综合了多种抗原，作用更广泛，对结核 保护力将起到作用。
实施例16Ag85B-ESAT6蛋白与MVA856联用的免疫方案
Ag85B-ESAT6蛋白溶液的制备：与实施例15中的Ag85B-ESAT6蛋白溶液的制备步骤 相同。
1.Balb/c雌鼠(吉林大学基础医学院动物实验中心.小鼠饲养条件：SPF级)6-8周 龄免疫方案如下：
第一次免疫(prime)rBCG皮下注射1×106CFU第1周
第二次免疫(boost1)MVA856皮下注射2×107PFU第7周
第三次免疫(boost2)Ag85B-ESAT6蛋白(含佐剂，佐剂为MPL+DDA，)皮下注射第9 周
第10-11周处死小鼠，分离脾脏，以总脾细胞进行实验。
2.脾细胞处理方案：
处理方案及条件与实施例4中的脾细胞处理方案相同
3.IFN-rELISOPT实验：
实验方案与实施例4中的IFN-rELISOPT实验相同
结果：
表813×105细胞进行刺激36小时，产生斑点情况如下
刺激物 斑点数 Ag85B-ESAT6融合蛋白 698±93 Ag85B 486±45 ESAT-6 177±32 TB10.4 209±28 空白对照(无抗原) 24±7
结果显示，经过此方案免疫后，产生了针对Ag85B和ESAT-6的分泌IFN-γ的细胞， 这意味着此方案的细胞免疫强度及免疫原性较好，且综合了多种抗原，作用更广泛，对结核 保护力将起到作用。
对于本领域技术人员显而易见的是，在不背离本发明的范围和精神的前提下，可 对其进行各种修改和变动，上述各项技术特征之间的组合及根据上述内容所完成的其它技 术方案改变均属本发明范围。