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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710448603.1 (22)申请日 2017.06.14 (71)申请人 湖南省农业生物技术研究中心 地址 410000 湖南省长沙市芙蓉区远大二 路892号省农科院实验大楼三楼 申请人 中南大学 (72)发明人 柏连阳刘宏伟蒋慧丹尹华群 刘学端梁伊丽秦崇 (74)专利代理机构 长沙市融智专利事务所 43114 代理人 袁靖 (51)Int.Cl. C09K 17/14(2006.01) B09C 1/10(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12。
2、N 1/16(2006.01) C12R 1/01(2006.01) C12R 1/72(2006.01) C12R 1/02(2006.01) C12R 1/645(2006.01) C12R 1/385(2006.01) C09K 101/00(2006.01) (54)发明名称 一种能原位转化治理镉污染耕地的微生物 菌剂的施用方法 (57)摘要 本发明涉及微生物修复镉污染领域， 公开了 一种能原位转化镉污染耕地的微生物菌剂的高 效施用方法， 所述微生物菌剂包括： 隐性嗜酸杆 菌、 皱褶假丝酵母、 固氮醋酸杆菌、 粘红酵母菌和 铜绿假单胞菌。 将微生物菌剂扩培使其菌浓达到 1109个/mL。
3、以上， 采用少量多次多点的方法直 接喷洒到镉污染耕地土壤表面， 平均每平方米土 地加1420L的菌液量， 翻耕使土壤和修复菌剂 充分混匀， 翻耕深度2535cm。 本发明生物菌剂 的施用技术方法适用范围广， 且菌液可反复利 用， 处理量大， 操作简单， 成本低， 可将微生物菌 剂的转化效率提高至50以上， 在重金属污染土 壤修复领域具有广阔的应用前景。 权利要求书1页 说明书3页 CN 107099298 A 2017.08.29 CN 107099298 A 1.一种能原位转化镉污染耕地的微生物菌剂的施用方法， 其特征在于， 将所述的微生 物 菌 剂 施 加 到 镉 污 染 土 壤 中 处 。
4、理 ； 所 述 微 生 物 菌 剂 包 括 ： 隐 性 嗜 酸 杆 菌 (Acidiphiliumcryptum) 、 皱褶假丝酵母(Candida rugosa) 、 固氮醋酸杆菌 (Acetobacterdiazotrophicus)、 粘红酵母菌(Rhodotorulaglutinis)和铜绿假单胞菌 (Pseudomonasaeruginosa)。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 微生物菌剂中各种微生物的按照以下数量 比例： 隐性嗜酸杆菌(Acidiphiliumcryptum)15-20、 皱褶假丝酵母(Candida rugosa)15- 20、 固氮醋酸杆菌(Ace。
5、tobacterdiazotrophicus)20-25、 粘红酵母菌25-30 (Rhodotorulaglutinis)和铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)10-15混合后扩培。 3.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于： 所述微生物菌剂扩培的基本培养基为： (NH4)2SO4， 0.3g/L； KCl， 0.01g/L； K2HPO4， 0.05g/L； MgSO47H2O， 0.05g/L和Ca(NO3)2， 0.001g/L， 加入葡萄糖1.5-2.5g/L； 酵母粉0.01-0.05g/L； 硫粉0.01-0.05g/L。 4.根据权利要求2所述的方法， 。
6、其特征在于： 所述微生物菌剂的扩培方法为： 初始菌液 浓度为1106个/mL以下， 接种量为1020(v/v)， 在1630条件下曝气培养， 曝气量 为0.160.20m3/min； 当微生物菌剂代谢产生有机酸的菌液pH值为3.04.5时， 其菌浓达 到11091010个/mL即可。 5.根据权利要求1-4任一项所述的方法， 其特征在于， 包括有如下步骤： A、 采用少量多次多点的方法代替多量一次单点将所述的微生物菌剂施加到镉污染土 壤； B、 翻耕使土壤和微生物菌剂充分混匀。 C、 经过自然沉降， 将上层菌液排除， 经过吸附材料处理后重复利用。 6.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于： 。
7、步骤A所述微生物菌剂的施加方法为： 喷洒 菌液使平均每平方米土地达到710L的菌液量， 采用翻耕机搅拌混匀并保持混匀状态2个 小时， 继续喷洒至平均每平方米土地最终达到1420L的菌液量。 7.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于： 步骤B翻耕使土壤和微生物菌剂充分混匀， 翻耕深度为2535cm。 8.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于： 步骤C翻耕结束后， 经过自然沉降至菌液与 土壤明显分隔后， 将上层菌液排除， 经过吸附材料处理后可重复利用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107099298 A 2 一种能原位转化治理镉污染耕地的微生物菌剂的施用方法 技术领域 0001 本发明涉。
8、及微生物修复镉污染领域， 尤其是一种能原位转化镉污染耕地的微生物 菌剂的高效施用方法。 背景技术 0002 土壤作为生态圈的重要组成部分， 是人类赖以生存的最基本物质基础之一， 同时 又是各种污染物的主要藏纳地。 在我国， 随着工农生产和乡村城市化的建设， 土壤污染迅速 蔓延， 污染程度也逐渐加剧。 0003 土壤污染， 特别是重金属在粮食、 蔬菜中的积累， 将处于食物链顶端的人类至于危 险之地。 近年来镉污染尤其严重， 在我国由镉引起的土壤污染问题已有较多报道。 在上世纪 80年代中期对南方某省镉污染水灌溉导致的污染地区所做的研究表明， 大米镉含量超标率 为71.69， 肉禽蛋类未超限量。 。
9、土壤镉含量的增加会使土壤中细菌、 固氮菌的数量明显减 少， 会破坏植物体中的叶绿素， 减少根系对水分和养分的吸收， 抑制根系对氮的固定和硝酸 还原酶活性。 镉通过食物链进入人体后， 与人体内的特定蛋白质及各种酶发生强烈反应使 它们失去活性， 并在人体某些器官中积蓄起来造成慢性中毒， 同时还干扰铜， 钴， 锌在体内 的正常代谢， 诱发各种疾病， 甚至死亡。 0004 修复镉污染十壤生态， 一直是环境科学生态修复孜孜不倦追求解决的课题。 除了 把镉污染土壤异位提取外， 我们认为采用微生物菌剂修复镉污染土壤生态是最科学、 最直 接的途径。 微生物修复是利用能够吸附、 氧化重金属(改变金属的价态)的同。
10、时可以降解难 降解有机物的微生物， 来减少重金属的迁移， 增加有机结合态， 减少重金属被植物吸收转化 进而进入食物链的生态风险。 0005 微生物菌剂修复镉污染的土壤生态环境具有无污染、 方法简便、 成本低的优点。 但 是微生物菌剂的效果不显著， 利用率低， 资源浪费严重， 应用比较少， 缺少科学的施加方法， 高效的工业化应用还无法实现。 因此， 寻找一种能原位转化治理镉污染耕地的微生物菌剂 的高效施用方法势在必行。 发明内容 0006 本发明所需要解决的问题是提供一种能原位转化治理镉污染耕地的微生物菌剂 的高效施用方法， 它在提高镉形态的转化效率的同时， 具有广泛的适用范围， 并能提高处理 。
11、量。 0007 为了解决上述技术问题， 本发明所采用的技术方案如下: 0008 一种能原位转化镉污染耕地的微生物菌剂的施用方法， 将所述的微生物菌剂施加 到镉污染土壤中处理； 所述微生物菌剂包括： 隐性嗜酸杆菌(Acidiphiliumcryptum)、 皱褶 假丝酵母(Candida rugosa)、 固氮醋酸杆菌(Acetobacterdiazotrophicus)、 粘红酵母菌 (Rhodotorulaglutinis)和铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。 0009 作为进一步的改进， 微生物菌剂中各种微生物的按照以下数量比例： 隐性嗜酸杆 说明书 1/3 页 。
12、3 CN 107099298 A 3 菌(Acidiphiliumcryptum)15-20、 皱褶假丝酵母(Candida rugosa)15-20、 固氮醋酸杆 菌(Acetobacterdiazotrophicus)20-25、 粘红酵母菌25-30(Rhodotorulaglutinis)和 铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)10-15混合后扩培。 0010 所述微生物菌剂扩培的基本培养基为： (NH4)2SO4， 0.3g/L； KCl， 0.01g/L； K2HPO4， 0.05g/L； MgSO47H2O， 0.05g/L和Ca(NO3)2， 0.001g。
13、/L， 加入葡萄糖1.52g/L； 酵母粉0.05 0.1g/L； 硫粉0.010.02g/L。 0011 所述微生物菌剂的扩培方法为： 初始菌液浓度为1106个/mL以下， 接种量为10 20(v/v)， 在1630条件下曝气培养， 曝气量为0.160.20m3/min； 当微生物菌剂代 谢产生有机酸的菌液pH值为3.04.5时， 使其菌浓达到11091010个/mL即可。 0012 所述的能原位转化镉污染耕地的微生物菌剂的施用方法， 具体包括有如下步骤： 0013 A、 采用少量多次多点的方法代替多量一次单点将所述的微生物菌剂施加到镉污 染土壤； 0014 B、 翻耕使土壤和微生物菌剂充分。
14、混匀。 0015 C、 经过自然沉降， 将上层菌液排除， 经过吸附材料处理后重复利用。 0016 步骤A所述微生物菌剂的施加方法为： (平均每亩地取5个位置， 确定对角线的中点 作为中心抽样点， 再在对角线上选择四个与中心样点距离相等的点作为样点同时喷洒菌 液)， 喷洒菌液使平均每平方米土地达到710L的菌液量， 采用翻耕机搅拌混匀并保持混匀 状态2个小时， 继续喷洒至平均每平方米土地最终达到1420L的菌液量。 0017 步骤B翻耕使土壤和微生物菌剂充分混匀， 翻耕深度为2535cm。 0018 步骤C翻耕结束后， 经过自然沉降至菌液与土壤明显分隔后， 将上层菌液排除， 经 过吸附材料处理后。
15、可重复利用。 0019 本发明的有益效果 0020 本发明适用于原位治理镉污染土壤， 采用的微生物修复剂适用范围广， 处理量大， 操作简单， 成本低， 不仅避免了资源浪费， 而且还可以大幅度的提高镉形态的转化效率， 高 效解决耕地镉污染问题。 0021 此外， 本发明针对污染土壤中镉形态的微生物转化机理及微生物生理生化特征， 首次采用隐性嗜酸杆菌(Acidiphilium cryptum)、 皱褶假丝酵母菌(Candida rugosa)、 固 氮醋酸杆菌(Acetobacter diazotrophicus)、 粘红酵母菌(Rhodotorula glutinis)和铜绿 假单胞菌(Pseu。
16、domonas aeruginosa)的结合扩培用于处理土壤中的镉， 各菌种之间不会产 生拮抗， 复配在一起能很好的共生， 能高效协同转化土壤中的镉。 而且本发明复合菌剂生长 速度快， 产酸能力强， 仅仅培养2天， 扩培微生物富集物的菌液pH值达到3.0， 微生物菌体密 度达到3.0109个/mL以上， 有很好的应用前景。 具体实施方式 0022 以下通过实施例对本发明作进一步阐述， 但不作为对本发明的限定。 0023 实施例1 0024 隐性嗜酸杆菌(Acidiphiliumcryptum)ATCC33463、 皱褶假丝酵母(Candida rugosa)CCTCC AY 93026、 固氮。
17、醋酸杆菌(Acetobacterdiazotrophicus)CGMCC No.5455、 粘 红酵母菌(Rhodotorulaglutinis)ATCC96365和铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa) 说明书 2/3 页 4 CN 107099298 A 4 CCTCC AB 2013184以数量比例为15、 20、 25、 30、 10混合后扩培， 微生物菌剂的基 本盐培养基成分包括： (NH4)2SO4， 0.3g/L； KCl， 0.01g/L； K2HPO4， 0.05g/L； MgSO47H2O， 0.05g/L和Ca(NO3)2， 0.001g/L。 此外，。
18、 加入葡萄糖， 2g/L； 酵母粉0.01g/L； 硫粉0.01g/L； 0025 微生物菌剂的扩培方法为： 初始菌液浓度为1106个/mL， 接种量为1020 (v/v)， 在1630条件下曝气培养， 曝气量为0.16m3/min； 0026 实验一其施用方法包括如下步骤： 0027 A、 当微生物菌剂代谢产生有机酸的菌液pH值为3.5时， 菌浓到3109个/mL时。 0028 B、 按平均每平方米土地710L的菌液量， 用5个点(采用5点取样法)将菌液喷洒至 镉污染土壤的表面； 使用土地翻耕设备对土壤和菌液进行充分搅拌混匀1.5个小时， 用同样 的方法继续喷洒菌液至平均每平方米土地18L的。
19、菌液量,继续混匀2小时即可。 0029 实验二其施用方法包括如下步骤： 0030 A、 当微生物菌剂代谢产生有机酸的菌液pH值为4时， 菌浓到3109个/mL时。 0031 B、 按平均每平方米土地710L的菌液量， 用5个点(采用5点取样法)将菌液喷洒至 镉污染土壤的表面； 使用土地翻耕设备对土壤和菌液进行充分搅拌混匀1.5个小时， 用同样 的方法继续喷洒菌液至平均每平方米土地18L的菌液量,继续混匀2小时即可。 0032 实验三其施用方法包括如下步骤： 0033 A、 当微生物菌剂代谢产生有机酸的菌液pH值为3.5时， 菌浓到3109个/mL时。 0034 B、 按平均每平方米土地710L。
20、的菌液量， 用1个点将菌液喷洒至镉污染土壤的表 面； 使用土地翻耕设备对土壤和菌液进行充分搅拌混匀1.5个小时， 用同样的方法继续喷洒 菌液至按平均每平方米土地18L的菌液量,继续混匀2小时即可. 0035 实验四其施用方法包括如下步骤： 0036 A、 当微生物菌剂代谢产生有机酸的菌液pH值为3.5时， 菌浓到3109个/mL时。 0037 B、 按平均每平方米土地18L的菌液量用5个点将菌液喷洒至镉污染土壤的表面； 使 用土地翻耕设备对土壤和菌液进行充分搅拌混匀3.5个小时。 0038 实验组土壤镉转化效率 实验一50.6 实验二30.1 实验三42.6 实验四40.3 0039 实验一土壤镉的转化效率为50.6为最高。 说明书 3/3 页 5 CN 107099298 A 5 。